本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及鑒定復(fù)方感冒藥中降解產(chǎn)物的方法。

背景技術(shù)：

雜質(zhì)研究與控制是藥品質(zhì)量控制的核心內(nèi)容之一，藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)往往與產(chǎn)品中的雜質(zhì)有關(guān)，因此雜質(zhì)研究及控制是藥品安全保證的關(guān)鍵要素，也是藥品研發(fā)中風(fēng)險(xiǎn)控制意識(shí)的重要體現(xiàn)。通過(guò)藥物的強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)，利用液質(zhì)技術(shù)對(duì)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，推測(cè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并對(duì)可能的來(lái)源進(jìn)行分析，為藥物的雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提供重要參考。

目前，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry,LC/MS)因其卓越的靈敏度、高選擇性和快速的特點(diǎn)已成為藥品有關(guān)物質(zhì)分析的首選技術(shù)。對(duì)于成分復(fù)雜的藥物，使用LC/MS技術(shù)可以不經(jīng)分離和純化步驟即可獲得樣品的色譜和質(zhì)譜信息。多級(jí)質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，能夠在線獲得豐富的化合物片段信息和分子組成信息，為藥物中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供了快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

然而在各國(guó)藥典中，有很多藥品的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)下使用的是離子對(duì)試劑、磷酸鹽緩沖試劑等不揮發(fā)性的緩沖鹽。雖然磷酸鹽及離子對(duì)試劑會(huì)對(duì)雜質(zhì)的保留以及峰形有很好的作用，但對(duì)化合物的鑒定帶來(lái)了困難。LC/MS是雜質(zhì)鑒定最常用的方法，如果流動(dòng)相中使用了不揮發(fā)性的鹽類，如磷酸鹽、離子對(duì)試劑等，會(huì)極大降低質(zhì)譜的靈敏度，污染質(zhì)譜。所以，將這類流動(dòng)相統(tǒng)稱為質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相。中心切割技術(shù)，可有效解決在使用質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相時(shí)鑒定雜質(zhì)的問(wèn)題。即在一維體系中，使用質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相對(duì)化合物進(jìn)行分離，在二維體系中使用質(zhì)譜兼容型流動(dòng)相連接質(zhì)譜檢測(cè)器。通過(guò)軟件控制閥切換，使一維體系中感興趣的組分切入二維體系中，再進(jìn)行雜質(zhì)鑒定。

復(fù)方感冒藥-布洛腎素那敏片(Advil Allergy and Congestion Relief Tablet)是由惠氏公司開(kāi)發(fā)的新復(fù)方制劑，其含主藥成分布洛芬、鹽酸去氧腎上腺素 以及馬來(lái)酸氯苯那敏，2011年末首次在美國(guó)獲批上市，暫未在國(guó)內(nèi)上市銷售。本品可迅速緩解普通感冒、上呼吸道過(guò)敏引起的相關(guān)癥狀。目前，對(duì)此復(fù)方制劑并沒(méi)有公開(kāi)的雜質(zhì)檢測(cè)方法，我們結(jié)合三個(gè)藥物的性質(zhì)及強(qiáng)制降解試驗(yàn)中雜質(zhì)的分離情況，開(kāi)發(fā)了適用于這三種藥物雜質(zhì)檢測(cè)的液相分離分析方法。然而，此種方法中需要加入磷酸鹽、三乙胺等質(zhì)譜不兼容性緩沖鹽從而保證獲得較高的分離度以及保持較好的峰形，這對(duì)于雜質(zhì)的定性檢測(cè)則產(chǎn)生了極大的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決利用液質(zhì)對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行鑒定時(shí)使用非揮發(fā)性緩沖鹽體系流動(dòng)相對(duì)其造成的污染和干擾的難題，涉及一種基于二維中心切割技術(shù)鑒定復(fù)方感冒藥中降解產(chǎn)物的高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種基于二維中心切割技術(shù)鑒定復(fù)方感冒藥中降解產(chǎn)物的高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括步驟：

在第一維色譜中使用質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行分離；

通過(guò)一維檢測(cè)器采集紫外數(shù)據(jù)，確定目標(biāo)峰，進(jìn)行中心切割，使目標(biāo)峰存于定量環(huán)中；

二維體系使用質(zhì)譜兼容性流動(dòng)相，通過(guò)閥切換將目標(biāo)峰反沖至二維體系中，進(jìn)入二維紫外及質(zhì)譜檢測(cè)器中完成雜質(zhì)分析和鑒定。

優(yōu)選地，本發(fā)明方法包括下述具體步驟：

1)樣品的制備：復(fù)方感冒藥經(jīng)過(guò)氧化破壞處理：

a.布洛芬氧化樣品的制備：取復(fù)方感冒藥適量(約相當(dāng)于布洛芬200mg)，加乙腈10ml，超聲使溶解，過(guò)濾，加30％過(guò)氧化氫10ml，置80℃水浴1小時(shí)，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，定容，搖勻，濾過(guò)，待進(jìn)樣。

b.鹽酸去氧腎上腺素及馬來(lái)酸氯苯那敏氧化樣品的制備：取復(fù)方感冒藥適量(約相當(dāng)于鹽酸去氧腎上腺素10mg及馬來(lái)酸氯苯那敏4mg)，加20％乙腈-水溶劑10ml，超聲使溶解，搖勻加30％的過(guò)氧化氫5ml，置80℃水浴30分鐘，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，定容，搖勻，過(guò)濾，待進(jìn)樣。

2)一維高效液相色譜檢測(cè)：將步驟1)制備的氧化破壞樣品分別進(jìn)樣， 在泵I的驅(qū)動(dòng)下，樣品通過(guò)第一維色譜柱進(jìn)行分離，并通過(guò)檢測(cè)器I，觀察流出組分的特征，選定目標(biāo)組分；

3)捕集目標(biāo)峰：通過(guò)閥切換，將一維色譜圖中目標(biāo)峰切出，捕集至切換閥定量環(huán)中；

4)二維高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)：進(jìn)行閥切換，在泵II的驅(qū)動(dòng)下，將定量環(huán)中的目標(biāo)物通過(guò)二維質(zhì)譜兼容性流動(dòng)相反沖至二維色譜柱中，采用梯度洗脫方式進(jìn)行脫鹽，脫鹽時(shí)流路通過(guò)檢測(cè)器II進(jìn)廢液。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間脫鹽后，再將流路從廢液切換進(jìn)質(zhì)譜，采集目標(biāo)物的紫外及質(zhì)譜數(shù)據(jù)；

5)質(zhì)譜檢測(cè)以ESI為離子源，電離模式為正離子模式以及選擇AutoMS/MS功能同時(shí)獲取目標(biāo)物的一級(jí)以及二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)而借助儀器自帶MSC軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)和鑒定。

上述方法中，中心切割一維液相色譜質(zhì)譜分析條件為：

a.布洛芬一維色譜測(cè)定條件為：

高效液相色譜：HPLC，Agilent 1260；

色譜柱：Waters BEH C18 3.5um 4.6*150mm；

梯度洗脫條件：

流動(dòng)相A：0.02mol/L磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(83.5：16.5)；

流動(dòng)相B：0.02mol/L磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(16.5：83.5)；

線性梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

流速：1.4ml/分鐘；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：20ul。

b.馬來(lái)酸氯苯那敏及鹽酸去氧腎上腺素一維色譜測(cè)定條件為：

高效液相色譜：HPLC，Agilent 1260；

色譜柱：Waters spherisorb 5um SCX,4.6*150mm；

流動(dòng)相A：0.075mol/L磷酸氫二鈉(含0.1％三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.4)；

流動(dòng)相B:乙腈；

線性梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；

流速：1.0ml/分鐘；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：20ul。

c.二維高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜條件為：

超高效液相色譜：UHPLC,Agilent 1290；

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 1.8um,2.1*50mm；

流動(dòng)相A:加入甲酸的水；B：加入甲酸的乙腈；

流動(dòng)相梯度：

T₁及T₂根據(jù)需要設(shè)定；

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；

流速：0.3ml/分鐘；

柱溫：35℃；

質(zhì)譜儀：Q-TOF G6540B Agilent；

離子源：ESI+電離源；

噴霧電壓：3.5～4kV，

霧化器流量：11L/min，

去溶劑氣溫度：350℃，

離子源氣壓：45psi，

驅(qū)簇電壓：120V，

碰撞能量：35±15ev，

MS掃描范圍：100-1000m/z，

MS/MS掃描范圍：50-800m/z。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過(guò)中心切割二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，可有效解決復(fù)方感冒藥在一維液相色譜分離時(shí)使用質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相時(shí)鑒定雜質(zhì)的難題。即在一維體系中，使用質(zhì)譜不兼容流動(dòng)相對(duì)化合物進(jìn)行分離，在二維體系中使用質(zhì)譜兼容型流動(dòng)相，二維體系連接質(zhì)譜檢測(cè)器。通過(guò)軟件控制閥切換，使一維體系中感興趣的組分切入二維體系中，再進(jìn)一步進(jìn)行雜質(zhì)鑒定。本發(fā)明提高了質(zhì)譜鑒定復(fù)方感冒藥中降解雜質(zhì)的準(zhǔn)確性和可靠性，克服了質(zhì)譜在使用磷酸鹽、三乙胺等非揮發(fā)性緩沖鹽流動(dòng)相時(shí)對(duì)其造成污染和干擾的困難。

附圖說(shuō)明

圖1為馬來(lái)酸氯苯那敏及鹽酸去氧腎上腺素氧化降解樣品一維液相色譜圖，陰影部分保留時(shí)間10.20、12.80、以及14.33分鐘的峰為被切割的色譜峰；

圖2為布洛芬氧化降解樣品一維液相色譜圖，陰影部分保留時(shí)間13.55、16.76以及22.80分鐘的峰為被切割的色譜峰；

圖3為馬來(lái)酸氯苯那敏及鹽酸去氧腎上腺素氧化降解樣品一維液相色譜圖中10.20(圖3a)、12.80(圖3b)、14.33min(圖3c)的組分經(jīng)二維系統(tǒng)除 鹽后的總離子流圖；

圖4為布洛芬氧化降解樣品一維液相色譜圖13.55min(圖4a)、16.76min(圖4b)以及22.80min(圖4c)的組分經(jīng)二維系統(tǒng)除鹽后的總離子流圖；

圖5為實(shí)施例1中10.20(圖5a)、12.80(圖5b)、14.33min(圖5c)組分的一級(jí)高分辨質(zhì)譜圖及推測(cè)分子式；

圖6為實(shí)施例2中13.55(圖6a)、16.76(圖6b)、22.80min(圖6c)中組分的一級(jí)高分辨質(zhì)譜圖；

圖7為實(shí)施例3采用質(zhì)譜兼容性緩沖鹽對(duì)布洛芬強(qiáng)制降解產(chǎn)物進(jìn)行高效液相-質(zhì)譜分析的總離子流圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述。

材料來(lái)源：

復(fù)方感冒藥檢測(cè)樣本來(lái)源惠氏公司，商品名為布洛腎素那敏片，批號(hào)：R11129，乙腈(質(zhì)譜純，fisher公司)，超純水(milli Q超純水系統(tǒng)，過(guò)0.22um濾膜)，緩沖鹽(色譜純，均購(gòu)自sigma-aldrich公司)。

樣品制備：

復(fù)方感冒藥經(jīng)過(guò)氧化破壞處理：

a.布洛芬氧化樣品的制備：取復(fù)方感冒藥適量(約相當(dāng)于布洛芬200mg)，加乙腈10ml，超聲使溶解，過(guò)濾，加30％過(guò)氧化氫10ml，置80℃水浴1小時(shí)，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，定容，搖勻，濾過(guò)，待進(jìn)樣。

b.鹽酸去氧腎上腺素及馬來(lái)酸氯苯那敏氧化樣品的制備：取復(fù)方感冒藥適量(約相當(dāng)于鹽酸去氧腎上腺素10mg及馬來(lái)酸氯苯那敏4mg)，加20％乙腈-水溶劑10ml，超聲使溶解，搖勻加30％的過(guò)氧化氫5ml，置80℃水浴30分鐘，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，定容，搖勻，過(guò)濾，待進(jìn)樣。

實(shí)施例1馬來(lái)酸氯苯那敏及鹽酸去氧腎上腺素強(qiáng)制降解產(chǎn)物分析，切割如圖1中保留時(shí)間為12.80分鐘組分時(shí)，儀器配置及分析條件為：

一維：

高效液相色譜：HPLC，Agilent 1260；

色譜柱：Waters spherisorb 5um SCX,4.6*150mm；

流動(dòng)相A：0.075mol/L磷酸氫二鈉(含0.1％三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.4)；

流動(dòng)相B:乙腈；

線性梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；

流速：1.0ml/分鐘；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：20ul；

閥切換時(shí)間為12.75-12.85min。

切割一維色譜圖(如圖1)中保留時(shí)間為12.80分鐘的組分時(shí)，二維測(cè)試條件如下：

超高效液相色譜：UHPLC,Agilent 1290；

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 1.8um,2.1*50mm；

流動(dòng)相A:加入甲酸的水；B：加入甲酸的乙腈；

流動(dòng)相梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；

流速：0.3ml/分鐘；

柱溫：35℃；

質(zhì)譜儀：Q-TOF G6540B Agilent；

離子源：ESI+電離源；

噴霧電壓：3.5～4kV，

霧化器流量：11L/min，

去溶劑氣溫度：350℃，

離子源氣壓：45psi，

驅(qū)簇電壓：120V，

碰撞能量：35±15ev，

MS掃描范圍：100-1000m/z，

MS/MS掃描范圍：50-800m/z。

從圖1中看出，馬來(lái)酸氯苯那敏強(qiáng)制降解產(chǎn)物較為復(fù)雜，利用磷酸鹽并加入三乙胺的緩沖鹽體系才能得到較好的分離度和峰形。將保留時(shí)間為12.80分鐘的色譜峰切入二維體系，利用二維體系中的溶劑以及小粒徑的色譜柱進(jìn)行快速的脫鹽處理，再將組分切至質(zhì)譜中進(jìn)行檢測(cè)，從圖3b中，可以看到保留時(shí)間為12.80分鐘組分的總離子流圖，對(duì)其質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析(圖5b)，可以準(zhǔn)確判斷其分子式為C₁₆H₁₉ClN₂O，其為馬來(lái)酸氯苯那敏的氧化產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)采用中心切割二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠精確的將目標(biāo)組分切入至質(zhì)譜中進(jìn)行分析，并排除了非揮發(fā)性緩沖鹽的干擾，提高了藥物雜質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

實(shí)施例2布洛芬強(qiáng)制降解產(chǎn)物分析，切割如圖2中13.55分鐘組分時(shí)，儀器配置及分析條件為：

一維：

高效液相色譜：HPLC，Agilent 1260；

色譜柱：Waters BEH C18 3.5um 4.6*150mm；

梯度洗脫條件：

流動(dòng)相A：0.02mol/L磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(83.5：16.5)；

流動(dòng)相B：0.02mol/L磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-乙腈(16.5：83.5)；

線性梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

流速：1.4ml/分鐘；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：20ul；

閥切換時(shí)間為13.50-13.60min。

切割一維色譜圖(如圖2)中13.55分鐘的組分時(shí)，二維測(cè)試條件如下：

超高效液相色譜：UHPLC,Agilent 1290；

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 1.8um,2.1*50mm；

流動(dòng)相A:加入甲酸的水；B：加入甲酸的乙腈；

流動(dòng)相梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：215nm；

流速：0.3ml/分鐘；

柱溫：35℃；

質(zhì)譜儀：Q-TOF G6540B Agilent；

離子源：ESI+電離源；

噴霧電壓：3.5～4kV，

霧化器流量：11L/min，

去溶劑氣溫度：350℃，

離子源氣壓：45psi，

驅(qū)簇電壓：100V，

碰撞能量：35±15ev，

MS掃描范圍：100-1000m/z。

從圖2中看出，布洛芬的強(qiáng)制降解產(chǎn)物的分離需要利用磷酸鹽體系才能得到較好的分離度和峰形。將保留時(shí)間為13.55分鐘的色譜峰切入二維體系，利用二維體系中的溶劑以及小粒徑的色譜柱進(jìn)行快速的脫鹽處理，再將組分切至質(zhì)譜中進(jìn)行檢測(cè)，從圖4a中，可以看到保留時(shí)間為13.55分鐘組分的總離子流圖，對(duì)其質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析(圖6b)，可以準(zhǔn)確判斷其分子式為C₁₃H₁₈O₃，其為布洛芬的氧化產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)采用中心切割二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠精確的將目標(biāo)組分切入至質(zhì)譜中進(jìn)行分析，并排除了非揮發(fā)性緩沖鹽的干擾，提高了藥物雜質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

實(shí)施例3采用質(zhì)譜兼容性緩沖鹽對(duì)布洛芬強(qiáng)制降解產(chǎn)物進(jìn)行高效液相-質(zhì)譜分析

由于目前尚未有公開(kāi)的可參考的對(duì)復(fù)方感冒藥有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行液質(zhì)分析鑒 定的資料或技術(shù)方法，前期嘗試使用質(zhì)譜兼容性流動(dòng)相進(jìn)行分析，儀器配置及分析條件為：

高效液相色譜：HPLC，Agilent 1290；

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18 1.8um,2.1*50mm；

流動(dòng)相A:加入甲酸的水；B：加入甲酸的乙腈；

線性梯度：

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；

流速：0.4ml/分鐘；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：5ul；

質(zhì)譜儀：Q-TOF G6540B Agilent；

離子源：ESI+電離源；

噴霧電壓：3.5～4kV，

霧化器流量：11L/min，

去溶劑氣溫度：350℃，

離子源氣壓：45psi，

驅(qū)簇電壓：100V，

碰撞能量：35±15ev，

MS掃描范圍：100-1000m/z。

結(jié)果如圖7，上述結(jié)果表明通過(guò)高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定藥物雜質(zhì)時(shí)不能使用質(zhì)譜非兼容性流動(dòng)相系統(tǒng)，否則會(huì)對(duì)質(zhì)譜產(chǎn)生嚴(yán)重的污染和干擾，損壞質(zhì)譜。傳統(tǒng)方法一般將非兼容性流動(dòng)相更換成兼容性流動(dòng)相，但由于流動(dòng)相 緩沖鹽體系相差較大，往往不能還原出原分離效果，造成色譜峰的缺失或定位錯(cuò)誤，很難準(zhǔn)確的對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行分析和鑒定。如圖7所示，在總離子流圖中，色譜峰分離度較差，重疊嚴(yán)重，無(wú)法對(duì)目標(biāo)雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位進(jìn)而通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和變形，只要不脫落本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的范圍。