本發(fā)明是細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物前處理的新方法，具體地說是建立了一種用簡單快速原位的前處理手段，完成了細(xì)胞清潔、細(xì)胞淬滅、細(xì)胞脫壁破碎及小分子代謝成分提取的前處理方法，該方法具有前處理方法簡便快捷，樣品損失少，重現(xiàn)性好，尤其適用于批量及微量樣品的優(yōu)點。
背景技術(shù)：
代謝組學(xué)是近幾年發(fā)展起來的對某一生物或細(xì)胞所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一門新學(xué)科，其在環(huán)境毒理學(xué)中的運用正日益成為研究的熱點，它的研究可以幫助人們更好地了解生物系統(tǒng)對環(huán)境變化的反應(yīng)，某種特定代謝物的蓄積可能標(biāo)志著某通路的缺陷、某信號響應(yīng)通路的激活或是某生物合成通路的強化體內(nèi)某種生物分子或代謝物的動態(tài)變化可以作為毒性損傷的標(biāo)志物。尤其是近年來隨著細(xì)胞代謝組學(xué)的發(fā)展，利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過檢測細(xì)胞小分子代謝物的變化情況來評價環(huán)境污染物的毒性作用成為環(huán)境毒理學(xué)發(fā)展的新方向(劉鵬,樸豐源,王艷艷,洪巖,代謝組學(xué)技術(shù)及其在毒理學(xué)中的應(yīng)用,大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,30(2008)565-569；A.Kortenkamp,Ten Years of Mixing Cocktails:A Review of Combination Effects of Endocrine-Disrupting Chemicals,Environ Health Persp,115(2007)98-105)。完整的細(xì)胞代謝組學(xué)包括胞外代謝物和胞內(nèi)代謝的檢測兩個部分，相對于胞外代謝物的檢測，胞內(nèi)代謝物的檢測及組成成分要復(fù)雜的多，胞內(nèi)代謝物的改變更能直觀的反應(yīng)細(xì)胞對外界環(huán)境刺激所造成的全景代謝物的組成分布情況，更有利于尋找生物標(biāo)志物，因此通過檢測分析胞內(nèi)代謝物的代謝組學(xué)分析應(yīng)用相對廣泛(Panopoulos,A.D.,Yanes,O.,Ruiz,S.,Kida,Y.S.,et al.,Cell Res 2012,22,168-177；Chrysanthopoulos,P.K.,Goudar,C.T.,Klapa,M.I.,Metab Eng 2009,12,212-222；Ruiz-Aracama,A.,Peijnenburg,A.,Kleinjans,J.,Jennen,D.,et al.,BMC Genomics 2011,12,1-19)。目前常用的細(xì)胞模型包括大鼠、小鼠等動物細(xì)胞模型，人體細(xì)胞如人癌細(xì)胞、人肝細(xì)胞及誘導(dǎo)干細(xì)胞等，這些細(xì)胞共同的特征是貼壁生長，統(tǒng)稱為貼壁細(xì)胞，傳統(tǒng)的對次此類細(xì)胞的處理相對比較復(fù)雜，具體的流程包括細(xì)胞淬滅，細(xì)胞脫壁處理，代謝物提取等步驟，現(xiàn)在應(yīng)用的前處理方式多種多樣，且不同的前處理方法都存在一定的缺點，前人也在細(xì)胞的前處理方面做了一系列的相關(guān)工作，如細(xì)胞淬滅方法的改良，細(xì)胞清洗溶液的選擇，細(xì)胞提取溶劑的選擇等(Leon,Zacarias；Garcia-Canaveras,Juan C.；Teresa Donato,Maria；Mammalian cell metabolomics:Experimental design and sample preparation ELECTROPHORESIS 2013,19(34),2762-2775)，但是上述所有的提取方法都無一例外的選擇了細(xì)胞刮刀或者加入胰酶的消解，胰酶的加入使細(xì)胞的狀態(tài)發(fā)生改變，且清洗胰酶的過程可能損失大量的細(xì)胞，細(xì)胞刮刀需要耗費大量的人力，而且重復(fù)性很差，這些都會使后續(xù)的樣品平行性收到影響，尤其是對于96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞，刮刀很難操作，胰酶的加入量難以控制，因此至今鮮有報道對96孔板如此微量細(xì)胞進(jìn)行代謝物分析，針對上述出現(xiàn)的一系列問題，尋找一種簡單快速，重現(xiàn)性好，不引入外源物質(zhì)且有利于質(zhì)譜檢測的貼壁細(xì)胞前處理方法顯得尤為重要。尤其是再不利用外界工具且不引入外源干擾物的同時使細(xì)胞徹底脫壁對于具有重要的研究價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種簡便快捷，樣品損失少，重現(xiàn)性好，并適用于批量及微量樣品貼壁細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物檢測分析的前處理方法，為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
利用原位快速的前處理手段，不引入任何的干擾代謝產(chǎn)物檢測的外源組分，達(dá)到對貼壁細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的高效提取，包括以下步驟：貼壁細(xì)胞用超純水清洗，向清洗后的細(xì)胞中倒入液氮，待液氮揮發(fā)后加入超純水，超聲處理，冷凍干燥后萃取胞內(nèi)代謝物，對萃取液進(jìn)行分析。
具體步驟為：
a)將貼壁細(xì)胞棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入超純水，吹打清洗細(xì)胞，棄去液體；超純水清洗貼壁細(xì)胞時，為了有效的清除死細(xì)胞及殘留細(xì)胞培養(yǎng)液，又不至于損壞正常的細(xì)胞。槍頭吹打要快速，均勻。
b)向清洗后的細(xì)胞中快速倒入液氮，倒入液氮時要確保細(xì)胞板中物殘留的水吸取干凈，使細(xì)胞瞬間淬滅；
c)待液氮揮發(fā)后加入一定體積的超純水，，水浴條件下超聲處理，一方面細(xì)胞能遇水漲破，另一方面細(xì)胞能徹底的脫壁；
d)脫壁破碎后的細(xì)胞通過冷凍干燥機迅速冷凍干燥，干燥完成后此時的干燥物為細(xì)胞碎裂物，然后采用合適的溶劑萃取細(xì)胞代謝物，過濾除雜后對胞內(nèi)小分子代謝物進(jìn)分析。
此方法涉及到的貼壁細(xì)胞包括常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中的可以貼壁的動物細(xì)胞及人體細(xì)胞，如小鼠、大鼠相關(guān)細(xì)胞，人體癌細(xì)胞，人肝細(xì)胞，人體誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞等；
步驟a)中加入的超純水的體積不宜太多，但又要保證能清洗充分，其體積為細(xì)胞培養(yǎng)板加細(xì)胞培養(yǎng)液體積的1/2-2/3，(24孔板加培養(yǎng)液量1.0mL,12孔板加培養(yǎng)液量2.0mL,6孔板加培養(yǎng)液量2.5mL,4孔板加培養(yǎng)液量5.0mL)；
步驟b)液氮的使用量為將所有貼壁細(xì)胞浸入液氮中；
步驟c)水浴細(xì)胞使細(xì)胞漲破及脫壁的超純水的用水量過多會導(dǎo)致冷凍干燥時耗費大量的時間，過少則會使細(xì)胞脫壁不完全，其體積是步驟a)細(xì)胞培養(yǎng)板加細(xì)胞培養(yǎng)液體積的1/3-1/2，(24孔板加培養(yǎng)液量1.0mL,12孔板加培養(yǎng)液量2.0mL,6孔板加培養(yǎng)液量2.5mL,4孔板加培養(yǎng)液量5.0mL)；
步驟d)放入冷凍干燥機時盛放細(xì)胞的容器要用錫箔紙覆蓋，防止冷凍干燥時細(xì)胞成分的丟失，并將錫箔紙上面扎上細(xì)孔，以利于水分揮發(fā)；
步驟a)中，超純水清洗細(xì)胞的的時間為6-10秒，時間過長會影響正常細(xì)胞的狀態(tài)，洗完后快速將液體吸出棄去，以防止細(xì)胞吸水漲破；。
步驟b)中加入液氮淬滅細(xì)胞后，液氮揮發(fā)過程中細(xì)胞放入冰箱中，待液氮揮發(fā)完，取出進(jìn)行下一步操作，室溫環(huán)境下容易在培養(yǎng)板中凝結(jié)水珠，且常溫環(huán)境會影響細(xì)胞成分的改變。
步驟c)中水浴超聲時水浴為冰水浴，主要為了防止細(xì)胞成分因溫度改變而發(fā)生變化，一般加入冰袋即可超聲頻率為40-60kHz，超聲時間為3-5min。
步驟d)中所述溶劑為體積分?jǐn)?shù)為80％-85％甲醇的水溶液中，此萃取液可以最大程度的溶解細(xì)胞中的組分。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
(1)建立了對貼壁細(xì)胞死細(xì)胞及細(xì)胞表面殘留細(xì)胞培養(yǎng)液去除的快速水洗方法；
(2)通過液氮快速淬滅使細(xì)胞成分更好的停留在特定的瞬間；
(3)快速冰水浴使細(xì)胞脫壁且吸水漲破將代謝產(chǎn)物析出；
(4)甲醇/水使細(xì)胞成分快速提取。
本發(fā)明是細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物前處理的新方法，具體地說是一種采用簡單快速原位的前處理手段完成了細(xì)胞清潔、細(xì)胞淬滅、細(xì)胞破裂及細(xì)胞代謝成分獲得的前處理方法，該方法具有前處理方法簡便快捷，樣品損失少，重現(xiàn)性好，尤其適用于批量及微量樣品的優(yōu)點。
附圖說明
圖1HepG2細(xì)胞全組分小分子代謝物Q-TRAP檢測的總離子流圖；
其中a為Q-TRAP檢測HepG2細(xì)胞全組分小分子代謝物正離子模式下的總離子流圖，b為Q-TRAP檢測HepG2細(xì)胞全組分小分子代謝物負(fù)離子模式下的總離子流圖。
具體實施方式
本發(fā)明通過以下具體實例進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明
實施例1：
人肝癌細(xì)胞HepG2貼壁細(xì)胞內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物含量測定：
取六孔板培養(yǎng)的對數(shù)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，細(xì)胞培養(yǎng)液的體積為每孔3mL.將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出棄去后每孔加入1.5mL的超純水，利用槍頭吹打 快速清潔細(xì)胞7秒，將液體迅速吸出棄去，清潔后的細(xì)胞中快速倒入液氮，液氮的液面要沒過培養(yǎng)板的底部使細(xì)胞瞬間淬滅，然后將培養(yǎng)板放入冰箱中，待液氮揮發(fā)后每孔加入1mL的超純水，冰浴，超聲頻率為40kHz，超聲處理3min，使細(xì)胞快速徹底的脫壁；脫壁后的細(xì)胞培養(yǎng)板用錫箔紙覆蓋(錫箔紙上用針扎上小孔有利于水分揮發(fā))放入冷凍干燥機，干燥完成后每孔加入1mL體積分?jǐn)?shù)85％的甲醇的水溶液萃取胞內(nèi)代謝物，用針頭過濾器過濾后對胞內(nèi)全組分小分子代謝物進(jìn)超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。
由于代謝物分子性質(zhì)的不同，分為正負(fù)離子兩種掃描模式，色譜條件如下所述。正離子模式：色譜柱用ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×100mm)，流動相A為含甲酸0.1％(v/v)的超存水，B相為含甲酸0.1％(v/v)的乙腈。流動相梯度洗脫程序為：起始為90％A，3min時下降到60％，15min時下降到0％并維持5min，20.1min時回到90％A，平衡3min；流速為0.35mL/min，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為10μL。
負(fù)離子模式：色譜柱用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，流動相A為含NH4HCO35mmol/L的超純水，B相為含NH4HCO35mmol/L的甲醇。流動相梯度洗脫程序為：起始為98％A并維持1min，3min時下降到58％，12min時下降到0％并維持4min，16.1min時回到98％A，平衡4min；流速為0.35mL/min，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為10μL。
在以上色譜條件下，使用AB Sciex UHPLC/Q-trap對篩選出的近千對離子對進(jìn)行定量分析。首先用非Scheduled MRM(不帶保留時間)模式，dwell time為5msec，毛細(xì)管電壓正離子模式為4000V,負(fù)離子模式為-3500V，毛細(xì)管溫度為350℃，霧化氣(N2)壓力位40psi，干燥氣(N2)流速為9L/min。
分別得到正負(fù)離子模式下的EIC譜圖，提取各離子對色譜峰得到準(zhǔn)確的保留時間，然后用Scheduled MRM(有保留時間)模式對細(xì)胞樣品進(jìn)行分析。對所得到的原始數(shù)據(jù)用Analyst的MultiQuant軟件進(jìn)行批量處理，導(dǎo)出經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正過的數(shù)據(jù)，接下來對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
采用該方法檢測到了六孔板人肝癌細(xì)胞HepG2的近千種組分，代謝譜圖如圖1所示。