本發(fā)明屬于生物樣品前處理及化學分析檢測領(lǐng)域，涉及一種分子印跡固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測膝溝藻毒素的分析方法。

背景技術(shù)：

膝溝藻毒素GTX2&3是一種神經(jīng)毒素，屬于麻痹性貝毒(The paralytic shellfish poisoning toxins，PSP)的一種，主要是由海洋浮游植物(亞歷山大藻屬、裸甲藻屬)分泌產(chǎn)生。近年來，由于海洋環(huán)境污染導致有毒赤潮在我國附近海域頻繁爆發(fā)，其分泌的藻毒素可以通過食物鏈傳遞經(jīng)貝類富集導致人類中毒從而嚴重危害著海洋漁業(yè)及人類健康的發(fā)展。

針對麻痹性貝毒的危害，建立完善精確的檢測方法、提高檢測預防能力成為當務(wù)之急，現(xiàn)在得到廣泛認可的檢測方法是小白鼠生物法和液相色譜-熒光檢測法，還有很多學者在細胞傳感器、免疫分析學及電泳技術(shù)領(lǐng)域不斷作出探索。這些檢測方法雖然易于操作但對目標物定性定量分析的能力卻有限。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由于其特有的選擇性、精密度、靈敏度高的特點成為近兩年在檢測分析麻痹性貝毒的熱點，但由于目前已經(jīng)建立的液質(zhì)聯(lián)用分析方法基質(zhì)效應明顯，檢測限和定量限較高的原因難以在分析測試領(lǐng)域得到推廣。

現(xiàn)代固相萃取技術(shù)集提取、凈化與富集于一體，在樣品前處理過程中越來越受到青睞。所以開發(fā)一種目標物回收率高，檢測限、定量限和基質(zhì)效應都較低固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用分析方法成為在藻毒素分析領(lǐng)域的研究熱點。目前方法的改進關(guān)鍵是固相萃取前處理貝類樣品的純化以及液質(zhì)分析條件的優(yōu)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中生物分析方法(小白鼠生物法、酶聯(lián)免疫法)和液相色譜-熒光檢測法難以對藻毒素進行精確的定性定量分析，且固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測方法具有檢測限高、基質(zhì)效應明顯的問題。本發(fā)明提供了一種分子印跡固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測膝溝藻毒素的分析方法，利用分子印跡聚合構(gòu)筑與印跡分子有高度相似性的三維孔穴和特定識別位點，從而實現(xiàn)對印跡分子的選擇識別，提高了對目標物富集和去除干擾物的效率；并開發(fā)了以氰基柱為色譜分離柱的液質(zhì)聯(lián)用檢測目標物的分析方法，利用氰基柱在反相使用時具有較強極性，可有效分離樣品中的極性目標物和雜質(zhì)，然后根據(jù)優(yōu)化好的液質(zhì)條件得到膝溝藻毒素在色譜柱上更好的分離效果及質(zhì)譜檢測效果。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：

一種分子印跡固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測膝溝藻毒素的分析方法，包括如下步驟：

第一步，準備粗提取液；

取少量加標后的貝肉溶于一定比例的甲醇-水溶液，經(jīng)渦旋震蕩、超聲、離心對目標物粗提取，得到貝肉粗提取液。

第二步，制備分子印跡固相萃取柱；

在空心固相萃取柱中采用濕法填柱法填入50～300mg的以咖啡因為虛擬模板制作的分子印跡微球，底部和上部分別用篩板封堵并壓實。

第三步，進行分子印跡固相萃??；

①活化：先、后分別用甲醇、蒸餾水通過分子印記固相萃取柱進行活化；②上樣：用鹽酸溶液調(diào)節(jié)粗提取液的pH在4～7范圍內(nèi)、固相萃取儀控制上樣流速在0.5～2ml/min；③淋洗：用體積比為95％～100％的甲醇-水溶液淋洗去除干擾物；④洗脫：用0.1mol/L冰醋酸-水溶液進行洗脫。

第四步，采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測固相萃取后的洗脫液；

①液質(zhì)聯(lián)用的液相條件包括色譜柱、流動相A和流動相B，其中，色譜柱為氰基柱，流動相A為體積比0.1％甲酸-水溶液，流動相B為體積比0.05％甲酸-乙腈溶液；上樣量為20ul，流速為0.6ml/min；②液質(zhì)聯(lián)用的質(zhì)譜條件包括離子源為電噴霧電離源，掃描模式為正離子掃描，檢測模式為選擇性離子檢測。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過建立的完整的分子印跡固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測方法可對目標物精確的定量定性分析，提高了回收率，降低了檢測限、定量限和基質(zhì)效應。

附圖說明

圖1分子印記固相萃取過程示意圖。

圖2膝溝藻毒素GTX2&3標準品儀器上保留時間及峰形示意圖。

圖3膝溝藻毒素GTX2&3在一定濃度范圍的標準曲線。

圖4不同填料用量時對加標貝肉中目標物的提取回收率。

圖5不同pH時對加標貝肉中目標物的提取回收率。

圖6不同上樣流速對加標貝肉中目標物的提取回收率。

圖7不同比例甲醇-水淋洗時對加標貝肉中目標物的提取回收率。

圖中：1下層篩板；2固相萃取柱；3上層篩板；4固相萃取填料；5分子印跡微球空穴；6粗提取液；7目標物；8雜質(zhì)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。

案例一：液質(zhì)聯(lián)用儀檢測膝溝藻毒素GTX2&3方法的建立

本發(fā)明利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)自動上樣膝溝藻毒素GTX2&3標準溶液建立檢測方法。經(jīng)過優(yōu)化后用到的液質(zhì)聯(lián)用檢測條件是：①液相條件包括以氰基柱作為色譜柱，流動相A為體積比0.1％甲酸-水溶液，流動相B為體積比0.05％甲酸-乙腈溶液，上樣量為20ul，流速為0.6ml/min，②質(zhì)譜條件包括離子源為電噴霧電離源(ESI)，掃描模式為正離子掃描，檢測模式為選擇性離子檢測(SIM)。根據(jù)優(yōu)化后的方法上樣檢測濃度為1.2463μg/L標準品，可以得到峰形較好的液質(zhì)圖，如圖2所示。

并配置不同濃度的膝溝藻毒素標準溶液，濃度分別為1.2463μg/L、3.11575μg/L、6.2315μg/L、9.34725μg/L、12.463μg/L于進樣小瓶中，得到的標準曲線如圖3所示。由圖3可以看出在配制的濃度范圍內(nèi)標準方差大于0.999，線性關(guān)系良好。

案例二：分子印記固相萃取柱的制備

如圖1所示，分子印跡固相萃取柱裝置制備方法是：向3ml聚丙烯材質(zhì)的空心固相萃取柱2中填入以咖啡因為虛擬模板制作的分子印跡微球作為填料，采用濕法填柱，兩端以篩板1、3封堵壓實。

由于樣品基質(zhì)較為復雜，不同填料用量對萃取溶液有發(fā)生側(cè)漏和堵塞的可能，所以本發(fā)明考察填充不同質(zhì)量的微球，質(zhì)量分別為50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg對目標物的回收率，結(jié)果如圖4所示。由圖4結(jié)果可以看出當填料用量在150～200mg時對目標物的回收率較高。

案例三：對黃蜆子貝肉加標后固相萃取及液質(zhì)檢測

取加標后的貝肉中溶解于50％甲醇-水溶液于50ml離心管中，經(jīng)渦旋振蕩1min，超聲5min,10000轉(zhuǎn)速下離心10min,提取上清液于50ml比色管中，重復3次，用蒸餾水定容至50ml為貝肉粗提取液。

粗提取液的分子印記固相萃取步驟是：先用5～10ml甲醇、后用5～10ml蒸餾水通過分子印記固相萃取柱進行活化，取10ml粗提取液用如圖1所示的裝置固相萃取。由于上樣溶液的pH、上樣流速會影響分子印跡材料對目標物的吸附效率，淋洗的目的是洗出雜質(zhì)保留目標物，淋洗試劑的選取會影響目標物的保留效果。采用正交試驗設(shè)計對萃取條件進行優(yōu)化，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)粗提取液的pH 2-7、固相萃取儀控制上樣流速0.5～2ml/min、用1ml體積比為90％～100％的甲醇-水溶液淋洗去除干擾物、取1ml的0.1mol/L冰醋酸-水溶液洗脫進行固相萃取條件優(yōu)化，結(jié)果如圖5、6、7所示。從實驗結(jié)果可以看出當pH在4～7，流速在1～1.5ml/min，淋洗溶液為水中甲醇的體積百分比為96～98％時目標物的回收率最高。