背景技術(shù)：
：：中藥配方顆粒是對(duì)傳統(tǒng)中藥飲片湯劑進(jìn)行劑型改革的一類新產(chǎn)品，枸杞子配方顆粒是其中的一種。枸杞子是中藥湯劑常用的中藥飲片，因此枸杞子配方顆粒自然是一種常用的中藥配方顆粒。目前尚無枸杞子配方顆粒的含量測(cè)定方法，無益于枸杞子配方顆粒的臨床應(yīng)用與管理。為保證枸杞子配方顆粒的臨床應(yīng)用的安全性與有效性，制定可控、可行的含量測(cè)定方法勢(shì)在必行。中國(guó)藥典2010年版一部枸杞子藥材項(xiàng)下以甜菜堿為對(duì)照品，采用薄層色譜雙波長(zhǎng)掃描法測(cè)定其含量，該方法操作復(fù)雜，重現(xiàn)性不好，精確性差，現(xiàn)已很少采用。也有文獻(xiàn)報(bào)道，采用HPLC法測(cè)定枸杞子藥材中的甜菜堿含量，但對(duì)供試品溶液的處理多采用離子交換樹脂方法，操作煩雜，誤差較大，重現(xiàn)性不好。目前枸杞子藥材中甜菜堿的含量測(cè)定方法對(duì)建立枸杞子配方顆粒中甜菜堿含量測(cè)定的方法參考價(jià)值不大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明采用HPLC法測(cè)定枸杞子配方顆粒中甜菜堿的含量，首先對(duì)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)進(jìn)行了研究，考察了不同的色譜柱和流動(dòng)相，最后確定的色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以氨基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈－水（85:15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm。理論板數(shù)按甜菜堿峰計(jì)算不低于3000。在確定了色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)之后，重點(diǎn)考察了供試品溶液的處理方法。由于甜菜堿的理化性質(zhì)，在上述色譜條件下，枸杞子配方顆粒中的其它成分對(duì)其測(cè)定影響較大，因此提純除雜是供試品溶液處理方法的關(guān)鍵，本發(fā)明考察了多種提純除雜的方法，最后確定采用堿性氧化鋁柱層析的方法，具體試驗(yàn)研究如下：取供試品適量，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50ml，超聲處理30min，放冷，濾過，并用少量甲醇洗滌容器和殘?jiān)?，洗液并入濾液中，回收甲醇至小體積，加入堿性氧化鋁2g，拌樣，加入到已裝好的堿性氧化鋁柱（8g，用1,2-二氯乙烷濕法裝柱）上，以50ml為1組分，依次按表1順序洗脫，分別收集各組分，蒸干，殘?jiān)铀芙獠⑥D(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按確定的色譜條件測(cè)定，計(jì)算每組分中含甜菜堿的量。結(jié)果見表1。表1不同洗脫溶媒的測(cè)定結(jié)果編號(hào)洗脫溶媒甜菜堿的量（mg）11,2-二氯乙烷021,2-二氯乙烷－甲醇（95:5）031,2-二氯乙烷－甲醇（90:10）041,2-二氯乙烷－甲醇（85:15）051,2-二氯乙烷－甲醇（80:20）0.038661,2-二氯乙烷－甲醇（70:30）0.315371,2-二氯乙烷－甲醇（60:40）0.413281,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）0.516391,2-二氯乙烷－甲醇（40:60）0.0871101,2-二氯乙烷－甲醇（30:70）0.1195111,2-二氯乙烷－甲醇（20:80）——121,2-二氯乙烷－甲醇（10:90）——13甲醇——結(jié)果表明：甜菜堿在1,2-二氯乙烷－甲醇（80:20）時(shí)，開始洗脫下來，在1,2-二氯乙烷－甲醇（30:70）時(shí)，開始出現(xiàn)雜質(zhì)峰，干擾測(cè)定，1,2-二氯乙烷－甲醇（70:30）到（50:50）時(shí)洗脫的最多，故洗脫溶媒選擇1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）；經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，以1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）為提取溶媒與甲醇的提取效果相當(dāng)，且操作簡(jiǎn)便，故提取溶媒也選擇1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）。供試品溶液處理方法中各參數(shù)的考察試驗(yàn)內(nèi)容如下：（1）提取時(shí)間的選擇：取供試品適量，研細(xì)，稱取約400mg，精密稱定，共4份，置具塞錐形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，分別超聲處理10min、20min、30min、40min，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，10g，干法裝柱），用150ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按確定色譜條件測(cè)定，計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒中含甜菜堿的量。結(jié)果表明：超聲30min提取的甜菜堿的量與40min時(shí)相比，其含量基本一致，故提取時(shí)間選擇30min。結(jié)果見表2。表2不同提取時(shí)間的測(cè)定結(jié)果提取時(shí)間（min）10203040含量（mg/g）1.80561.91082.08042.0892（2）提取溶媒量的選擇：取供試品適量，研細(xì)，稱取約400mg，精密稱定，共3份，置具塞錐形瓶中，分別加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）25ml、50ml、100ml，超聲處理30min，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，10g，干法裝柱），用150ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按確定色譜條件測(cè)定，計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒中含甜菜堿的量。結(jié)果表明：50ml混合液提取的甜菜堿的量與100ml時(shí)相比，其含量基本一致，故提取溶媒的量選擇50ml。結(jié)果見表3。表3不同提取溶媒用量的測(cè)定結(jié)果溶媒用量（ml）2550100含量（mg/g）1.93442.08242.0792（3）堿性氧化鋁用量的選擇：取供試品適量，研細(xì)，稱取約400mg，精密稱定，共4份，置具塞錐形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超聲處理30min，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液分別通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，4g、6g、8g、10g，干法裝柱），用150ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按確定色譜條件測(cè)定，計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒中含甜菜堿的量。結(jié)果表明：堿性氧化鋁的用量對(duì)甜菜堿的量影響不大，但用量為4g時(shí)，其雜質(zhì)與6g、8g和10g時(shí)相比較多，故堿性氧化鋁用量選擇6~10g。結(jié)果見表4。表4不同堿性氧化鋁用量的測(cè)定結(jié)果堿性氧化鋁用量（g）46810含量（mg/g）2.14042.12242.10882.0932（4）洗脫量的選擇：取供試品適量，研細(xì)，稱取約400mg，精密稱定，共4份，置具塞錐形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超聲處理30min，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，8g，干法裝柱），分別用50ml、100ml、150ml、200ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按確定色譜條件測(cè)定，計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒中含甜菜堿的量。結(jié)果表明：洗脫量為100ml時(shí)甜菜堿的量與150ml和200ml時(shí)比較，其含量基本一致，故選擇洗脫量為100ml，結(jié)果見表5。表5不同洗脫量的測(cè)定結(jié)果洗脫量（ml）50100150200含量（mg/g）1.96922.09802.10242.0912最終確定供試品溶液處理方法：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取適量（相當(dāng)于1.0g飲片），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，8g，干法裝柱），用100ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。方法學(xué)研究：（1）線性關(guān)系試驗(yàn)：精密稱取甜菜堿對(duì)照品10.64mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻（濃溶液），分別精密量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別取上述溶液20μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表6。表6線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果（2）精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系項(xiàng)下濃度為127.68μg/ml的溶液，連續(xù)進(jìn)針6次，峰面積值見表7。結(jié)果符合要求。表7精密度試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)123456平均值RSD(%)峰面積值1443761424881429231460931443661454971442910.97（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：將供試品溶液放置24小時(shí)，于0、2、4、6、8、24小時(shí)測(cè)定，放置前峰面積值為138140，放置后峰面積值為138409，說明測(cè)定溶液24小時(shí)之內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。結(jié)果見表8。表8穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定時(shí)間（h）0246824峰面積值138140137050138268139057137572138409（4）重現(xiàn)性試驗(yàn)：取供試品適量，研細(xì)，稱取約300mg，精密稱定，6份，按含量測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算枸杞子配方顆粒中含甜菜堿的量。結(jié)果見表9。結(jié)果符合要求。表9重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)123456平均值RSD(%)含量（％）0.40220.39880.40930.40020.40760.39980.40301.09（5）回收率試驗(yàn)：取供試品適量，研細(xì)，稱取約150mg，精密稱定，6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液（濃度為0.1222mg/ml），補(bǔ)加1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）至50ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，8g，干法裝柱），用100ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為測(cè)定回收率溶液。分別取上述溶液20μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以線性關(guān)系項(xiàng)下127.68μg/ml的溶液為對(duì)照，計(jì)算回收率。結(jié)果見表10。表10回收率測(cè)定結(jié)果平均值為99.87％（n＝6）,RSD=1.77%,符合要求。樣品的含量測(cè)定：按上述色譜條件對(duì)各廠家生產(chǎn)的枸杞子配方顆粒進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒含甜菜堿的量，并與藥典飲片含量比較，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表11。表11含量測(cè)定結(jié)果藥典規(guī)定每g飲片含甜菜堿（C5H11NO2）不得少于3.0mg，上述9批樣品每相當(dāng)于1克飲片的配方顆粒平均甜菜堿的含量為1.5220mg。界定每相當(dāng)于1克飲片的配方顆粒含甜菜堿（C5H11NO2）不得少于1.20mg（與藥典藥材含量限度比較轉(zhuǎn)移率為40%）。實(shí)施實(shí)例：（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取甜菜堿對(duì)照品10.64mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃溶液，精密量取3.0ml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)，取適量（相當(dāng)于1.0g飲片的配方顆粒），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，并用少量混合液洗滌容器及藥渣，洗液并入濾液中，濾液通過堿性氧化鋁柱（內(nèi)徑1.5cm，8g，干法裝柱），用100ml混合液洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）色譜條件：色譜柱：KromasilNH2（4.6×250mm，5μ）流動(dòng)相：乙腈－水（85:15）流速：1.0ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：200nm柱溫：30℃進(jìn)樣：20ul（4）測(cè)定：計(jì)算每相當(dāng)于1g飲片的配方顆粒含甜菜堿的量，并計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表12。表12測(cè)定結(jié)果當(dāng)前第1頁1 2 3