本發(fā)明是溶液中化學成分的檢測分析方法，具體地說是通過MTBE一步萃取結合HPLC-MS/MS分析檢測微量細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸的檢測分析方法，該方法前處理方法簡便，有機溶劑用量少，回收率高，檢測靈敏度高，尤其適用于微量及批量細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸的測定。
背景技術：
：游離脂肪酸(freefattyacids,FFAs)是指非酯化的脂肪酸或未脂化的脂肪酸，它們是生物體內重要的營養(yǎng)和代謝產物,對調節(jié)生物體內各項生理和生物功能起重要作用，細胞培養(yǎng)液中細胞分泌的FFAs代謝活性極高,極易受脂肪代謝、糖代謝及內分泌代謝的影響。尤其是多不飽和脂肪酸,成為脂肪酸相關性研究的焦點。因此,細胞培養(yǎng)液中分泌的游離FFAs的定性、定量及快速測定,對細胞代謝組學的基礎研究及應用細胞模型進行的一系列藥物及毒性研究均具有重要的意義。細胞培養(yǎng)液細胞分泌的游離FFAs譜的綜合分析將有助于深入揭示不同脂肪酸之間的相關性,進一步闡明脂肪酸與環(huán)境變化之間的關系,為尋找潛在的異常代謝途徑或毒性機制提供科學依據(jù)。因此,對細胞培養(yǎng)液中細胞分泌的FFAs譜進行全面、系統(tǒng)、多層次的綜合分析至關重要。根據(jù)研究經(jīng)驗,要想及時得到相對全面、穩(wěn)定、準確的脂肪酸信息,從培養(yǎng)液中提取脂肪酸類物質減少前處理誤差并進行準確檢測是最關鍵的步驟。目前臨床上檢測游離FFAs的方法繁瑣,脂肪酸的測定通常采用衍生的方法對脂肪酸進行甲酯化反應后通過氣相色譜或氣相色譜－質譜法分析，但衍生化的過程不僅花費大量的時間，而且會對樣品造成損失。如果不經(jīng)過衍生化,所得的脂肪酸信息非常少,不能滿足脂肪酸譜的分析要求。隨著分析儀器的發(fā)展，液相色譜串聯(lián)質譜技術的應用越來越廣泛，由于其顯著的選擇性及高靈敏度，大大提高了其在代謝組學中的應用地位，在游離FFAs的檢測分析中也開始初露端倪。但是，細胞培養(yǎng)液中的細胞分泌的游離FFAs含量低，如96孔細胞培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液含量少，如何從及其微量的細胞培養(yǎng)液中快速提取出細胞分泌的游離FFAs并對其進行準確的定量分析對于細胞代謝組學的研究顯得尤為重要，本專利的試驗方法的建立，提供了一種前處理簡單，回收率高，準確度好、安全低毒且靈敏度高的檢測分析方法，特別適合于微量及批量細胞培養(yǎng)液中細胞分泌的FFAs的檢測分析。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種前處理簡單，樣品用量少，減少有機溶劑用量，檢測靈敏度高的用于微量及批量細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸測定的檢 測分析方法，為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是：選擇有效的萃取溶劑，一次性提取了微量細胞培養(yǎng)中的多種游離脂肪酸，優(yōu)化并建立HPLC-MS/MS的質譜檢測方法，實現(xiàn)了對微量細胞培養(yǎng)液中脂肪酸的高靈敏度準確檢測分析，具體包括下列步驟：a)由于細胞培養(yǎng)液中存在死細胞及細胞碎片，需要離心細胞培養(yǎng)液獲得細胞培養(yǎng)液上清液，取細胞培養(yǎng)液離心獲得細胞培養(yǎng)液上清液；b)離心后的細胞培養(yǎng)液上清液加入MTBE超聲萃取其中的游離脂肪酸，得萃取液；c)對萃取液離心后取上清，用HPLC-MS/MS方法進行檢測分析，或萃取液經(jīng)離心后取上層，吹干，用所取上層等體積的流動相溶解后用HPLC-MS/MS方法進行檢測分析。通過優(yōu)化流動相條件和質譜參數(shù)，建立游離脂肪酸的HPLC-MS/MS檢測分析方法。此方法涉及到的細胞培養(yǎng)液包括包括常規(guī)動物及人體細胞培養(yǎng)中的細胞培養(yǎng)液，此培養(yǎng)液不含游離脂肪酸；尤其是細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)液，如96孔板的細胞培養(yǎng)液，其每孔培養(yǎng)液體積有限，培養(yǎng)液中的游離脂肪酸含量相對較低；所述細胞培養(yǎng)液為動物或人體細胞培養(yǎng)液，包括1640培養(yǎng)液、DMEM、高糖DMEM中的一種；步驟a)中離心轉速為2000-3000r/min，離心時間為3-5min；步驟b)中加入的MTBE的體積與所取的細胞培養(yǎng)液上清液體積相同；超聲頻率為40-60kHz，超聲時間為8-10min；萃取后高速離心，取上層為萃取液；步驟c)中離心轉速為13000-15000r/min，離心時間為3-5min；所述HPLC-MS/MS方法采用C8柱，ESI負離子模式，SRM檢測；進樣量為10μL。3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟c)中所述流動相為乙腈。4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟c)中所述HPLC-MS/MS方法中，液相色譜條件為：色譜分離采用ThermoScientificHPLC系統(tǒng)，C8色譜柱(2.1mm×150mm×3μm)流動相A為含5mMNH4AC的ACN；流動相B為100％ACN,流動相梯度為(時間,％B,總流速)0-5min,90％,250μL/min,1min內流動相B從90％梯度增加至100％，7-15min,100％,250μL/min,16-20min,90％,300μL/min；柱溫為40℃；進樣體積10μL,自動進樣盤的溫度為6-10℃。步驟a)中，離心細胞培養(yǎng)液直接在細胞培養(yǎng)板中完成，不需要轉移后再離心，盡可能的減少操作步驟，引入操作實驗誤差；步驟c)所述HPLC-MS/MS方法中，質譜的檢測條件為負離子模式下的SRM檢測，質譜條件的SRM檢測的子離子與母離子的選擇相同，但是碰撞能不同，具體的參數(shù)如表1所示。表1游離脂肪酸分析的質譜SRM參數(shù)脂酸酸種類母離子/子離子碰撞能透鏡電壓C6:0115695C8:0143566C10:0171682C12:0199855C14:0227764C16:02551163C18:3277640C18:22791051C18:12811247C18:0283554C19:02971891C20:43031258C20:3305946C20:2307746C20:13091598C20:03111577C24:03671162本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)前處理迅速，只用一種萃取劑一次性萃取多種游離脂肪酸；(2)萃取溶劑用量少；(3)儀器方法檢測靈敏度高；(4)適合微量及批量細胞培養(yǎng)液樣品游離脂肪酸的檢測分析。利用該發(fā)明方法測定微量細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸，前處理方法簡便，有機溶劑用量少，回收率高，檢測靈敏度高，尤其適用于批量及微量細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸的測定，簡化了以前游離脂肪酸分析前處理發(fā)雜，需要衍生才能檢測的問題，尤其適合對微量及批量細胞培養(yǎng)液中的微量游離脂肪酸進行定量分析。具體實施方式本發(fā)明通過以下具體實例進一步描述，但不限制本發(fā)明實施例1人體肝癌細胞HepG2的DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium)培養(yǎng)液加標含量測定：取人體肝癌細胞HepG2的DMEM的細胞培養(yǎng)液200ul，對其以3000rmp/min離心5min，取150ul細胞培養(yǎng)液上清液加入到150ul的C19含量為0.1ppm內標的脂肪酸的MTBE標準溶液中(脂肪酸含量為50ng/ml)，超聲10min，以13000rmp/min離心5min.取100ul上層溶液移入內插管中，直接進行HPLC/MS/MS分析。HPLC-MS/MS(ThermoFisherScientific,USA).色譜分離采用ThermoScientificHPLC系統(tǒng)，C8色譜柱(2.1mm×150mm×3μm)流動相A為含5mMNH4AC的ACN；流動相B為100％ACN,流動相梯度為(時間,％B,總流速)0-5min,90％,250μL/min,1min內流動相B從90％梯度增加至100％，7-15min,100％,250μL/min,16-20min,90％,300μL/min；柱溫為40℃；進樣體積10μL,自動進樣盤的溫度為8℃，質譜選用負離子模式，選擇反應監(jiān)測(MRM),電壓為-2500V,子離子與母離子的選擇相同，都是[M-H]-，碰撞能參數(shù)如表1所示.表1游離脂肪酸分析的質譜SRM參數(shù)脂酸酸種類母離子/子離子碰撞能透鏡電壓C6:0115695C8:0143566C10:0171682C12:0199855C14:0227764C16:02551163C18:3277640C18:22791051C18:12811247C18:0283554C19:02971891C20:43031258C20:3305946C20:2307746C20:13091598C20:03111577C24:03671162按上述步驟平行試驗三次。表2HepG2細胞培養(yǎng)液中的游離脂肪酸的RSD及回收率采用該方法檢測了DMEM細胞培養(yǎng)液中加標的的游離脂肪酸的回收率和RSD值。各個游離脂肪酸的的相對標準偏差(RSD)結果及脂肪酸的回收率如表2所示，結果表明，所有脂肪酸的回收率達到了90％以上，除了少數(shù)脂肪酸外，絕大的多數(shù)脂肪酸的RSD值都在10％以內。實施例2人體肝癌細胞HepG2的高糖DMEM(highglucosedulbecco'smodifiedeaglemedium)培養(yǎng)液中分泌的胞外脂肪酸含量測定：取人體肝癌細胞HepG2培養(yǎng)48h的高糖DMEM的細胞培養(yǎng)液200ul，對其以3000rmp/min離心5min，取150ul細胞培養(yǎng)液上清液加入到150ul的C19含量為0.1ppm內標的脂肪酸的MTBE溶液中，超聲10min，以13000rmp/min離心5min.取100ul上層溶液移入內插管中，氮氣吹干后，100ul乙腈復溶，進行HPLC/MS/MS分析。HPLC-MS/MS(ThermoFisherScientific,USA).色譜分離采用ThermoScientificHPLC系統(tǒng)，C8色譜柱(2.1mm×150mm×3μm)流動相A為含5mMNH4AC的ACN；流動相B為100％ACN,流動相梯度為(時間,％B,總流速)0-5min,90％,250μL/min,1min內流動相B從90％梯度增加至100％，7-15min,100％,250μL/min,16-20min,90％,300μL/min；柱溫為40℃；進樣體積10μL,自動進樣盤的溫度為8℃，質譜選用負離子模式，選擇反應監(jiān)測(MRM),電壓為-2500V,子離子與母離子的選擇相同，都是[M-H]-，碰撞能參數(shù)如表1所示.表1游離脂肪酸分析的質譜SRM參數(shù)脂酸酸種類母離子/子離子碰撞能透鏡電壓C6:0115695C8:0143566C10:0171682C12:0199855C14:0227764C16:02551163C18:3277640C18:22791051C18:12811247C18:0283554C19:02971891C20:43031258C20:3305946C20:2307746C20:13091598C20:03111577C24:03671162按上述步驟平行試驗三次。表3HepG2細胞在高糖的DMEM細胞培養(yǎng)液中分泌的游離脂肪酸的RSD及含量HepG2細胞在高糖的DMEM細胞培養(yǎng)液中分泌的游離脂肪酸的RSD及含量如表3所示，結果表明，脂肪酸的含量在0.7-856.3ug/L之間，除個別脂肪酸外，RSD在10％以內。當前第1頁1 2 3