一種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株進(jìn)行分類的方法。該方法具體步驟是：首先，分別對(duì)多株沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，再提取菌株細(xì)胞，再獲取菌株細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸種類和脂肪酸的含量，然后根據(jù)多株沙門氏菌的脂肪酸脂肪酸種類和脂肪酸的含量繪制沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜；最后，采用上述方法獲得待測沙門氏菌菌株的脂肪酸種類和脂肪酸的含量并與沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜進(jìn)行比較，從而對(duì)待測沙門氏菌菌株進(jìn)行分類。采用本發(fā)明的方法使得沙門氏菌菌株的分類更加精準(zhǔn)、分類速度更快、并且應(yīng)用成本低。
【專利說明】—種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株進(jìn)行分類的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌是最常見的食源性致病菌，也是導(dǎo)致我國食源性疾病的主要病原體之一。據(jù)估計(jì)在中國將近22.2%的食源性細(xì)菌爆發(fā)是由沙門氏菌引起的。因此，對(duì)食物中毒主要病原菌沙門氏菌的分型，研究其相關(guān)性，以達(dá)到準(zhǔn)確溯源，從而快速有效的控制由其引起的食物中毒。 [0003]目前，用來區(qū)分沙門氏菌的方法有許多種，主要包括抗生素敏感試驗(yàn)、噬菌體分型、血清型分類、多位點(diǎn)酶電泳(MLEE)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)。除此之外，近年來，化學(xué)分類學(xué)特別是脂肪酸的化學(xué)分類學(xué)研究在細(xì)菌分類學(xué)方面也具有良好的分辨能力，以上方法均能夠分型菌株，但其準(zhǔn)確性、區(qū)分能力和再現(xiàn)性不同，將這些技術(shù)的特點(diǎn)相結(jié)合能夠提高追蹤流行病學(xué)研究的精確性。
[0004]但是，隨著食源性致病菌的種類越來越復(fù)雜，病菌的成分越來越相似，在現(xiàn)有的分類方法時(shí)就病菌的分類顯得不夠精細(xì)、不夠準(zhǔn)確了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服【背景技術(shù)】中的缺陷，本發(fā)明提出了一種分類更加精準(zhǔn)、分類速度快、應(yīng)用成本低的利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法。
[0006]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是:
[0007]—種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，其特征在于，
[0008]包括以下步驟:
[0009]步驟I】選取多株沙門氏菌菌株，并獲取多株沙門氏菌菌株的脂肪酸信息質(zhì)譜，其具體是步驟是:
[0010]步驟1.1】將沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得沙門氏菌菌株細(xì)胞；
[0011]步驟1.2】分別對(duì)沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行熱裂解處理，形成氣體產(chǎn)物；
[0012]步驟1.3】將氣體產(chǎn)物注入氣相色譜柱的系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而獲得沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜；
[0013]步驟2】對(duì)獲得的每株沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜進(jìn)行譜庫檢索，確認(rèn)每株沙門氏菌菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量；
[0014]步驟3】對(duì)上述步驟2】的結(jié)果采用最短距離法和歐氏距離法進(jìn)行聚類分析，并繪制出沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜；
[0015]步驟4】將待測試的沙門氏菌菌株，根據(jù)上述步驟I】和步驟2】獲取菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量，將獲得的結(jié)果和步驟3】中所獲得的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜進(jìn)行結(jié)合并繪制出新的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜，從而確定待測沙門氏菌菌株的類型。
[0016]上述步驟1.1】將沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得沙門氏菌菌株細(xì)胞；其具體步驟是:
[0017]步驟1.1.1】沙門氏菌菌株預(yù)培養(yǎng)；
[0018]將沙門氏菌菌株接種于IOmL的肉湯培養(yǎng)基中，保持溫度在37°C，并在1580rpm轉(zhuǎn)速的情況下震蕩培養(yǎng)18_24h ；
[0019]步驟1.1.2】沙門氏菌菌株進(jìn)行二次培養(yǎng)；
[0020]提取上述步驟1.1.1】預(yù)培養(yǎng)菌液ImL并接種到100肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上，37 °C恒溫震蕩培養(yǎng)18-24h。
[0021]步驟1.1.3】將0.5%的甲醛注入步驟1.1.2】的培養(yǎng)菌液中進(jìn)行滅活處理；
[0022]步驟1.1.4】將滅活處理后的培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速4000r/min的情況下離心處理2min，收集沙門氏菌菌株細(xì)胞；
[0023]步驟1.1.5】用滅菌蒸餾水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行至少兩次洗滌，然后使用無菌純凈水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行預(yù)懸浮，最后將細(xì)胞移到容量瓶內(nèi)冷凍干燥后保存。
[0024]上述步驟1.2】通過熱裂解儀分別對(duì)沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行處理，從而形成氣體產(chǎn)物；其具體是:使用熱裂解儀在600°C的溫度下進(jìn)行裂解處 理12s，噴射溫度保持在280°C，從而形成氣體產(chǎn)物。
[0025]上述步驟1.3】將氣體產(chǎn)物注入氣相色譜柱的系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而獲得沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜；其具體步驟是:
[0026]步驟1.3.1】設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)的初始溫度為45°C，進(jìn)樣口溫度為250°C，載氣為氦氣，流速36.5cm/s，分流比為30:1，離子源溫度220°C，接口溫度250°C，光譜掃描范圍 20 - 600U ；
[0027]步驟1.3.2】將氣體產(chǎn)物注入到設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)，按照逐漸升溫的方式加熱。
[0028]步驟1.3.3】對(duì)氣體產(chǎn)物離子全掃描，獲取氣體產(chǎn)物中脂肪酸的信息質(zhì)譜。
[0029]本發(fā)明的有益效果是:
[0030]采用本發(fā)明在沙門氏菌菌株快速確認(rèn)方面有很高的利用價(jià)值，這種方法同樣能夠用來確認(rèn)菌株間的關(guān)系，脂肪酸分析法不僅具有和PFGE、血清型分析法同樣的檢測能力，更具有分類更加精細(xì)、分類快速以及良好的經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為4號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；
[0032]圖2為4號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0033]圖3為5號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；
[0034]圖4為5號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0035]圖5為6號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；
[0036]圖6為6號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0037]圖7為14號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；[0038]圖8為14號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0039]圖9為40號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；
[0040]圖10為40號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0041]圖11為41號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖；
[0042]圖12為41號(hào)沙門氏菌菌株的TIC局部放大圖；
[0043]圖13為42株沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜；
[0044]圖14為42株沙門氏菌菌株P(guān)FGE分離種群系統(tǒng)樹狀圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明提出了一種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，通過采用該方法不僅具有和PFGE、血清型分析法同樣的檢測能力，更具有分類更加精細(xì)、分類快速以及良好的經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)勢。
[0046]以下提供了本發(fā)明具體的實(shí)施過程:
[0047]采用本發(fā)明的基礎(chǔ)是，選取多株沙門氏菌菌株，并按照多株沙門氏菌菌株構(gòu)建沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜；
[0048]在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)明人一共選取了 42株沙門氏菌，其中4株來自人類患者，11株來自豬肉，2株來自速食食品，26株來自雞肉。39株食源性沙門氏菌分離于2007年和2009年，分離于陜西楊凌的超市和農(nóng)貿(mào)市場的零售食品。4株人源菌株分離于2007年和2009年，河南疾病和預(yù)防控制中心分離 于痢疾(sporadic diarrheal)患者。所有細(xì)菌菌株在使用前均保存在_80°C, 20%(v/v)甘油的大豆酪蛋白培養(yǎng)基(trypticase soy broth, TSB)中。
[0049]利用上述的42株菌株按照以下步驟，構(gòu)建沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜:
[0050]步驟I】獲取42株沙門氏菌菌株的脂肪酸信息質(zhì)譜，其具體步驟是:
[0051]步驟1.1】將沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得沙門氏菌菌株細(xì)胞，其具體步驟是:
[0052]步驟1.1.1】沙門氏菌菌株預(yù)培養(yǎng)；
[0053]將沙門氏菌菌株接種于IOmL的肉湯培養(yǎng)基中，保持溫度在37°C，并在1580rpm轉(zhuǎn)速的情況下震蕩培養(yǎng)18_24h ；
[0054]步驟1.1.2】沙門氏菌菌株進(jìn)行二次培養(yǎng)；
[0055]提取上述步驟1.1.1】預(yù)培養(yǎng)菌液ImL并接種到100肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上，37 °C恒溫震蕩培養(yǎng)18-24h。
[0056]步驟1.1.3】將0.5%的甲醛注入步驟1.1.2】的培養(yǎng)菌液中進(jìn)行滅活處理；
[0057]步驟1.1.4】將滅活處理后的培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速4000r/min的情況下離心處理2min，收集沙門氏菌菌株細(xì)胞；
[0058]步驟1.1.5】用滅菌蒸餾水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行至少兩次洗滌，然后使用無菌純凈水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行預(yù)懸浮，最后將細(xì)胞移到容量瓶內(nèi)冷凍干燥后保存。
[0059]步驟1.2】通過熱裂解儀分別對(duì)沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行處理，從而形成氣體產(chǎn)物；
[0060]其具體是:使用熱裂解儀在600°C的溫度下進(jìn)行裂解處理12s，噴射溫度保持在280°C，從而形成氣體產(chǎn)物。
[0061]步驟1.3】將氣體產(chǎn)物注入氣相色譜柱的系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而獲得沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜，其具體步驟是:
[0062]步驟1.3.1】設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)的初始溫度為45°C，進(jìn)樣口溫度為250°C，載氣為氦氣，流速36.5cm/s，分流比為30:1，離子源溫度220°C，接口溫度250°C，光譜掃描范圍 20 - 600U ；
[0063]步驟1.3.2】將氣體產(chǎn)物注入到設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)，按照逐漸升溫的方式加熱，其具體是:
[0064]具體的做法是:初始溫度下保持2min，再以每分鐘5°C的速度升高到100°C ;再以每分鐘15°C的速度升高到250°C，保持2min ;再以每分鐘20°C的速度升高到300°C，并在300°C 保持 2min ；
[0065]步驟1.3.3】對(duì)氣體產(chǎn)物離子全掃描，獲取氣體產(chǎn)物中脂肪酸的信息質(zhì)譜；
[0066]2】對(duì)獲得的每株沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜進(jìn)行譜庫檢索，確認(rèn)每株沙門氏菌菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量；
[0067]3】對(duì)上述步驟2】的結(jié)果采用最短距離法和歐氏距離法進(jìn)行聚類分析，并繪制出沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜；
[0068]4】發(fā)明人隨機(jī)選擇了一株或多株待測試的沙門氏菌菌株，根據(jù)上述步驟I】和步驟2】獲取菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量，將獲得的結(jié)果和步驟3】中所獲得的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜進(jìn)行結(jié)合并繪制出新的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜，從而確定待測沙門氏菌菌株的類型。
[0069]為了反應(yīng)本次試驗(yàn)的過程，發(fā)明人隨機(jī)抽選的42株沙門氏菌菌株中的4、5、6、14、40,41號(hào)沙門氏菌菌株的TIC圖和TIC局部放大圖，如圖1至圖12所示，并從上述圖紙中獲取了 4、5、6、14、40、41號(hào)沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜；并利用步驟2】分別對(duì)上述每株沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜進(jìn)行了處理；獲得以下表1~表6:
[0070]表1、4號(hào)樣品定性結(jié)果
[0071]
【權(quán)利要求】
1.一種利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，其特征在于，包括以下步驟: .1】選取多株沙門氏菌菌株，并獲取多株沙門氏菌菌株的脂肪酸信息質(zhì)譜，其具體是步驟是: . 1.1】將沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得沙門氏菌菌株細(xì)胞； . 1.2】分別對(duì)沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行熱裂解處理，形成氣體產(chǎn)物； .1.3】將氣體產(chǎn)物注入氣相色譜柱的系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而獲得沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜； 2】對(duì)獲得的每株沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜進(jìn)行譜庫檢索，確認(rèn)每株沙門氏菌菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量； 3】對(duì)上述步驟2】的結(jié)果采用最短距離法和歐氏距離法進(jìn)行聚類分析，并繪制出沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜； 4】將待測試的沙門氏菌菌株，根據(jù)上述步驟I】和步驟2】獲取菌株脂肪酸種類和脂肪酸的含量，將獲得的結(jié)果和步驟3】中所獲得的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜進(jìn)行結(jié)合并繪制出新的沙門氏菌菌株的脂肪酸系統(tǒng)樹狀圖譜，從而確定待測沙門氏菌菌株的類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所的利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，其特征在于:所述步驟1.1】將沙門氏菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得沙門氏菌菌株細(xì)胞；其具體步驟是: . 1.1.1】沙門氏菌菌株預(yù)培養(yǎng)； 將沙門氏菌菌株接種于IOmL的肉湯培養(yǎng)基中，保持溫度在37°C，并在1580rpm轉(zhuǎn)速的情況下震蕩培養(yǎng)18_24h ； . 1.1.2】沙門氏菌菌株進(jìn)行二次培養(yǎng)； 提取上述步驟1.1.1】預(yù)培養(yǎng)菌液ImL并接種到100肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上，37°C恒溫震蕩培養(yǎng)18-24h。 . 1.1.3】將0.5%的甲醛注入步驟1.1.2】的培養(yǎng)菌液中進(jìn)行滅活處理； . 1.1.4】將滅活處理后的培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速4000r/min的情況下離心處理2min，收集沙門氏菌菌株細(xì)胞； . 1.1.5】用滅菌蒸餾水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行至少兩次洗滌，然后使用無菌純凈水對(duì)收集的沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行預(yù)懸浮，最后將細(xì)胞移到容量瓶內(nèi)冷凍干燥后保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所的利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，其特征在于:所述步驟1.2】通過熱裂解儀分別對(duì)沙門氏菌菌株細(xì)胞進(jìn)行處理，從而形成氣體產(chǎn)物；其具體是:使用熱裂解儀在600°C的溫度下進(jìn)行裂解處理12s，噴射溫度保持在280°C，從而形成氣體產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所的利用全細(xì)胞脂肪酸對(duì)沙門氏菌菌株的分類方法，其特征在于:所述步驟1.3】將氣體產(chǎn)物注入氣相色譜柱的系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而獲得沙門氏菌菌株脂肪酸的信息質(zhì)譜；其具體步驟是: .1.3.1】設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)的初始溫度為45°C，進(jìn)樣口溫度為250°C，載氣為氦氣，流速36.5cm/s,分流比為30: 1，離子源溫度220 V，接口溫度250°C，光譜掃描范圍20 - 600U ； .1.3.2】將氣體產(chǎn)物注入到設(shè)定氣相色譜柱的系統(tǒng)內(nèi)，按照逐漸升溫的方式加熱。 .1.3.3】對(duì)氣體產(chǎn)物離子全掃描，獲取氣體產(chǎn)物中脂肪酸的信息質(zhì)譜。
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK103589775SQ201310618107
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】張鵬飛, 付騁宇, 藍(lán)海嘯, 劉德昊, 王新 申請(qǐng)人:中華人民共和國陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局