蘋(píng)果MdMYB1基因中與早結(jié)果性狀相關(guān)的突變及其鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明蘋(píng)果MdMYB1基因中與早結(jié)果性狀相關(guān)的突變及其鑒定方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，為在蘋(píng)果雜交后代中選擇早結(jié)果植株提供依據(jù)。利用蘋(píng)果著色相關(guān)基因MdMYB1中的三處突變，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，開(kāi)發(fā)出檢測(cè)蘋(píng)果著色突變的新分子標(biāo)記，其顯著進(jìn)步是與國(guó)外已有的dCAPS標(biāo)記、我們開(kāi)發(fā)的CAPS標(biāo)記相比，不需要進(jìn)行酶切，操作簡(jiǎn)便。利用該標(biāo)記方法鑒定123株蘋(píng)果雜交后代基因突變和果實(shí)著色時(shí)，發(fā)現(xiàn)MdMYB1基因中另外兩處突變與雜交后代早結(jié)果性狀相關(guān)，可用來(lái)設(shè)計(jì)特異引物開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，在苗期對(duì)蘋(píng)果雜交后代進(jìn)行早期選擇，選出具有早結(jié)果性狀的植株加強(qiáng)管理，盡早獲得較多的結(jié)果植株；也可用于分子設(shè)計(jì)育種，選出具有早結(jié)果性狀的親本進(jìn)行雜交，盡早獲得較多的結(jié)果植株。
【專(zhuān)利說(shuō)明】蘋(píng)果MdMYBI基因中與早結(jié)果性狀相關(guān)的突變及其鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于蘋(píng)果MdMYBl基因突變的分子標(biāo)記方法鑒定蘋(píng)果雜交后代早結(jié)果性狀以及果實(shí)著色性狀。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋(píng)果(Malus domestica Borkh.)是我國(guó)果樹(shù)產(chǎn)業(yè)中重要的大宗水果,其著色問(wèn)題是影響我國(guó)許多產(chǎn)區(qū)蘋(píng)果質(zhì)量的一個(gè)重要因素，培育著色好的品種是生產(chǎn)中急需的。利用蘋(píng)果著色相關(guān)基因的序列變異，開(kāi)發(fā)果實(shí)著色性狀的分子標(biāo)記，提早鑒定雜交后代植株果實(shí)著色性狀，對(duì)雜交后代植株提早進(jìn)行篩選，將有助于降低早期試驗(yàn)費(fèi)用和工作量，以低成本盡快培育出著色好的蘋(píng)果新品種，增強(qiáng)我國(guó)蘋(píng)果的質(zhì)量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
[0003]蘋(píng)果的著色與果皮中的花色苷有關(guān)，花色苷的合成涉及查爾酮合成酶(CHS)、類(lèi)黃酮3-羥基化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、UDP-葡萄糖類(lèi)黃酮-3-0-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的積累與這些基因、特別是UFGT基因的表達(dá)水平有關(guān)，這些基因的表達(dá)受到MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，MdMYBl基因是一個(gè)與果實(shí)著色有關(guān)的功能基因(Takos 等，2006)。Takos 等(2006)通過(guò)分析MdMYBl-1 (GenBank 登錄號(hào) DQ886414)等基因序列，找到了一個(gè)與果實(shí)著色性狀有關(guān)的堿基突變位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出一個(gè)dCAPS標(biāo)記。dCAPS標(biāo)記是一種改進(jìn)的CAPS標(biāo)記(derived CAPS)，而CAPS標(biāo)記是指切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列標(biāo)記(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos 等(2006)開(kāi)發(fā)的 dCAPS標(biāo)記雖然不能將澳洲青蘋(píng)等品種與一些著色品種區(qū)分開(kāi)，但可以區(qū)分其它一些著色與非著色品種，可以完全區(qū)分雜交親本植株(粉紅女士姊妹株、金帥)及其后代植株，在雜交后代植株的早期選擇中利用價(jià)值高。該dCAPS標(biāo)記的缺點(diǎn)是酶切后的片段長(zhǎng)度僅有29bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無(wú)法檢測(cè)，需要用價(jià)格約為7000元/ 125g的昂貴NuSieve GTG瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。通過(guò)進(jìn)一步分析MdMYBl基因序列，除dCAPS標(biāo)記涉及的位點(diǎn)外，我們找出其它2個(gè)與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出一個(gè)可用普通瓊脂糖電泳檢測(cè)的CAPS分子標(biāo)記，可鑒定蘋(píng)果植`株果實(shí)著色性狀，實(shí)驗(yàn)成本顯著降低。本發(fā)明的最初目的是利用MdMYBl基因中與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀相關(guān)的突變，開(kāi)發(fā)不需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切、用普通瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物即可鑒定蘋(píng)果植株果實(shí)著色性狀的分子標(biāo)記方法。結(jié)果不僅利用已知蘋(píng)果著色相關(guān)基因MdMYBl (GenBank登錄號(hào)DQ886414)中與蘋(píng)果著色性狀相關(guān)的三處堿基突變，開(kāi)發(fā)出新的分子標(biāo)記方法，而且發(fā)現(xiàn)基于MdMYBl基因中三處突變檢測(cè)的非著色性狀等位基因與蘋(píng)果雜交后代早結(jié)果性狀相關(guān)，此結(jié)果于2013年10月16日申請(qǐng)專(zhuān)利獲得受理(申請(qǐng)?zhí)?01310482643.X)。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上是雜交親本嘎拉蘋(píng)果中的非著色性狀等位基因與早結(jié)果性狀密切相關(guān)，含有雜交親本富士蘋(píng)果非著色性狀等位基因的植株結(jié)果少。在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1616bp和-1573bp位置的兩處突變皆可鑒別富士和嘎拉蘋(píng)果的非著色性狀等位基因:在_1616bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基為A的非著色性狀等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀；在-1573bp位置，植株含有堿基為T(mén)的非著色性狀等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀。
[0004]我們培育的富士蘋(píng)果為親本的另一個(gè)雜交群體27株植株，不含有嘎拉蘋(píng)果中的非著色性狀等位基因，開(kāi)始結(jié)果比富士與嘎拉的雜交后代晚2年，從另一方面說(shuō)明嘎拉蘋(píng)果中的非著色性狀等位基因與早結(jié)果性狀密切相關(guān)。
[0005]陳照峰等(1997)、張敏等(1998)報(bào)道金帥(又名金冠)是早結(jié)果品種，可在3~5年生時(shí)結(jié)果。鑒于本發(fā)明雜交親本之一嘎拉的親本是金帥，這些報(bào)道可進(jìn)一步佐證我們的發(fā)現(xiàn)，我們找出了在金帥、嘎拉蘋(píng)果中與早結(jié)果性狀關(guān)系密切的等位基因。等位基因與早結(jié)果性狀的關(guān)系屬于國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)，對(duì)于蘋(píng)果分子設(shè)計(jì)育種和分子輔助育種具有重要意義。
[0006]參考文獻(xiàn)
[0007][1]苑克俊，張毅，孫瑞紅，張振成.蘋(píng)果、葡萄花色苷生物合成研究進(jìn)展.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998.6:46-49.[0008][2]張學(xué)英，張上隆，駱軍，葉正文，李世誠(chéng).果實(shí)花色素苷合成研究進(jìn)展.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2004，21 (5):456-460.[0009][3] Takos, A.M.，Jaffe, F.ff.，Jacob, S.R.，Bogs, J.，Robinson, S.P.，Walker,A.R.Light-1nduced Expression of a MYB Gene Regulates Anthocyanin Biosynthesisin Red Apples.Plant Physiology,2006,142(3):1216-1232.[0010][4]Ban, Y., Honda, C., Hatsuyama, Y., Igarashi, M., Bessho, H.and Moriguchi,T.1solation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that isa key regulator for the development of red coloration in apple skin.Plant CellPhysiology,2007,48(7):958-970
[0011][5]苑克俊，黃立香，魏海蓉，劉慶忠.蘋(píng)果MdMYBl基因中與著色相關(guān)的兩處突變及其檢測(cè)方法.專(zhuān)利 ZL201010168149.2，2013-6-26
[0012][6]陳照峰，陳延惠，王杰，張建璐，王國(guó)新，馬喜成，宋建偉.蘋(píng)果主要經(jīng)濟(jì)性狀遺傳動(dòng)態(tài)的研究.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，31 (3) =239-243
[0013][7]張敏，丁玉英，謝重新，張景娥，高愛(ài)農(nóng)，沙守峰.金冠蘋(píng)果雜種后代的遺傳傾向.遺傳，1998，20 (增刊):95~97

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明基于蘋(píng)果MdMYBl基因突變與蘋(píng)果雜交后代早結(jié)果性狀相關(guān)，充分利用基因突變信息設(shè)計(jì)特異引物和配對(duì)引物，開(kāi)發(fā)出檢測(cè)突變的分子標(biāo)記方法，鑒定與蘋(píng)果早結(jié)果性狀密切相關(guān)的等位基因、進(jìn)而鑒定蘋(píng)果植株早結(jié)果性狀；本發(fā)明的分子標(biāo)記方法能夠同時(shí)鑒定出蘋(píng)果著色性狀。
[0015]本發(fā)明解決問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:已知蘋(píng)果著色相關(guān)基因MdMYBl (GenBank登錄號(hào)DQ886414)中有三處堿基突變與蘋(píng)果著色性狀相關(guān)，一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1624bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:G —A、G —G / A、G —A / T，蘋(píng)果植株堿基為A的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换?、含有堿基為G的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1603bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:C — A、C — C /A，蘋(píng)果植株堿基為A的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换颉⒑袎A基為C的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1550bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:T — C、T — T / C、T — C / A，蘋(píng)果植株堿基為C的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换?、含有堿基為T(mén)的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀。本發(fā)明充分利用這些基因突變信息設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于非著色性狀等位基因，另一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于果實(shí)著色性狀等位基因，另外設(shè)計(jì)兩個(gè)引物與兩個(gè)特異引物配對(duì)，并且設(shè)計(jì)引物時(shí)注意使兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小有足夠差異便于瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，然后利用這兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)突變，PCR產(chǎn)物直接用普通瓊脂糖電泳檢查，根據(jù)瓊脂糖電泳檢查結(jié)果鑒定蘋(píng)果雜交后代等位基因和果實(shí)著色性狀，并統(tǒng)計(jì)果實(shí)結(jié)果情況。出現(xiàn)非著色性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)為非著色性狀等位基因、出現(xiàn)果實(shí)著色性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)具有果實(shí)著色性狀。
[0016]蘋(píng)果著色相關(guān)基因MdMYBl (GenBank登錄號(hào)DQ886414)中的兩處堿基突變與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)，一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1616bp位置發(fā)生與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)的雜合突變:G —G / A，蘋(píng)果植株含有堿基為A的等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1573bp位置與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)的雜合突變:A —T / A，蘋(píng)果植株含有堿基為T(mén)的等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀。本發(fā)明充分利用前述-1624bp、-1603bp、-1550bp和-1616bp、_1573bp位置五處基因突變信息設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于早結(jié)果性狀等位基因，另一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于具有果實(shí)著色性狀的等位基因，另外設(shè)計(jì)兩個(gè)引物與兩個(gè)特異引物配對(duì)，并且設(shè)計(jì)引物時(shí)注意使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小有足夠差異便于瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，然后利用這兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)突變，PCR產(chǎn)物直接用普通瓊脂糖電泳檢查，根據(jù)瓊脂糖電泳檢查結(jié)果鑒定蘋(píng)果雜交后代等位基因和果實(shí)性狀。出現(xiàn)早結(jié)果性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)具有早結(jié)果性狀，出現(xiàn)果實(shí)著色性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)具有果實(shí)著色性狀。這些結(jié)果可用來(lái)對(duì)蘋(píng)果雜交后代植株早結(jié)果性狀進(jìn)行早期選擇，以便對(duì)具有早結(jié)果性狀的雜交后代植株加強(qiáng)管理，盡早獲得結(jié)果植株；也可以根據(jù)瓊脂糖電泳檢查結(jié)果選擇蘋(píng)果雜交親本，選出具有早結(jié)果性狀的親本進(jìn)行雜交，盡早獲得結(jié)果植株。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:(I)本發(fā)明新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記可用來(lái)鑒定蘋(píng)果早結(jié)果性狀和果實(shí)著色性狀。(2)與現(xiàn)有的鑒定蘋(píng)果`果實(shí)著色性狀的一個(gè)dCAPS標(biāo)記和一個(gè)CAPS標(biāo)記相比，本發(fā)明新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記鑒定方法更簡(jiǎn)單實(shí)用?，F(xiàn)有dCAPS標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后，片段長(zhǎng)度僅有29bp的差異，利用普通的瓊脂糖電泳無(wú)法檢測(cè)；我們發(fā)明的現(xiàn)有CAPS標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物片段差異大，可利用普通的瓊脂糖電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)成本降低，但仍然需要對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切；本發(fā)明新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記鑒定方法不需要對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。(3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明分子標(biāo)記方法可節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。現(xiàn)有dCAPS標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在3 %的NuSieve GTG瓊脂糖上進(jìn)行電泳檢測(cè)，NuSieve GTG瓊脂糖價(jià)格昂貴為6900元/ 125g ;現(xiàn)有CAPS標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在1.2%的普通瓊脂糖上電泳檢測(cè)，價(jià)格僅220元/ 100g。一次實(shí)驗(yàn)按100ml凝膠溶液計(jì)算，則現(xiàn)有dCAPS標(biāo)記實(shí)驗(yàn)瓊脂糖費(fèi)用165.6元，現(xiàn)有CAPS標(biāo)記實(shí)驗(yàn)瓊脂糖費(fèi)用2.64元，本發(fā)明分子標(biāo)記方法采用普通瓊脂糖電泳，費(fèi)用低，盡管增加一對(duì)引物費(fèi)用，但省去酶切步驟，可節(jié)省限制性?xún)?nèi)切酶費(fèi)用。(4)利用本發(fā)明可鑒定蘋(píng)果雜交后代早結(jié)果性狀，對(duì)蘋(píng)果雜交后代植株進(jìn)行早期選擇，對(duì)選出的雜交后代植株加強(qiáng)管理，盡早獲得結(jié)果植株；可選擇具有早結(jié)果性狀的蘋(píng)果親本進(jìn)行雜交，盡早獲得結(jié)果植株。[0018] 這里需要說(shuō)明的是:本發(fā)明所用2個(gè)蘋(píng)果品種富士、嘎拉為生產(chǎn)上栽培的品種，公眾能得到；本發(fā)明涉及基因序列為已知MdMYBl基因序列，不涉及核苷酸或氨基酸序列表。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是8個(gè)雜交后代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖中M為DNA分子量標(biāo)記，數(shù)字和bp為標(biāo)記大小與單位，1，2，3，4，5，6，7，8為8個(gè)雜交后代植株；
[0020]圖2是實(shí)施例18個(gè)雜交后代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中M為DNA分子量標(biāo)記，左側(cè)數(shù)字和 bp 為標(biāo)記大小與單位，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18 為18個(gè)雜交后代植株；
[0021]圖3是實(shí)施例8個(gè)雜交后代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中M為DNA分子量標(biāo)記，左側(cè)數(shù)字和bp為標(biāo)記大小與單位，I，2，3，4，5，6，7，8為8個(gè)雜交后代植株，Dr和Dg為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶代表的等位基因代號(hào)；
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0023]本發(fā)明方法實(shí)施步驟:
[0024]步驟1，試材:利用富士和嘎拉蘋(píng)果作為親本進(jìn)行雜交獲得種子，種子播種后獲得的蘋(píng)果雜交后代植株葉作為試材。
[0025]步驟2，基因組DNA提取:試材研磨后立即加入預(yù)熱至65°C的0.6mL2% CTAB提取緩沖液[2% CTAB，IOOmmol / L Tris-HCl (pH8.0),20mmol / L EDTA, 1.4mol / L NaCl,2%PVP-40,2% β -巰基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，這期間輕輕倒置樣品試管3次。取出加入0.6mL氯仿:異戍醇(24:1),輕輕翻轉(zhuǎn),充分混勻，12000rpm離心lOmin。將上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新試管，加入等體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，在12000rpm離心IOmin后將上清液移去。試管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙醇(_20°C )漂洗2次，將試管置于室溫下晾干，加入30~50 μ L滅菌無(wú)離子水或0.2Χ的TE,再加入IyL RNase A (2.5mg /ml)處理除去RNA，在4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫瑫簳r(shí)不用的DNA則冷凍保存。
[0026]步驟3，設(shè)計(jì)引物:在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1624bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基A的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换?、含有堿基為G的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1603bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基A的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换?、含有堿基為C的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1550bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基C的等位基因?yàn)榉侵誀畹任换颉⒑袎A基為T(mén)的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀，表明這三處基因突變位點(diǎn)堿基信息可直接用來(lái)鑒定蘋(píng)果果實(shí)著色性狀，可用來(lái)設(shè)計(jì)引物開(kāi)發(fā)鑒定蘋(píng)果果實(shí)著色性狀的分子標(biāo)記。本發(fā)明中，我們利用MdMYBl基因序列設(shè)計(jì)一個(gè)特異引物Mb4b (序列為ACCGGACCTATCTCATTCG)，對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1603bp位置的突變，用于檢測(cè)果實(shí)著色性狀；設(shè)計(jì)另一個(gè)特異引物Mb3h (序列為CCAACACCCGCTATGGTCC)，對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1550bp位置的突變，用于檢測(cè)非著色性狀等位基因；另外設(shè)計(jì)兩個(gè)配對(duì)引物Mb3a (序列為CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和 Mb2R(序列為 TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成 Mb3a 與 Mb4b、Mb3h 與 Mb2R 兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為便于瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，設(shè)計(jì)引物時(shí)注意控制兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小。[0027]步驟4，PCR擴(kuò)增:一對(duì)引物的PCR反應(yīng)液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPsdOmmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩沖液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 配對(duì)引物 Mb3a (10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的Taq DNA聚合酶和14.25 μ L水；PCR反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個(gè)循環(huán)后獲得PCR產(chǎn)物I。另一對(duì)引物的PCR反應(yīng)液(20 μ L)含有 0.5μ L(25ng)基因組 DNA、0.4yL dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq緩沖液、1.6 μ LMg2+ (25mmol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3h (10 μ mol/L)、0.5 μ L 配對(duì)引物Mb2R(10ymol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA 聚合酶和 14.25 μ L 水；PCR 反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個(gè)循環(huán)后獲得PCR產(chǎn)物2。也可以將兩對(duì)引物放在同一 PCR反應(yīng)液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但效果不如兩對(duì)引物分別擴(kuò)增后混合PCR產(chǎn)物。 [0028]步驟5，電泳檢查:將3 μ L PCR產(chǎn)物1、3 μ L PCR產(chǎn)物2、3 μ L水和I μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳檢查PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，有2個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)一條與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀有關(guān)的帶I (大小約380bp)，其果實(shí)為紅色；有2個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)一條與蘋(píng)果非著色性狀等位基因有關(guān)的帶2 (大小約420bp)，故其果實(shí)為非紅色；有4個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀有關(guān)的帶I和一條與蘋(píng)果非著色性狀等位基因有關(guān)的帶2，其果實(shí)為紅色。
[0029]步驟6，對(duì)于研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的富士蘋(píng)果非著色性狀等位基因Df和嘎拉蘋(píng)果非著色性狀等位基因Dg對(duì)早結(jié)果性狀的影響不同，利用MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1616bp和-1573bp位置的突變進(jìn)行鑒別。例如，利用MdMYBl基因序列設(shè)計(jì)一個(gè)序列為GGTCCGGTTCTATTTCGTAT的特異引物Mb3b，對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1573bp位置的突變，用于檢測(cè)嘎拉蘋(píng)果非著色性狀等位基因；另外設(shè)計(jì)一個(gè)序列為ACCGGACCTATCTCATTCG的特異引物Mb4b，對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1603bp位置的突變，用于檢測(cè)果實(shí)著色性狀；再設(shè)計(jì)兩個(gè)配對(duì)引物Mb3a (序列為CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和Mb2R (序列為T(mén)TCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成 Mb3a 與 Mb4b、Mb3b 與 Mb2R 兩對(duì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0030]步驟7，PCR擴(kuò)增:兩對(duì)引物的PCR反應(yīng)液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPsdOmmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩沖液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3b (10 μ mol / L)、0.5yL 配對(duì)引物Mb3a(10ymol / L)、0.5 μ L 配對(duì)引物 Mb2R(10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA聚合酶和13.25 μ L水；PCR反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個(gè)循環(huán)后獲得PCR產(chǎn)物。也可以按照步驟4的方法分別擴(kuò)增兩對(duì)引物。
[0031]步驟8，電泳檢查代表早結(jié)果性狀等位基因和代表著色性狀等位基因的PCR產(chǎn)物帶。
[0032]實(shí)施例1:本發(fā)明分子標(biāo)記法鑒定蘋(píng)果雜交后代植株早結(jié)果性狀
[0033]步驟1，試材:利用富士和嘎拉蘋(píng)果作為親本進(jìn)行雜交獲得種子，種子播種后獲得的蘋(píng)果雜交后代植株葉作為試材。
[0034]步驟2，基因組DNA提取:同前述實(shí)施步驟。
[0035]步驟3，設(shè)計(jì)引物:利用MdMYBl基因序列設(shè)計(jì)一個(gè)序列為ACCGGACCTATCTCATTCG的特異引物Mb4b，對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1603bp位置的突變，用于檢測(cè)果實(shí)著色性狀；設(shè)計(jì)另一個(gè)序列為ACCGGACCTATCTCATTCT的特異引物Mb4h，也是對(duì)應(yīng)于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1603bp位置的突變，用于檢測(cè)非著色性狀等位基因；另外設(shè)計(jì)兩個(gè)配對(duì)引物Mb3a (序列為 CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和 Mb2f (序列為 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)，形成 Mb2f 與Mb4b、Mb3a與Mb4h兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0036]步驟4，PCR擴(kuò)增:一對(duì)引物的PCR反應(yīng)液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因組DNA.0.4μ L dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩沖液、1.6 μ LMg2+(25mmol / L) ,0.5μ L特異引物 Mb4b(10ymol / L)、0.5 μ L 配對(duì)引物 Mb2f (10 μ mol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的Taq DNA聚合酶和14.25 μ L水；PCR反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72 °C引物延伸2min，35個(gè)循環(huán)后獲得PCR產(chǎn)物I。另一對(duì)引物的PCR反應(yīng)液(20yL)含有 0.5μ L(25ng)基因組 DNA、0.4μ L dNTPs(10mmol / L) ,2 μ LlOx Taq 緩沖液、1.6μ LMg2+(25mmol / L)、0.5 μ L 特異引物 Mb3a (10 μ mol / L)、0.5yL 配對(duì)引物Mb4h(10ymol / L) ,0.25μ L(5U / μ L)的 Taq DNA 聚合酶和 14.25 μ L 水；PCR 反應(yīng) 35 個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C變性30s、55°C退火Imin和72°C引物延伸2min，35個(gè)循環(huán)后獲得PCR產(chǎn)物2。
[0037]步驟5，電泳檢查與分析:將3 μ L PCR產(chǎn)物1、3 μ L PCR產(chǎn)物2、6 μ L水和I μ L上樣染料混合，溴化乙錠染色，在120V電壓、1.2%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳檢查PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，有5個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)一條與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀有關(guān)的帶I (大小約260bp)，其果實(shí)為紅色；有I個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)一條與蘋(píng)果非著色性狀等位基因有關(guān)的帶2 (大小約380bp)，故其果實(shí)為非紅色；有12個(gè)植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)一條與蘋(píng)果果實(shí)著色性狀有關(guān)的帶I和一條與蘋(píng)果非著色性狀等位基因有關(guān)的帶2，其果實(shí)為紅色。
[0038]利用前述本發(fā)明方法實(shí)施步驟中的分子標(biāo)記以及本實(shí)施例中的分子標(biāo)記，對(duì)123株蘋(píng)果雜交后代基因突變與雜交種子播種5年后結(jié)果情況進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯?，PCR產(chǎn)物僅出現(xiàn)代表非著色等位基因的較大帶時(shí)結(jié)果率高，PCR產(chǎn)物出現(xiàn)較小帶、含有著色等位基因時(shí)結(jié)果率降低，PCR產(chǎn)物僅出現(xiàn)較小帶、含有兩個(gè)著色等位基因時(shí)結(jié)果率最低，這說(shuō)明較大PCR產(chǎn)物帶代表的非著`色等位基因與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)。我們2012年的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。123株蘋(píng)果雜交后代中，2012年結(jié)果的2株是含非著色等位基因的。
[0039]表1不同基因型后代植株結(jié)果情況
PCR產(chǎn)物帶基因型預(yù)測(cè)顏色植株數(shù)~結(jié)果株數(shù)結(jié)果率(％)
【權(quán)利要求】
1.蘋(píng)果MdMYBl基因的三處已知堿基突變，一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1624bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:G — A、G — G / A、G — A / T，含有堿基為G的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1603bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:C — A、C — C / A，含有堿基為C的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；另一處在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1550bp位置發(fā)生突變或者雜合突變:T — C、T — T / C、T-C / A，含有堿基為T(mén)的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；本發(fā)明基于這些基因突變開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記方法可用來(lái)鑒定蘋(píng)果著色性狀，要求2013年10月16日相同主題申請(qǐng)(在先申請(qǐng)?zhí)?01310482643.X)的優(yōu)先權(quán)，其特征包括以下步驟: 步驟1:提取DNA樣本； 步驟2:利用上述MdMYBl基因突變?cè)O(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于果實(shí)著色性狀等位基因，另一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于另一個(gè)等位基因，另外設(shè)計(jì)兩個(gè)引物與兩個(gè)特異引物配對(duì)； 步驟3:進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟4:普通瓊脂糖電泳檢查PCR產(chǎn)物； 步驟5:根據(jù)電泳結(jié)果鑒定蘋(píng)果雜交后代:在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1624bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基為G的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游_1603bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基為C的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀；在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1550bp位置，蘋(píng)果植株含有堿基為T(mén)的等位基因時(shí)具有果實(shí)著色性狀。
2.蘋(píng)果MdMYBl基因的兩處突變，其特征是:在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1616bp處的堿基發(fā)生與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)的雜合突變:G —G / A，蘋(píng)果植株含有堿基為A的等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀；在MdMYBl-1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1573bp處的堿基發(fā)生與蘋(píng)果早結(jié)果性狀相關(guān)的雜合突變:A — T / A，蘋(píng)果植株含有堿基為T(mén)的等位基因時(shí)具有早結(jié)果性狀；對(duì)于兩處突變，檢測(cè)任何一處突變的分子標(biāo)記方法可用來(lái)鑒定蘋(píng)果早結(jié)果性狀，包括以下步驟: 步驟1:提取DNA樣本； 步驟2:利用上述MdMYBl基因突變?cè)O(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于早結(jié)果性狀等位基因，另一個(gè)特異引物對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述果實(shí)著色性狀等位基因，另外設(shè)計(jì)兩個(gè)引物與兩個(gè)特異引物配對(duì)； 步驟3:進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟4:普通瓊脂糖電泳檢查PCR產(chǎn)物； 步驟5:根據(jù)電泳結(jié)果鑒定蘋(píng)果雜交后代:出現(xiàn)早結(jié)果性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)具有早結(jié)果性狀，出現(xiàn)果實(shí)著色性狀等位基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物帶時(shí)具有果實(shí)著色性狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記方法，其特征是:可用于對(duì)蘋(píng)果雜交后代果實(shí)著色性狀進(jìn)行早期選擇，對(duì)選出的雜交后代植株加強(qiáng)管理。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記方法，其特征是:可用于對(duì)蘋(píng)果雜交后代植株早結(jié)果性狀進(jìn)行早期選擇，對(duì)選出的雜交后代植株加強(qiáng)管理，盡早獲得較多的結(jié)果植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記方法，其特征是:可用于分子設(shè)計(jì)育種，選出具有早結(jié)果性狀的親本進(jìn)行雜交，盡早獲得較多的結(jié)果植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103614373SQ201310618025
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】苑克俊, 王長(zhǎng)君, 王絳輝, 辛力, 周廣芳, 李林光, 沈廣寧 申請(qǐng)人:山東省果樹(shù)研究所