一種測定人體中甘膽酸含量的試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特征在于包括：甘膽酸R1試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；本發(fā)明通過用偶聯(lián)在蛋白上的甘膽酸包被膠乳顆粒并懸浮在特定緩沖液中制作R2試劑。將甘膽酸首先通過化學鍵偶聯(lián)在大分子蛋白上，形成多個位點，而分子量較大的蛋白可以更好的與膠乳顆粒結合，偶聯(lián)有甘膽酸的蛋白進一步通過化學交聯(lián)方法包被在膠乳顆粒表面。本發(fā)明通過在特定緩沖液中加入甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物制作R1試劑，特定緩沖液中要添加無機鹽、促凝劑、蛋白質(zhì)和防腐劑。本發(fā)明試劑極大地提高了免疫反應的信號強度，使低含量物質(zhì)在免疫結合時也能產(chǎn)生較強的濁度反應，以供檢測。
【專利說明】一種測定人體中甘膽酸含量的試劑盒及制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學【技術領域】，具體涉及一種采用免疫競爭法、膠乳增強比濁法測定人體中甘膽酸(CG)含量的試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]血清甘膽酸(Cholyglycine，CG)是膽酸與甘氨酸結合二次的結合型膽酸之一，在肝細胞內(nèi)，膽固醇經(jīng)過及其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(⑶-CA)。膽酸的類固醇核上有三個羥基(C3、C7、C12)，側鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨酸結合，CG由肝細胞合成，經(jīng)毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物消化。95%膽酸在回腸末端重吸收，經(jīng)門靜脈再回肝臟，由肝細胞攝取再利用。在血清中主要以蛋白結合形式存在。正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐后，其血清CG濃度穩(wěn)定在低水平。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙，而返流血液循環(huán)的CG含量增高，也使血CG含量增高。測定血清甘膽酸(CG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標之一。另外孕婦在懷孕的中后期，由于嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙而導致甘膽酸偏高，另外由于妊娠期胎盤合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代謝負荷增大，可誘發(fā)肝膽系統(tǒng)的變化，使孕婦易患妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)，對胎兒產(chǎn)生嚴重的影響，隨ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早產(chǎn)率、胎兒宮內(nèi)窘迫率及剖宮產(chǎn)率增高，嚴重者可導致嬰兒的死亡，因此測定孕婦血清甘膽酸，對及早發(fā)現(xiàn)ICP和了解ICP的嚴重程度有著非常重要的意義，甘膽酸的測定可作為篩查和隨訪ICP的指標。從而降低圍產(chǎn)兒病死率。甘膽酸是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機酸，進入腸腔幫助脂肪消化吸收，在回腸和結腸大部分被重吸收，經(jīng)門靜脈入肝臟。肝細胞能高效能地從門靜脈攝取大量的甘膽酸，以致血液中的甘膽酸量小于1.9g/ml。重吸收的甘膽酸又進入肝腸循環(huán)，通過這種機制，機體能充分利用甘膽酸。一旦肝細胞病變，血中的甘膽酸濃度升高，其中急性肝炎、慢性肝炎輕度升高，肝硬變，肝癌病人顯著升高。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙，而返流血液循環(huán)的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，測定血清甘膽酸(CG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標之一。
[0003]目前已知的甘膽酸測定方法有放射免疫法(RIA)、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法、膠乳增強比濁法等，放射免疫分析法步驟繁瑣，試劑價格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染。酶聯(lián)免疫吸附法存在檢測時間長、操作復雜、重復性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要?，F(xiàn)有膠乳增強免疫比濁法雖然操作簡單、快速、但是靈敏度低，低值重復性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為了避免現(xiàn)有技術存在的不足之處，提供一種能夠應用到全自動化生化分析儀器上甘膽酸(CG)試劑盒及其制備方法。該試劑能夠快速、準確的檢測人血漿樣本中的甘膽酸含量。
[0005]本發(fā)明通過用偶聯(lián)在蛋白上的甘膽酸包被膠乳顆粒并懸浮在特定緩沖液中制作R2試劑。由于甘膽酸分子量非常小，只有一個抗原位點，不能制成膠乳試劑，抗原與抗體的反應不能形成膠聯(lián)而產(chǎn)生濁度，只能讓甘膽酸首先通過化學鍵偶聯(lián)在大分子蛋白上，形成多個位點，而分子量較大的蛋白可以更好的與膠乳顆粒結合，偶聯(lián)有甘膽酸的蛋白濃度為0.1-2.0mg/mL。偶聯(lián)有甘膽酸的蛋白進一步通過化學交聯(lián)方法包被在膠乳顆粒表面。
[0006]本發(fā)明通過在特定緩沖液中加入甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物制作Rl試劑，特定緩沖液中要添加無機鹽、促凝劑、蛋白質(zhì)和防腐劑。所選擇的甘膽酸-蛋白復合體首先要通過間接ELISA方法檢測，確認不會產(chǎn)生非特異性反應。其中要求緩沖液的緩沖能力為調(diào)節(jié)pH范圍在7-9之間，可以選擇各種緩沖液，優(yōu)選HEPES、甘氨酸、Tris等，與其他緩沖液相比，上述緩沖液具有緩沖能力強、溶解度高、很好的生物適應性和反應。其中Tris-HCl能較長時間控制恒定的PH范圍，因此更優(yōu)選Tirs-HCl，其濃度范圍為lO-lOOmM，pH范圍為7_8。促凝劑選擇PEG-6000，可以加快免疫反應速度，縮短檢測時間，其終濃度為2-6%。蛋白質(zhì)選擇牛血清白蛋白，終濃度為0.1-1%。氯化鈉濃度為0.7-0.9%，疊氮鈉濃度為0.05-0.1%。
[0007]本發(fā)明通過在特定緩沖液中添加甘膽酸濃度分別為0、2.5、10、20、40、80ug/mL制作多點校準品，其中要求緩沖液的緩沖能力為調(diào)節(jié)PH范圍在7-9之間，可以選擇各種緩沖液，優(yōu)選HEPES、甘氨酸、Tri s等，與其他緩沖液相比，具有緩沖能力強、溶解度高、很好的生物適應性和反應。其中Tris-HCl能較長時間控制恒定的pH范圍，因此更優(yōu)選Tirs-HCl，其濃度范圍為10-200mM，pH范圍為7-8。其中含有特定的蛋白穩(wěn)定劑如牛血清白蛋白濃度為
0.1-1%，含有特定的防腐劑如PC-300濃度為0.05-0.5%，含有特定的抗氧化劑如EDTA_2Na濃度為5-50mM。
[0008]本發(fā)明提供用于測量在人血漿、血清樣品中的甘膽酸競爭免疫比濁測定方法，該方法是將含有甘膽酸的人血漿、血清樣本與甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物競爭結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒，與甘膽酸結合的甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒不產(chǎn)生濁度，而與甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒會產(chǎn)生濁度變化，甘膽酸與甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒結合優(yōu)于甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物結合甘膽酸-蛋白抗體膠乳顆粒結合的效率，估樣本中甘膽酸含量越高，反應所產(chǎn)生的濁度越低。下降的程度與人血漿、血清中的甘膽酸含量成正t匕，使用全自動生化分析儀器可以計算出人血漿、血清樣本中甘膽酸的含量。
[0009]本發(fā)明具體技術方案如下:
[0010]一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特點在于包括:甘膽酸Rl試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品；
[0011]所述甘膽酸Rl試劑由甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物和緩沖液組成，所述緩沖液為濃度IO-1OOmM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8 ;所述緩沖液中含有濃度2_6wt%的PEG-6000,0.7-0.9wt% 的氯化鈉、0.05-0.lwt% 的疊氮鈉、0.3wt% 的 PC-300,0.l_lwt% 牛血清白蛋白以及20mM EDTA ;所述甘膽酸Rl試劑中甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的濃度為0.05_2mg/mL ;所述甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物是通過偶聯(lián)劑將甘膽酸和蛋白偶聯(lián)后獲得；所述甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物中蛋白濃度為0.1-2.0mg/mL ；
[0012]所述甘膽酸R2試劑由懸浮緩沖液和甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒組成，所述懸浮緩沖液為含有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0%TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1% ;所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量分數(shù)為0.05-1.0% ；
[0013]所述甘膽酸校準品是由人源性甘膽酸和緩沖液組成，所述緩沖液為濃度50_200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.l-lwt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉；所述甘膽酸校準品包括人源性甘膽酸濃度分別為O、
2.5、5、10、20、40、80ug/ml 的一組校準品；
[0014]本發(fā)明試劑盒，其特點還在于:
[0015]與甘膽酸偶聯(lián)的蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛轉鐵蛋白、血藍蛋白中的一種亞型或多種亞型的混合；所述偶聯(lián)劑選自碳化二亞胺、戊二醛、二異氰酸化合物或二鹵化二硝基苯中的一種或多種。
[0016]所述膠乳顆粒為核殼結構，直徑范圍為100-450nm，濃度為l_5mg/mL ;所述膠乳顆粒的表面帯有由羧基、氨基、羥基、酰肼基或氯甲基修飾的化學基團；所述甘膽酸-蛋白抗體與膠乳顆粒本身攜帶的化學基團通過化學鍵結合在膠乳顆粒表面。
[0017]本發(fā)明同時公開了一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒的制備方法，其特點征在于包括如下步驟:
[0018]一、甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的制備:
[0019]I)準確稱取2mg甘膽酸，將其溶解在100 μ I DMF試劑中，所得溶液為A液；用DMF配制89.4mg/mL的NHS溶液,所的溶液為B液；用DMF配制60.2mg/mL的二環(huán)己基碳二亞胺溶液，所得溶液為C液；稱取16mg血藍蛋白，將其溶解在ImL pH7.2、濃度0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中；所得溶液為D液；
[0020]2)分別取B液和C液各30.7 μ L加到100 μ I A液中，室溫下攪拌90min ；
[0021]3)將攪拌完畢的混合液加到D液中，在4°C條件下攪拌12h ；
[0022]4)將步驟3)處理的反應液放入pH7.4、濃度0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中透析12h，即得到甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物；
[0023]二、甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒制備:
[0024]I)以步驟一所得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物皮下免疫小鼠；選擇免疫后血清效價大于10000的小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過BSA-CG板篩選得到甘膽酸單克隆細胞抗體；
[0025]2)把1.5g膠乳顆粒加入150mlPH5.5、濃度80mmol/L的2-嗎啉代乙磺酸緩沖液中，攪拌30分鐘；然后添加0.067mg/ml的碳化二亞胺20ml以及0.033mg/ml的N輕基琥拍酰亞胺20ml，常溫反應45分鐘；
[0026]3)把經(jīng)步驟2)反應后的混合物，以15000轉/mim離心15分鐘，去上清液，然后用150ml PH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得到膠乳顆?；鞈乙?；
[0027]4)將所得的膠乳顆?；鞈乙褐貜筒襟E3)，重復后所得到的膠乳顆粒混懸液進行清洗；清洗后，用濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至700ml ；
[0028]5)將180mg甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300ml PH8.2,0.lmol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻；加入到步驟4)的膠乳溶液中；然后置于37度的搖床中，反應2-4個小時；再加Λ 0.5g/ml甘氨酸10ml，再次反應30分鐘；
[0029]6)步驟5)反應結束后，將5g牛血清白蛋白加到上述混合液中，攪拌均勻后，室溫放置12h ;然后9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500ml PH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得膠乳顆?；鞈乙?；
[0030]7)將所得到的膠乳顆?；鞈乙涸俳?jīng)9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500ml PH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；將再次重懸后所得的膠乳顆?；鞈乙河肞H8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至IOOOml ;所得溶液即為甘膽酸_蛋白抗體包被的膠乳顆粒；
[0031]三、甘膽酸Rl試劑的制備
[0032]將步驟一制備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物與緩沖液充分混合即得甘膽酸Rl試齊U，所述緩沖液為濃度IO-1OOmM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8 ;所述緩沖液中含有濃度2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化鈉、0.05-0.lwt%的疊氮鈉、0.3wt%的PC-300,0.l_lwt%牛血清白蛋白以及20mM EDTA ;所述甘膽酸Rl試劑中甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的濃度為0.05-2mg/mL ；
[0033]四、甘膽酸R2試劑的制備
[0034]將步驟二制備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩沖液為含有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0%TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1% ;所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量濃度為
0.05-1.0%。
[0035]五、甘膽酸校準品的制備
[0036]向緩沖液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一組校準品；所述緩沖液為濃度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.l-lwt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉。
[0037]與已有技術相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在:
[0038]1、本發(fā)明膠乳比濁試劑極大地提高了免疫反應的信號強度，使低含量物質(zhì)在免疫結合時也能產(chǎn)生較強的濁度反應，以供檢測。
[0039]2、本發(fā)明競爭免疫比濁測定方法的好處在于抗干擾性更強，與傳統(tǒng)免疫比濁法試劑相比，在低值部分信號強度更大，因人體中甘膽酸的正常范圍是0-2.5ug/ml，低值部分的準確性，對于臨床應用來說是最重要的部分，競爭法試劑就讓低值測試的重復性和準確性得到了極大的提高。
[0040]3、本發(fā)明基于一個特異性針對甘膽酸的單克隆抗體和交聯(lián)有甘膽酸-人血清白蛋白的膠乳顆粒懸浮液，在特定的反應體系中發(fā)生抗原抗體反應形成一定的濁度，能夠被基于分光光度計的生化分析儀檢測到。而人血漿中如果有游離狀態(tài)的甘膽酸存在，會與固定在膠乳顆粒表面的甘膽酸競爭結合單克隆抗體，使?jié)岫认陆?，通過測定反應后體系濁度的降低程度來對甘膽酸進行定量分析。
[0041]5、本發(fā)明同時解決了甘膽酸檢測的特異性和自動化程度低的問題，可以廣泛推廣應用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0042]圖1是本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒檢測結果相關性線性回歸方程。
[0043]圖2是本發(fā)明試劑盒對甘膽酸純品檢測的線性回歸方程。
【具體實施方式】
[0044]以下通過具體實施例對本發(fā)明技術方案做進一步解釋說明。
[0045]以下實施例中所使用到試劑均為市售產(chǎn)品，實施例中所涉及的鑒定方法、篩選方法等均為本領域常規(guī)技術手段。
[0046]實施例1肝膽酸-蛋白偶聯(lián)物制備
[0047]一、試劑準備:
[0048]A液:準確稱取2mg甘膽酸，將其溶解在100 μ I DMF試劑中；Β液:用DMF配制89.4mg/mL的NHS溶液；C液:用DMF配制60.2mg/mL的DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)溶液；D液:稱取16mgBSA (牛血清白蛋白)，將其溶解在ImL pH為7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶液中。
[0049]本發(fā)明實施例中的磷酸鹽緩沖液均選自市售磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉或磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液。
[0050]二、試劑配置:
[0051]1、分別取B液和C液各30.7 μ L加到100 μ I A液中，室溫下攪拌90min。
[0052]2、攪拌完畢的混合液加到D液中并劇烈混合，在4°C條件下攪拌12h。
[0053]3、把反應液放入pH為7.4濃度0.0111101/1 PBS溶液中透析12h，即得到甘膽酸-蛋
白偶聯(lián)物。
[0054]三、肝膽酸-蛋白復合體的鑒定:
[0055]1、人工合成抗原的紫外鑒定用紫外分光光度法對BSA標準品、偶聯(lián)產(chǎn)物和甘膽酸進行紫外掃描，根據(jù)偶聯(lián)產(chǎn)物最大吸收峰的位移判斷是否偶聯(lián)成功。如果最大吸收峰與BSA標準品或甘膽酸一致的話，表示未偶聯(lián)成功，若偶聯(lián)產(chǎn)物最大吸收峰與BSA標準品最大吸收峰產(chǎn)生偏移，則表示偶聯(lián)成功。采用本發(fā)明方法所得偶聯(lián)產(chǎn)物收率為80%。
[0056]實施例2甘膽酸單抗制備
[0057]1、制備
[0058]以KLH蛋白偶聯(lián)CG后皮下免疫BalB/c小鼠(BalB/c為市售小鼠品種)，經(jīng)過四次免疫(一次初免三次加強免疫)，取免疫效果理想(即采用間接ELISA法鑒定免疫后血清效價大于10000的)的BalB/c小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞(由ATCC提供)進行融合，通過BSA-CG板篩(現(xiàn)有儀器)選得到甘膽酸單克隆細胞抗體。
[0059]2、關于肝膽酸單克隆抗體的篩選以及鑒定
[0060]鑒定小分子單抗，選用“BSA-CG包被ELISA板”通過競爭ELISA實驗，與游離CG有競爭抑制反應的抗體就是特異性針對CG的單抗。競爭關系越明顯，說明對CG親和力越高，反之說明親和力越弱。
[0061]實施例3肝膽酸-蛋白抗體與乳膠反應物制備
[0062]1、把1.5g乳膠顆粒(該顆粒為核殼結構,其乳核是聚苯乙烯聚合物,乳殼由苯乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物組成，其表面所帯的化學基團不同可以選自羧基、氨基、羥基、酰肼基、氯甲基修飾的一種；膠乳顆粒直徑范圍為100-450nm，市場購買獲得，如JSR公司提供的型號為P0220型羧基微球)加入PH為5.5，濃度為80毫摩爾/L的2-嗎啉代乙磺酸緩沖液150ml中，攪拌30分鐘；
[0063]2、往上述溶液中，添加碳化二亞胺20毫升(濃度為0.067mg/ml)以及N羥基琥珀酰亞胺20毫升(濃度為0.033mg/ml)，反應45分鐘。
[0064]3、把上述混合物，放置在轉速為15000轉/mim離心15分鐘，去掉上清液，用PH為8.2,濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液150ml重懸。如溶液無法立即重懸,可以使用超聲儀器對溶液進行超聲。
[0065]4、重復第3步，重懸后所得膠乳顆?；鞈乙?，用H為8.2，濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至700ml。
[0066]5、把180mg甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300ml PH8.2,0.lmol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻。然后緩慢的加入到第4步的膠乳溶液中。
[0067]6、抗體添加完畢后，把上述乳膠混合物置于37度的搖床中，反應2-4個小時。
[0068]7、反應完全后,把0.5g/ml甘氨酸IOml加到上述混合中，反應30分鐘
[0069]8、反應完全后，把5g牛血清白蛋白加到上述混合中，攪拌均勻后，室溫放置12h。
[0070]9、把上述混合物，放置在轉速為9000轉/mim離心15分鐘，去掉上清液，用PH為
8.2，濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液500ml重懸，得到膠乳顆粒混懸液。如溶液無法立即重懸，可以使用超聲儀器對溶液進行超聲。
[0071]10、將所得到的膠乳顆粒混懸液再經(jīng)9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500ml PH 8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；將再次重懸后所得的膠乳顆?；鞈乙河肞H8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至1000ml ;所得溶液即為甘膽酸_蛋白抗體包被的膠乳顆粒。
[0072]實施例4、甘膽酸Rl試劑的制備
[0073]將步驟一制備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物與緩沖液充分混合即得甘膽酸Rl試齊U，所述緩沖液為濃度IO-1OOmM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8 ;所述緩沖液中含有濃度2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化鈉、0.05-0.lwt%的疊氮鈉、0.3wt%的PC-300 (市售產(chǎn)品，supelco公司，商品名proclin300)、0.l_lwt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA ;所述甘膽酸Rl試劑中甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的濃度為0.05-2mg/mL ；
[0074]實施例5甘膽酸R2試劑的制備
[0075]將步驟二制備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩沖液為含有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0%TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1% ;所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量濃度為
0.05-1.0%。
[0076]實施例6甘膽酸校準品的制備
[0077]向緩沖液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一組校準品；所述緩沖液為濃度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.l-lwt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉。
[0078]以上實施例中所用防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞、PC-300和乙基汞硫代硫酸鈉中的一種或兩種以上。促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖鈉、聚乙烯吡絡
烷酮中的一種。
[0079]三、試劑盒的測定方法
[0080]分析方法:兩點終點法
[0081]反應方向:上升反應
[0082]校準方式:logit_log(4p)或SPLINE
[0083]測定波長:570nm
[0084]測定溫度:37°C
[0085]樣本:甘膽酸Rl試劑:甘膽酸R2試劑=5:200:50 (ul)
[0086]操作步驟:將200ul試劑Rl加入5ul樣本，37°C孵育5分鐘后加入50ul試劑R2，I分鐘后讀取吸光度Al，3分鐘后讀取吸光度A2。
[0087]采用6點定標法，用日立7180全自動生化分析儀進行檢測，校準品濃度分別為:0、2.5、10、20、40、80ug/mL
[0088]四、試劑盒的性能評價實驗
[0089]1、線性相關性
[0090]將實施例4-6制備的本發(fā)明試劑盒與市售甘膽酸化學發(fā)光法檢測試劑盒A對比檢測102份血清樣本，比較本發(fā)明試劑盒與市售甘膽酸化學發(fā)光法檢測試劑盒檢測結果的相關性。(結果見圖1，X，Y軸均為測定值，單位mg/L。)相關系數(shù)r=0.9940，線性回歸方程為:y=l.019x-0.014，結果表明本發(fā)明試劑與酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結果相關性較好。實驗數(shù)據(jù)如表I所示，回歸方程見附圖1。
[0091]表I
[0092]
【權利要求】
1.一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特征在于包括:甘膽酸Rl試劑；甘膽酸R2試劑和甘膽酸校準品； 所述甘膽酸Rl試劑由甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物和緩沖液組成，所述緩沖液為濃度IO-1OOmM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8 ;所述緩沖液中含有濃度2_6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化鈉、0.05-0.lwt%的疊氮鈉、0.3wt%的PC_300、0.1_^^%牛血清白蛋白以及20mM EDTA ;所述甘膽酸Rl試劑中甘膽酸_蛋白偶聯(lián)物的濃度為0.05-2mg/mL ;所述甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物是通過偶聯(lián)劑將甘膽酸和蛋白偶聯(lián)后獲得；所述甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物中蛋白濃度為 0.1-2.0mg/mL ； 所述甘膽酸R2試劑由懸浮緩沖液和甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒組成，所述懸浮緩沖液為含 有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0%TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1% ;所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量分數(shù)為0.05-1.0% ； 所述甘膽酸校準品是由人源性甘膽酸和緩沖液組成，所述緩沖液為濃度50-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.l-lwt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉；所述甘膽酸校準品包括人源性甘膽酸濃度分別為O、2.5、5、10、20、40、80ug/ml 的一組校準品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特征在于，與甘膽酸偶聯(lián)的蛋白選自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛轉鐵蛋白、血藍蛋白中的一種亞型或多種亞型的混合；所述偶聯(lián)劑選自碳化二亞胺、戊二醛、二異氰酸化合物或二鹵化二硝基苯中的一種或多種。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒，其特征在于，所述膠乳顆粒為核殼結構，直徑范圍為100-450nm，濃度為l_5mg/mL ;所述膠乳顆粒的表面帯有由羧基、氨基、羥基、酰肼基或氯甲基修飾的化學基團；所述甘膽酸-蛋白抗體與膠乳顆粒本身攜帶的化學基團通過化學鍵結合在膠乳顆粒表面。
4.一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟: 一、甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的制備: 1)準確稱取2mg甘膽酸，將其溶解在100μ I DMF試劑中，所得溶液為A液；用DMF配制89.4mg/mL的NHS溶液，所的溶液為B液；用DMF配制60.2mg/mL的二環(huán)己基碳二亞胺溶液，所得溶液為C液；稱取16mg血藍蛋白，將其溶解在ImL pH7.2、濃度0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中；所得溶液為D液； 2)分別取B液和C液各30.7 μ L加到100 μ I A液中，室溫下攪拌90min ； 3)將攪拌完畢的混合液加到D液中，在4°C條件下攪拌12h； 4)將步驟3)處理的反應液放入pH7.4、濃度0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中透析12h，即得到甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物； 二、甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒制備: I)以步驟一所得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物皮下免疫小鼠；選擇免疫后血清效價大于10000的小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過BSA-CG板篩選得到甘膽酸單克隆細胞抗體；. 2)把1.5g膠乳顆粒加入150mlPH5.5、濃度80mmol/L的2-嗎啉代乙磺酸緩沖液中，攪拌30分鐘；然后添加0.067mg/ml的碳化二亞胺20ml以及0.033mg/ml的N羥基琥拍酰亞胺20ml，常溫反應45分鐘； . 3)把經(jīng)步驟2)反應后的混合物，以15000轉/mim離心15分鐘，去上清液，然后用150mlPH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得到膠乳顆?；鞈乙?； . 4)將所得的膠乳顆?；鞈乙褐貜筒襟E3)，重復后所得到的膠乳顆?；鞈乙哼M行清洗；清洗后，用濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至700ml ； . 5)將180mg甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300mlPH8.2,0.lmol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻；加入到步驟4)的膠乳溶液中；然后置于37度的搖床中，反應2-4個小時；再加入,0.5g/ml甘氨酸10ml，再次反應30分鐘； .6)步驟5)反應結束后，將5g牛血清白蛋白加到上述混合液中，攪拌均勻后，室溫放置.12h ;然后9000轉/mim離心15 分鐘，去上清液，用500ml PH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得膠乳顆粒混懸液； .7)將所得到的膠乳顆粒混懸液再經(jīng)9000轉/mim離心15分鐘，去上清液，用500mlPH8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；將再次重懸后所得的膠乳顆?；鞈乙河肞H8.2、濃度0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至1000ml ;所得溶液即為甘膽酸_蛋白抗體包被的膠乳顆粒； 三、甘膽酸Rl試劑的制備 將步驟一制備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物與緩沖液充分混合即得甘膽酸Rl試劑，所述緩沖液為濃度IO-1OOmM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8 ;所述緩沖液中含有濃度 2-6wt% 的 PEG-6000,0.7-0.9wt% 的氯化鈉、0.05-0.lwt% 的疊氮鈉、0.3wt% 的 PC-300、.0.l_lwt%牛血清白蛋白以及20mM EDTA ;所述甘膽酸Rl試劑中甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的濃度為 0.05_2mg/mL ； 四、甘膽酸R2試劑的制備 將步驟二制備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩沖液為含有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-NaOH緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt%的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt%的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0%TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1% ;所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量濃度為.0.05-1.0%。 五、甘膽酸校準品的制備 向緩沖液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一組校準品；所述緩沖液為濃度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度.0.l-lwt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉。
【文檔編號】G01N33/531GK103940816SQ201410159298
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】芮雙印 申請人:安徽大千生物工程有限公司