一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，使用光化學聚合方法或電化學聚合方法進行分子印跡膜合成，提高結(jié)合容量、降低延遲時間并增強特異性吸附能力；同時，使用石英晶振片作為傳感器的效應(yīng)器，提高傳感器靈敏度、增加穩(wěn)定性并降低成本。從而增強傳感器性能，實現(xiàn)了對微囊藻毒素的痕量檢測，建立了高靈敏度、快速、低成本、低操作要求的微囊藻毒素檢測手段。
【專利說明】 —種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微囊藻毒素檢測傳感器領(lǐng)域，具體為一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]長江中下游地區(qū)是我國淡水湖泊集中分布的地區(qū)之一，在過去的幾十年里，人類活動對本地區(qū)的湖泊生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了極大的影響，最突出的是城郊湖泊的日益富營養(yǎng)化。湖泊、水庫和河流中接納過多的氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)，使水體的生態(tài)結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，導致藻類特別是藍藻的異常繁殖生長而出現(xiàn)藍藻水華現(xiàn)象。隨著水體富營養(yǎng)化的加劇而引起的有害藻類水華的頻繁發(fā)生已成為普遍關(guān)注的環(huán)境問題。當藍藻水華嚴重時，不僅影響人的感官、破壞健康平衡的水生生態(tài)系統(tǒng)，而且藻細胞破裂后釋放出的多種藻毒素對人和動物的飲用水安全構(gòu)成了嚴重的威脅。在已發(fā)現(xiàn)的各種藻毒素中，微囊藻毒素是目前已知的一種在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素，因此對微囊藻毒素的檢測十分必要。
[0003]目前對微囊藻毒素的檢測方法主要是化學分析法和免疫學檢測法。在化學檢測方法中使用較多的是高效液相色譜(HPLC)技術(shù)。HPLC技術(shù)一般采用正相或反相色譜對毒素進行分離，然后進行紫外(UV)、熒光(FL)或化學發(fā)光(CL)檢測，可廣泛用于微囊藻毒素的分離、鑒定和定量檢測。將被測毒素與標準毒素的滯留時間進行比較可對被測毒素進行鑒定，將兩者的峰面積進行比較可對其進行精確定量。但HPLC方法技術(shù)含量高，價格昂貴；另外必須備有標準純毒素或某毒素在相同實驗條件下的保留值。由于當前世界塑料制品中塑料添加劑的廣泛應(yīng)用，采集水樣的塑料容器中某些塑料添加劑會干擾HPLC對微囊藻毒素的檢測。免疫學檢測法主要是酶聯(lián)免疫分析(ELISA)，應(yīng)用此類分析方法篩選毒素的優(yōu)點是靈敏度高、在處理大批樣品時分析速度快、工作原理簡單。在具備微囊藻毒素單克隆抗體、標準純毒素和有關(guān)試劑的前提下，尤其是使用商品化的試劑盒時，ELISA方法是一種非常簡便、高效、快速的方法。缺點是不能很好鑒別毒素，會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因此，目前缺少一種更好的微囊藻毒素檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，以解決現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的問題。
[0005]為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:包括石英晶振片，及設(shè)置在石英晶振片表面的金基底，所述金基底上通過光聚合或電化學聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜，由石英晶振片、金基底、微囊藻毒素分子印跡膜構(gòu)成微囊藻毒素檢測傳感器芯片，所述微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝后構(gòu)成微囊藻毒素壓電檢測傳感器。
[0006]所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:采用光聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將制備好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液滴加到通過^ 硫醇或十二硫醇修飾的金基底上后，使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進行光交聯(lián)反應(yīng)，然后使用乙酸乙醇等體積比混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜，所述微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔。
[0007]所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:采用電化學聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，金基底作為工作電極，鉬電極作為負電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、3-APBA和氯化鈉按照1:10:10左右的摩爾濃度比制得乙醇混合溶液作為反應(yīng)溶液，使用范圍在0.1V到+1.4V之間并以20mV/s變化的電壓循環(huán)進行電化學聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜，所述微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔。
[0008]所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可制作其它毒素的檢測傳感器。
[0009]所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝時，采用PMMA制作下底及蓋合在下底上的上蓋，微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝在下底中，在上蓋上設(shè)置進樣管道、出樣管道，上蓋和進樣管道、出樣管道使用環(huán)氧樹脂進行粘合，下底和上蓋使用通過螺桿和螺母安裝為一體。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:` (I)采用了分子印跡技術(shù)作為傳感器的敏感層，增強了對微囊藻毒素的特異性識別、吸附效率，提高了檢測手段的特異性以及縮短了檢測時間。
[0011](2)采用光聚合方法和電化學聚合方法合成分子印跡膜，降低了延遲時間、提高了吸附容量、增強了特異性識別能力，提高了傳感器的性能。
[0012](3)使用了石英晶振片膜作為傳感器的效應(yīng)器，降低了成本、提高了靈敏度，提高了傳感器的性能。
[0013](4)整個傳感器操作簡單、快速，對操作人員要求低，為實現(xiàn)對微囊藻毒素的實時監(jiān)測提供了有力幫助。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為石英晶振片傳感芯片不意圖，其中:
圖1a為整體結(jié)構(gòu)示意圖，圖1b為微囊藻毒素分子印跡膜的微觀結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015]圖2為石英晶振片傳感芯片封裝結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖3為本發(fā)明應(yīng)用的測試系統(tǒng)示意圖。
[0017]圖4為本發(fā)明測試結(jié)果圖。
[0018]圖5為本發(fā)明應(yīng)用的便攜小型化測試儀器示意圖?！揪唧w實施方式】
[0019]如圖1所示。一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，包括石英晶振片1，及設(shè)置在石英晶振片I表面的金基底2，金基底I上通過光聚合或電化學聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜3，由石英晶振片1、金基底2、微囊藻毒素分子印跡膜3構(gòu)成微囊藻毒素檢測傳感器芯片6，微囊藻毒素檢測傳感器芯片6封裝后構(gòu)成微囊藻毒素壓電檢測傳感器。
[0020]采用光聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將制備好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5摩爾比制得的乙醇混合溶液滴加到通過^ 硫醇或十二硫醇修飾的金基底上后，使用365± 10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進行光交聯(lián)反應(yīng)，然后使用乙酸乙醇等體積比混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子5，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜3，微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔4。
[0021]采用電化學聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，金基底作為工作電極，鉬電極作為負電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、3-APBA和氯化鈉按照1:10:10摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液作為反應(yīng)溶液，使用范圍在0.1V到+1.4V之間并以20mV/s變化的電壓循環(huán)進行電化學聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子5，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜3，微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔4 。
[0022]通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可制作其它毒素的檢測傳感器。
[0023]微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝時，采用PMMA制作下底及蓋合在下底7上的上蓋8，微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝在下底7中，在上蓋8上設(shè)置進樣管道10、出樣管道11，上蓋8和進樣管道10、出樣管道11使用環(huán)氧樹脂進行粘合，下底7和上蓋8使用通過螺桿和螺母9安裝為一體。
[0024]本發(fā)明中，針對傳感器檢測對特異性、檢測速度的需要，本發(fā)明提出使用分子印跡技術(shù)作為傳感器的敏感層，分子印跡技術(shù)的原理是模板分子與功能單體在分散介質(zhì)中，依靠相互作用力以及空間位阻效應(yīng)等，形成可逆結(jié)合的復合物，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑引發(fā)聚合形成多孔功能材料，并且將模板分子有規(guī)律地包在其中，合成后用特定方法把模板分子去除，從而獲得能與模板分子互補、并具有特異識別功能的三維孔穴，從而快速、高特異性的結(jié)合模版分子。
[0025]本發(fā)明中，在傳感器上修飾分子印跡膜的傳統(tǒng)方法主要是涂布方法，首先制備毫米級或納米級的分子印跡聚合物顆粒，再將聚合物顆粒包埋于凝膠或膜內(nèi)，采用旋轉(zhuǎn)涂布或噴霧涂布制得識別層，這種方法帶來的問題是傳感器響應(yīng)時間延長、對目標分子產(chǎn)生非特異性吸附和結(jié)合容量低。
[0026]本發(fā)明提出使用原位聚合方法在傳感器上修飾分子印跡膜，根據(jù)不同情況采用光聚合和電化學聚合。光聚合是把聚合體系混合液涂布在傳感器上，在惰性氣體的保護下，紫外光引發(fā)聚合，除去模板分子后，制得分子印跡膜；電化學方法是在電化學反應(yīng)池中，在一定的電勢下提供電子，引發(fā)聚合，制得識別層。這兩種方法可以直接在原位制得識別層，避免了傳統(tǒng)方法的弊端，而且重復性好、環(huán)境友好。
[0027]本發(fā)明中，針對傳感器對高靈敏度、低成本、簡便的需要，本發(fā)明提出使用石英微天平作為傳感器的效應(yīng)器，這種低成本、高靈敏度的壓電感應(yīng)器件能夠快速靈敏的檢測到傳感器表面低至IOng的質(zhì)量變化，而且器件穩(wěn)定，抗干擾能力強。通過在效應(yīng)器表面修飾的分子印跡膜結(jié)合微囊藻毒素引起表面質(zhì)量的改變，從而引起效應(yīng)器信號發(fā)生改變，利用信號采集系統(tǒng)采集記錄信號變化，就能夠檢測出樣品中的微囊藻毒素。
[0028]本發(fā)明中，針對檢測對快捷使用的需求，本發(fā)明提出利用該傳感器體積小、功耗低的優(yōu)勢，進行封裝、集成，制成小型化、便攜的檢測設(shè)備；并且利用低成本的優(yōu)勢，傳感器芯片可以一次性使用，降低了對使用人員的要求，方便使用。
[0029]具體實施例:
針對微囊藻毒素分子印跡膜3的合成，本發(fā)明采用了光聚合合成方法，石英晶振片使用氧氣等離子體清洗器清洗2-4分鐘，在50-1000 mM十一硫醇的乙醇溶液或十二硫醇的乙醇溶液中浸泡12小時以上,取出后乙醇沖洗,氮氣吹干；取0.1-200 umol微囊藻毒素和1-2000 umol甲基丙烯酸于1_2 mL乙醇溶液混合靜置3小時以上，加入2-2000 umol 二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.016-16 mg 二苯甲酮，氮氣處理10分鐘以上；向傳感器基底表面滴加100 uL配置好的反應(yīng)溶液，在氮氣保護環(huán)境中使用365±10 nm紫外光照射進行光交聯(lián)反應(yīng)，待表面微干后繼續(xù)滴加反應(yīng)溶液，重復10次以上，再使用乙醇和乙酸等體積比混合溶液流動沖洗12小時以上,完成后乙醇沖洗除去表面洗脫液,氮氣吹干。
[0030]針對微囊藻毒素分子印跡膜3的合成，本發(fā)明還采用了電化學聚合合成方法，石英晶振片使用氧氣等離子體清洗器清洗2-4分鐘；配置1-100 mmol/L 3-APBA、0.01_1 mg/mL微囊藻毒素和100 mmol氯化鈉混合溶液，氮氣處理10分鐘以上，室溫靜置2小時以上；金電極作為工作電極，鉬電極作為負電極，Ag/AgCl做參比電極，配置好的溶液為反應(yīng)溶液，電化學工作站按20mV/s從-0.1V到+1.4V循環(huán)5次。使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液流動沖洗基底24小時以上，完成后乙醇沖洗除去表面洗脫液，氮氣吹干。
[0031]針對石英晶振片傳感芯片6的封裝，如圖2所示，使用PMMA制作下底7，帶通道上蓋8，使用環(huán)氧樹脂粘合進樣管道10、出樣管道11和上蓋8，使用螺桿、螺母9固定下底7和上蓋8 ;針對Lamb傳感芯片16的封裝，使用PMMA制作下底17，上蓋18，使用環(huán)氧樹脂粘合進樣管道19、出樣管道20和上蓋18以及下底17和上蓋18。
[0032]針對系統(tǒng)測試，如圖3所示，使用蠕動泵12作為進樣系統(tǒng)，傳感器13接入信號分析儀器14進行測試。使用10 umol/L和I umol/L微囊藻毒素標準溶液樣品以及檢驗特異性效果的一個九肽10 umol/L溶液加入傳感器系統(tǒng)進行測試，測試結(jié)果如圖4所示，在待測微囊藻毒素樣品濃度低至I umol/L時，傳感器也表現(xiàn)了 30 Hz的顯著信號變化，對于非微囊藻毒素樣品，傳感器未表現(xiàn)信號變化，表現(xiàn)傳感器特異性良好。
[0033]針對便攜小型化的要求，如圖5所示，將傳感器15、信號分析模塊16、顯示模塊17集成封裝。
【權(quán)利要求】
1.一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:包括石英晶振片，及設(shè)置在石英晶振片表面的金基底，所述金基底上通過光聚合或電化學聚合方法修飾有微囊藻毒素分子印跡膜，由石英晶振片、金基底、微囊藻毒素分子印跡膜構(gòu)成微囊藻毒素檢測傳感器芯片，所述微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝后構(gòu)成微囊藻毒素壓電檢測傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:采用光聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用甲基丙烯酸作為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯作為交聯(lián)劑，二苯甲酮作為引發(fā)劑，將制備好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液滴加到通過十一硫醇或十二硫醇修飾的金基底上后，使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射進行光交聯(lián)反應(yīng)，然后使用乙酸乙醇等體積比混合溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜，所述微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:采用電化學聚合方法在金基底上修飾微囊藻毒素分子印跡膜過程如下:首先使用3-APBA作為功能單體和交聯(lián)劑，金基底作為工作電極，鉬電極作為負電極，Ag/AgCl作為參比電極，微囊藻毒素、 3-APBA和氯化鈉按照1:10:10左右摩爾濃度比制得的乙醇混合溶液作為反應(yīng)溶液，使用范圍在0.1V到+1.4V之間并以20mV/s變化的電壓循環(huán)進行電化學聚合反應(yīng)，然后使用含3%乙酸和0.1%吐溫-20的乙醇溶液做洗脫液洗脫微囊藻毒素分子，在金基底上形成微囊藻毒素分子印跡膜，所述微囊藻毒素分子印跡膜上具有對微囊藻毒素特異性識別并均勻分布的微孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:通過更改功能單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑的種類，可制作其它毒素的檢測傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子印跡技術(shù)的微囊藻毒素壓電檢測傳感器，其特征在于:所述微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝時，采用PMMA制作下底及蓋合在下底上的上蓋，微囊藻毒素檢測傳感器芯片封裝在下底中，在上蓋上設(shè)置進樣管道、出樣管道，上蓋和進樣管道、出樣管道使用環(huán)氧樹脂進行粘合，下底和上蓋使用通過螺桿和螺母安裝為一體。
【文檔編號】G01N33/569GK103760052SQ201310713093
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月21日
【發(fā)明者】周連群, 何皓, 李傳宇, 張志強, 董文飛, 王弼陡 申請人:中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所