專利名稱：一種水中微囊藻毒素的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水中微囊藻毒素的檢測方法，屬于微囊藻毒素檢測技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
環(huán)境污染造成的水體富營養(yǎng)化所引起的有害藍(lán)藻水華的頻繁發(fā)生，已成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題。微囊藻毒素(MCs)為有害的藍(lán)藻水華釋放的一類具有強(qiáng)烈促癌作用的肝毒素，已發(fā)現(xiàn)60多種異構(gòu)體。微囊藻毒素性質(zhì)穩(wěn)定，煮沸后不失活，不揮發(fā)，抗PH變化， 溶于水、甲醇和丙酮。微囊藻毒素對生物體損害主要表現(xiàn)為肝臟毒性和神經(jīng)毒性，對腎、腎上腺、肺及胃等也有不同程度的損傷。藍(lán)藻水華及其毒素已列為微生物和有機(jī)污染物的檢測項(xiàng)目，并已有國家推薦水中微囊藻毒素的安全濃度為1.0yg/L。我國的“生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范”和“城市供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)”中都規(guī)定MC-LR的最高含量為1. 0 μ g/L。
對于微囊藻毒素的檢測方法主要有傳統(tǒng)的小鼠腹腔注射生物分析法、酶聯(lián)免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析方法，但這些方法都存在操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)且不能鑒定MC的種類等缺點(diǎn)，而常用的高效液相色譜法(HPLC)，樣品耗樣量大且污染環(huán)境。毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(CE-MS)雖然所需樣品少、分離效率高，還可以通過分子量信息確認(rèn)MCs的種類，但是這種方法需要昂貴的設(shè)備，專業(yè)的技能，高的成本而且費(fèi)時(shí)。因此迫切需要發(fā)明一種快速，靈敏的微囊藻毒素的檢測方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水中微囊藻毒素的檢測方法，該方法可快速，靈敏的檢測水中的藻毒素。
本發(fā)明提供的一種水中微囊藻毒素的檢測方法，包括如下步驟
(1)將微囊藻毒素的單克隆抗體連接到磁性納米顆粒上并分散于水或磷酸鹽緩沖溶液，得到連接有所述微囊藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒(MAb-MPs)溶液；
(2)將拉曼探針分子吸附于銀納米顆粒上并用二氧化硅進(jìn)行包覆得到包覆有二氧化硅層的銀納米顆粒，然后將所述微囊藻毒素連接到所述包覆有二氧化硅層的銀納米顆粒上并分散于水或磷酸鹽緩沖溶液得到連接有所述微囊藻毒素的拉曼探針分子(MC-SERS Tags)溶液；
(3)將至少3種不同濃度所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液與所述連接有微囊藻毒素的拉曼探針分子溶液混合得到孵育液A ；將所述孵育液A與所述連接有微囊藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒溶液混合并進(jìn)行反應(yīng)得到磁性免疫復(fù)合物A ；測定所述磁性免疫復(fù)合物A的拉曼光譜，得到拉曼光譜的峰強(qiáng)與所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線.一入 ，
(4)將含有微囊藻毒素的待測水溶液與所述連接有微囊藻毒素的拉曼探針分子溶液混合得到孵育液B，所述待測水溶液與步驟( 中所述標(biāo)準(zhǔn)水溶液的體積相同；將所述孵育液B與所述連接有藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒溶液混合并進(jìn)行反應(yīng)得到磁性3免疫復(fù)合物B，所述反應(yīng)時(shí)間與步驟(3)中所述反應(yīng)時(shí)間相同；測定所述磁性免疫復(fù)合物B 的拉曼光譜，然后根據(jù)所述拉曼光譜的峰強(qiáng)與所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線即得待測水溶液中微囊藻毒素的濃度。
上述的檢測方法中，所述拉曼探針分子的結(jié)構(gòu)式如式(a)所示，其中，R選自H、 NH2、烷基、烷氧基、COOH和OH等，所述烷基具體可為碳原子數(shù)為1 5的烷基，所述烷氧基具體可為碳原子數(shù)為1 5的烷氧基，
權(quán)利要求
1.一種水中微囊藻毒素的檢測方法，包括如下步驟(1)將微囊藻毒素的單克隆抗體連接到磁性納米顆粒上并分散于水或磷酸鹽緩沖溶液中，得到連接有所述微囊藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒溶液；(2)將拉曼探針分子吸附于銀納米顆粒上并用二氧化硅進(jìn)行包覆得到包覆有二氧化硅層的銀納米顆粒，然后將所述微囊藻毒素連接到所述包覆有二氧化硅層的銀納米顆粒上并分散于水或所述磷酸鹽緩沖溶液中得到連接有所述微囊藻毒素的拉曼探針分子溶液；(3)將至少3種不同濃度的所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液與所述連接有微囊藻毒素的拉曼探針分子溶液混合得到孵育液A ；將所述孵育液A與所述連接有微囊藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒溶液混合并進(jìn)行反應(yīng)得到磁性免疫復(fù)合物A ；測定所述磁性免疫復(fù)合物A的拉曼光譜，得到拉曼光譜的峰強(qiáng)與所述藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)將含有微囊藻毒素的待測水溶液與所述連接有微囊藻毒素的拉曼探針分子溶液混合得到孵育液B，所述待測水溶液與步驟( 中所述標(biāo)準(zhǔn)水溶液的體積相同；將所述孵育液 B與所述連接有微囊藻毒素的單克隆抗體的磁性納米顆粒溶液混合并進(jìn)行反應(yīng)得到磁性免疫復(fù)合物B，所述反應(yīng)時(shí)間與步驟(3)中所述反應(yīng)時(shí)間相同；測定所述磁性免疫復(fù)合物B的拉曼光譜，然后根據(jù)所述拉曼光譜的峰強(qiáng)與所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線即得待測水溶液中微囊藻毒素的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述拉曼探針分子的結(jié)構(gòu)式如式(a) 所示，其中，R選自H、NH2、烷基、烷氧基、COOH或0H，(a)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述磁性納米顆粒為氧化鐵、金屬合金、鐵氧體、氧化鉻或氮化鐵；所述磁性納米顆粒度的粒徑為IOOnm 10 μ um。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的檢測方法，其特征在于所述銀納米顆粒的粒徑為 Inm 200nm ；所述二氧化硅層的厚度為Inm 30nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的檢測方法，其特征在于所述微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)水溶液的質(zhì)量體積濃度為0 50 μ g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)中在測定所述磁性免疫復(fù)合物A的拉曼光譜之前，還包括用所述磷酸鹽緩沖溶液洗滌所述磁性免疫復(fù)合物 A的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的檢測方法，其特征在于步驟⑷中在測定所述磁性免疫復(fù)合物B的拉曼光譜之前，還包括用所述磷酸鹽緩沖溶液洗滌所述磁性免疫復(fù)合物 B的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的檢測方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖溶液的組成如下=NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · H2O 1. 56g 和蒸溜水 1000ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水中微囊藻毒素的檢測方法。所述方法包括如下步驟(1)制備連接有微囊藻毒素的單克隆抗體的磁顆粒；(2)制備連接有微囊藻毒素分子的拉曼探針，所述拉曼探針是通過銀納米顆粒對小分子的拉曼增強(qiáng)制得的；(3)在所確定的最佳反應(yīng)條件下繪制微囊藻毒素的標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線；(4)通過測樣品拉曼光譜特定峰的峰強(qiáng)對比標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測樣品的濃度。所述檢測過程結(jié)合了激光拉曼增強(qiáng)和競爭免疫，同時(shí)在檢測過程中應(yīng)用了磁分離，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，大大縮短了檢測時(shí)間。本發(fā)明所提供的檢測方法還可用于水中其他種類藻毒素分子以及小分子的檢測，為水中污染物提供了一條快速、方便的檢測途徑。
文檔編號G01N21/65GK102507942SQ20111034390
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者張興華, 李津茹, 江龍 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所