用于觀察樣品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于觀察樣品的方法，所述方法包括以下步驟：a）提供基本上透明的介質(zhì)形成的物體（G，V），所述介質(zhì)具有第一折射率（nint）且包括凸形、圓形或多平面的第一表面（S1）和基本上平坦的第二表面（S2），所述第一表面將所述物體與周圍介質(zhì)（MA）分離開，所述周圍介質(zhì)具有低于所述第一折射率的第二折射率（next），待觀察的所述樣品包括在所述物體內(nèi)或沉積在所述第一表面上；b）通過所述基本上平坦的第二表面觀察所述樣品；以及c）通過在所述步驟b）期間檢測與所述物體相對應(yīng)的光環(huán)，確定所述樣品中的物質(zhì)或?qū)ο蟮拇嬖凇?br> 【專利說明】用于觀察樣品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于觀察樣品的方法，尤其用于生物或化學(xué)應(yīng)用，例如，用于檢測微生物或?qū)ξ⑸镉嫈?shù)以及研究化學(xué)反應(yīng)的動力學(xué)。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)優(yōu)選實施方式的方法基于使用包含待觀察樣品的微滴或所述樣品本身。由AB Theberge 等所著的文章“Microdroplets in Microfluidics:An Evolving Platform forDiscoveries in Chemistry and Biology” (Angew Chem Int Ed2010,49, 5846 - 5868)綜述了用于化學(xué)和生物學(xué)中的各種應(yīng)用中的基于使用液態(tài)微滴的微流體技術(shù)。術(shù)語“微滴”指直徑(或通常為主要尺寸)的范圍為Ιμπι至ΙΟΟμπι的液滴。
[0003]文獻(xiàn)US2005/0221339描述了一種用于對在微流體系統(tǒng)中操作的微滴中的化學(xué)成分進(jìn)行光學(xué)檢測的方法。
[0004]由 B Rotman 所著的文章 “Measurement of activity of single molecules ofβ-D-Galactosidase”,美國國家科學(xué)院院刊(Proceedings of the Natl Acad Sci USA),1961,47,第1981-1991頁,描述了一種用于檢測酶的分離的分子的方法。在該方法中，包含酶(高度稀釋的)和用于該酶的熒光基質(zhì)的水溶液被噴到在兩個顯微鏡用載玻片之間限定的小體積的硅酮油中?？紤]到該硅酮油密度小于水且不與水混溶，該溶液形成置于下顯微鏡用載玻片的上表面上的微滴。然后，借助顯微鏡，通過顯微熒光測定對液滴進(jìn)行分析。包括該酶的至少一個分子的液滴顯現(xiàn)為發(fā)光盤，而不包含所述分子的液滴顯現(xiàn)為發(fā)光環(huán)的形式。
[0005]這種方法的主要限制在于由熒光發(fā)出的光的強度低。當(dāng)液滴中包含的微觀尺寸的對象對光的散射(彈性散射或拉曼散射)被觀察到時，出現(xiàn)類似的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是通過提出一種用于觀察樣品的配置克服這種限制，這種配置提高了由樣品發(fā)出或散射的光的收集效率。然而，本發(fā)明不限于使用液滴，而包括液滴由固體介質(zhì)或凝膠形成的物體代替的情況。
[0007]因此，在一方面，本發(fā)明提供了一種用于觀察樣品的方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]a)提供基本上透明的介質(zhì)的物體，所述基本上透明的介質(zhì)具有第一折射率nint且具有凸形、圓形或多平面的第一表面和基本上平坦的第二表面，所述第一表面將所述物體與周圍介質(zhì)分離開，所述周圍介質(zhì)具有第二折射率next，待觀察的所述樣品由所述物體構(gòu)成或位于所述物體內(nèi)或沉積在所述第一表面上；以及
[0009]b)觀察所述樣品；
[0010]其特征在于:
[0011]-在步驟b)期間，通過所述基本上平坦的第二表面觀察所述樣品；以及[0012]-所述第二折射率低于所述第一折射率。
[0013]所述方法可以包括步驟C)，所述步驟c)用于根據(jù)在步驟b)期間觀察所述樣品的結(jié)果來確定所述樣品中的物質(zhì)或?qū)ο蟮拇嬖?。尤其是，對象可以是生物物種，如微生物，例如，細(xì)菌、酵母、真菌、病毒等。例如，待檢測的物質(zhì)可以溶解或分散在透明或半透明的介質(zhì)中。
[0014]樣品可以是液態(tài)的，例如，生物液體、離子性液體、水溶液或凝膠。在凝膠的情況下，例如，粘度可以在IcP (厘泊)至IOOOcP范圍內(nèi)，即，在KT3Pa.s至IPa.s范圍內(nèi)。
[0015]將在下面更詳細(xì)地描述，周圍介質(zhì)的折射率低于所述物體的折射率確保沿著凸形的所述第一表面(“光碗”)部分地導(dǎo)引由所述樣品發(fā)射或散射的光，這提高了在平坦的第二表面這一側(cè)上的光的檢測效率。與此相反，在現(xiàn)有技術(shù)(尤其參見上面引用的B Rotman的文章)中，通常使用具有較高的光學(xué)折射率的油中的水溶液的“反相乳液”，和/或通過凸面觀察樣品。
[0016]通常，該物體的直徑或主要尺寸可以在Ιμπι至Imm范圍內(nèi)，優(yōu)選在10 μ m至500 μ m的范圍內(nèi)。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的各種實施方式:
[0018]-所述物體可以是基本上半球形的形狀。這實際是使由樣品發(fā)射或散射的光的收集最大化的幾何形狀；
[0019]-所述物體可以是液滴，所述液滴附著到透明基板上而形成所述基本上平坦的第
二表面；
[0020]-所述步驟a)可以包括產(chǎn)生形成多個所述物體的多個液滴，所述多個液滴中的至少一些液滴包括至少一個待檢測的對象或物質(zhì)；以及所述步驟b)可包括同時觀察多個所述液滴；
[0021]-與此相反，所述物體可以是固體，在這種情況下，所述樣品可以由沉積在所述物體的第一表面上的層構(gòu)成。有利地，所述層可以是對分析物敏感的官能化層，所述分析物可能包括在所述周圍介質(zhì)中。當(dāng)所述物體是固體時，所述樣品還可以是放置成與所述物體的第一表面接觸的液態(tài)或粘性的樣品；
[0022]-所述物體可以由對分析物敏感的材料形成，所述分析物可能包括在所述周圍介質(zhì)中；
[0023]-所述周圍介質(zhì)可以是空氣；
[0024]-所述步驟b)可以包括照射所述物體的操作。優(yōu)選地，所述照射可以通過所述基本上平坦的第二表面進(jìn)行，以使其進(jìn)而可以從上述的光導(dǎo)引效應(yīng)受益。在不同的變型中:
[0025]-所述步驟b)可以包括檢測光信號，例如，熒光信號。在這種情況下，所述步驟b)可以通過落射熒光顯微術(shù)進(jìn)行；
[0026]-所述步驟b)可以包括檢測拉曼散射信號；
[0027]-所述步驟b)可以通過反射顯微術(shù)或透射顯微術(shù)進(jìn)行。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]根據(jù)結(jié)合附圖進(jìn)行的示例性描述，本發(fā)明的其它特征、細(xì)節(jié)和優(yōu)點將變得清楚，這些附圖分別表示:[0029]-圖1示出在液滴和具有較低折射率的周圍介質(zhì)(如空氣)之間的界面處傳播的各種光線路徑；
[0030]-圖2A和圖2B示出從液滴的位于所述界面附近的位置獲得的光線樣式；
[0031]-圖3是示出在穿過光源且垂直于所述第二表面的平面中，在該液滴的邊緣附近進(jìn)入該液滴的光的范圍的光線樣式；
[0032]-圖4A和圖4B示出上文所引用的由BRotman所著文章中描述的觀察設(shè)置的兩個光線樣式；
[0033]-圖5是示出本發(fā)明的優(yōu)點的對比試驗；
[0034]-圖6示出用于實施根據(jù)本發(fā)明的方法的實驗裝置；
[0035]-圖7A和圖7B分別示出根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式的方法的示意圖和使用該方法獲得的圖像；
[0036]-圖8A和圖SB分別示出根據(jù)本發(fā)明的第二實施方式的方法的示意圖和使用該方法獲得的圖像 ；
[0037]-圖9A和圖9B分別示出根據(jù)本發(fā)明的第三實施方式的方法的示意圖、使用該方法獲得的圖像以及這樣的圖像的細(xì)節(jié)；
[0038]-圖10是用于根據(jù)本發(fā)明的第四實施方式的方法的示意圖；
[0039]-圖11是用于根據(jù)本發(fā)明的第五實施方式的方法的示意圖；以及
[0040]-圖12A至圖12D示出物體形狀相對于半球的偏差的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041]圖1示出本發(fā)明所基于的物理現(xiàn)象?？紤](實際)折射率為nint的液滴G浸在(實際)折射率為next〈nint的周圍介質(zhì)MA中。在水滴在空氣中的情況下，nint=l.33〈next=l。
[0042]根據(jù)表面張力效應(yīng)，液滴呈現(xiàn)為直徑為R的基本上球形或截球形的形狀，如果R為約幾微米，由重力引起的變形在實際中可以忽略。
[0043]圖1示出在液滴G內(nèi)傳播的三條光線Rl、R2和R3，且這三條光線分別以入射角θρ 02和θ3觸及液滴表面Si。通常，入射角被定義為光線與表面的法線之間所形成的角。
[0044]所有以大于臨界角θ。(由給出，)的入射角觸及表面S1的光線發(fā)生




wIiu
全反射，且保持留在液滴內(nèi)部。在圖1的示例中，光線Rl (其中，θ1=θ。)和光線R2 (其中，Θ 2> Θ。)就是這種情況，而由于Θ 3< Θ。，光線R3離開液滴。
[0045]簡單的幾何推理可以證明發(fā)生全反射的光線保持局限在液滴表面SI附近，且距離液滴的中心的距離不能小于距離

nM
[0046]為了理解這種效果如何能夠有助于對對象(如微生物或熒光分子)進(jìn)行觀察，考慮在圖2中所示的情況，其示出了附著到透明支持體SS且浸在介質(zhì)MA(如，空氣)中的半球狀液滴G。和前面的情況一樣，nMt〈nint，基板的折射率nss可以小于nint或大于nint ;優(yōu)選地，nss不會太高(例如，小于2nint或等于2nint)，以使基板本身不封堵光線。光線由位于靠近液滴的半球形表面SI的位置處的熒光分子發(fā)出(S2表示與基板的接觸面)?？梢钥闯觯@些光線相當(dāng)大部分由空氣-水界面導(dǎo)向成呈“光碗”BL的形狀的層。這些光線在平坦表面S2的包括在內(nèi)半徑
【權(quán)利要求】
1.一種用于觀察樣品的方法，所述方法包括如下步驟: a)提供基本上透明的介質(zhì)形成的物體(G，V)，所述介質(zhì)具有第一折射率(nint)且具有凸形、圓形或多平面的第一表面(SI)和基本上平坦的第二表面(S2)，所述第一表面將所述物體與周圍介質(zhì)(MA)分離開，所述周圍介質(zhì)具有低于所述第一折射率的第二折射率Urait),待觀察的所述樣品由所述物體構(gòu)成或位于所述物體內(nèi)或沉積在所述第一表面上； b)通過所述基本上平坦的第二表面觀察所述樣品；以及 c)通過在所述步驟b)期間檢測與所述物體相匹配的發(fā)光環(huán)，確定所述樣品中的物質(zhì)或?qū)ο蟮拇嬖凇?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述物體具有基本上半球形的形狀。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述步驟c)包括確定所述樣品中的微生物的存在。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述物體是液滴，所述液滴附著到透明基板(SS)上而形成所述基本上平坦的第二表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中: -所述步驟a)包括產(chǎn)生形成多個所述物體的多個液滴，所述多個液滴中的至少一些液滴包括至少一個待檢測的對象或物質(zhì)；以及 -所述步驟b)包括同時觀察多個所述液滴。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述物體是固體，且所述樣品由沉積在所述物體的第一表面上的官能化層(CF)構(gòu)成，所述官能化層對可能包括在所述周圍介質(zhì)中的分析物敏感。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述物體由對分析物敏感的材料形成，所述分析物可能包括在所述周圍介質(zhì)中。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述周圍介質(zhì)是空氣。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述步驟b)包括用于照射所述物體的操作。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述照射從所述基本上平坦的第二表面這一側(cè)進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，所述步驟b)包括檢測熒光信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述步驟b)通過落射熒光顯微術(shù)進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，所述步驟b)包括檢測拉曼散射信號。
14.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中，所述步驟b)利用反射顯微術(shù)或透射顯微術(shù)進(jìn)行。
【文檔編號】G01N21/03GK103620376SQ201280019367
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月21日
【發(fā)明者】馬蒂厄·杜波伊, 皮埃爾·喬利, 弗萊德瑞克·馬勒拉瑞德, 皮埃爾·馬庫斯, 拉斐爾·馬泰, 阿爾梅·諾維利-盧梭 申請人:原子能與替代能源委員會, 生物梅里埃公司