一種特立齊酮中D-環(huán)絲氨酸含量的測定分析方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及用2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生D-環(huán)絲氨酸，用高效液相色譜法測定衍生物的含量，從而計算出特立齊酮中D-環(huán)絲氨酸的含量。此方法能較好的控制原料藥中D-環(huán)絲氨酸含量，為患者的健康用藥提供保障，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)背景特立齊酮，化學(xué)名4，4′-[1，4-Phenylenebis(methylidynenitrilo)]bis(isoxazolidin-3-one)為一種抗結(jié)核、麻風(fēng)分支桿菌類藥物。結(jié)構(gòu)如下：特立齊酮中含有反應(yīng)殘留或者降解產(chǎn)生的D-環(huán)絲氨酸，結(jié)構(gòu)如下：準(zhǔn)確定量地測定特立齊酮中的D-環(huán)絲氨酸含量極具挑戰(zhàn)性。D-環(huán)絲氨酸極性很大，不具備敏感的紫外吸收基團(tuán)，并且在酸堿條件下不夠穩(wěn)定。更為復(fù)雜的是特立齊酮本身在水存在的條件下，會生成D-環(huán)絲氨酸。其生成含量取決于系統(tǒng)中水的含量高低。其水解平衡如下：因此，很難采用氣相、液相色譜和其他分析手段對其進(jìn)行直接測定。此外，由于分析測定系統(tǒng)中存在有不確定量的水而產(chǎn)生不確定量的D-環(huán)絲氨酸使得分析結(jié)果的準(zhǔn)確性變得很不確定，常使分析結(jié)果偏高，并且無法控制結(jié)果的精密度。目前，測定特立齊酮中D-環(huán)絲氨酸含量的方法采用經(jīng)典的比色法，其專一性、靈敏度、方法精密度和重復(fù)性都存在很大的缺陷，不能提供可靠的分析結(jié)果。為了克服原方法的缺陷，本發(fā)明采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)作為衍生試劑與D-環(huán)絲氨酸形成穩(wěn)定的衍生物。形成的衍生物具備優(yōu)異的液相色譜分離和紫外檢測等特征。該分析方法具有專一性好、靈敏高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
如上所述，直接定量測定D-環(huán)絲氨酸存在各種缺陷。然而，利用D-環(huán)絲氨酸帶有伯胺基團(tuán)這一特征，可改造其特性使之轉(zhuǎn)化為適合定量分析的分子結(jié)構(gòu)。利用2，4-二硝基氟苯能快速定量地同胺基基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，而衍生試劑與D-環(huán)絲氨酸形成的衍生物具有穩(wěn)定性強(qiáng)和非常適合反相液相色譜分離的低極性特征。除此之外，該衍生物在長波長紫外區(qū)(348nm)有強(qiáng)烈吸收這一特征使本方法的靈敏度和專一性大大提高。衍生化學(xué)反應(yīng)式如下：通過試驗發(fā)現(xiàn)特立齊酮在二甲亞砜(DMSO)中有非常好的溶解性。本發(fā)明將用二甲亞砜(DMSO)作為稀釋劑。該分析方法的關(guān)鍵點(diǎn)是對分析系統(tǒng)中水份進(jìn)行嚴(yán)格控制。由于分析系統(tǒng)中含有不確定量的水，這些水將使特立齊酮水解產(chǎn)生不確定量的D-環(huán)絲氨酸，從而使測定結(jié)果偏高、重現(xiàn)性較差。為了確保系統(tǒng)中水份含量恒定，并低于可接受的實驗誤差，本發(fā)明在干燥的二甲亞砜(DMSO)反應(yīng)溶劑加入過量強(qiáng)脫水試劑N，N’-二環(huán)己基碳亞胺(DCC)。DCC的脫水機(jī)理如下：(本發(fā)明提到的DMSO即為二甲亞砜，DCC為N，N’-二環(huán)己基碳亞胺)在無水DMSO溶劑中進(jìn)行衍生反應(yīng)能準(zhǔn)確的定量特立齊酮中游離狀態(tài)的D-環(huán)絲氨酸，后繼色譜分離過程中，特立齊酮遇水產(chǎn)生的D-環(huán)絲氨酸不會干擾特立齊酮中原來存在的D-環(huán)絲氨酸的測定。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：樣品前處理：稀釋液，采用干燥DMSO加1％DCC(W/V)，密封于40C放置12h以上備用。衍生液，用稀釋液配制成約2mg/ml的DNFB溶液。標(biāo)準(zhǔn)D-環(huán)絲氨酸溶液，用稀釋液精密配制約60ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)D-環(huán)絲氨酸溶液。標(biāo)準(zhǔn)品衍生：精密加入500ul的標(biāo)準(zhǔn)D-環(huán)絲氨酸溶液于2ml的HPLC進(jìn)樣瓶中，然后精密加入500ul衍生液，放入恒溫烘箱中，40℃放置20min，迅速進(jìn)樣。樣品衍生：精密稱取約2mg樣品于2ml的HPLC進(jìn)樣瓶中，然后精密加入500ul稀釋液，再精密加入500ul衍生液，放入恒溫烘箱中，40℃放置20min，迅速進(jìn)樣。本發(fā)明使用色譜柱為：AgilentZorbaxXDB-C182.1mm*50mm3.5um色譜柱。流速1.0ml/min。柱溫40℃。流動相，A：水，B：乙腈，梯度如下：AB0min70％30％7min20％80％7.1min70％30％10min70％30％紫外檢測波長：348nm附圖說明：附圖1：根據(jù)本發(fā)明實施例1得到的DNP-衍生物紫外吸收圖；附圖2：根據(jù)本發(fā)明實施例1得到的D-環(huán)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生圖譜；附圖3：根據(jù)本發(fā)明實施例2得到的特立齊酮樣品衍生圖譜；附圖4：根據(jù)本發(fā)明實施例3得到的特立齊酮樣品加樣回收率圖譜。具體實施例為了更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合本發(fā)明的具體實施例作進(jìn)一步說明，但其不限制于本發(fā)明。實施例一儀器與條件：高效液相色譜儀：Agilent1260infinity，DAD檢測器。色譜柱：AgilentZorbaxXDB-C182.1mm*50mm3.5um流動相：A：水B：乙腈。梯度如下：0～7min，有機(jī)相比例從30％～80％。7min～7.1min，有機(jī)相比例從80％～30％。7.1min～10min，有機(jī)相比例保持30％。柱溫：40℃。進(jìn)樣體積：3ul。實驗步驟：(1)稀釋液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0gDCC，搖勻，密封，40C放置過夜。(2)衍生液B：50mgDNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液C：精密稱取約60mgD-環(huán)絲氨酸于10ml容量瓶中，加A定容，搖勻，精密吸取100ul于另一10ml容量瓶中，加A定容，即得C(標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度約60ug/ml)。(4)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別精密取500ulC和500ulB于2mlHPLC進(jìn)樣瓶中，蓋好蓋子，40°烘箱中放置20min，迅速進(jìn)樣。記錄色譜圖，見典型圖譜2。抽取衍生物峰的UV圖譜，見典型圖譜1。實施例二儀器與條件：高效液相色譜儀：Agilent1260infinity，DAD檢測器。色譜柱：AgilentZorbaxXDB-C182.1mm*50mm3.5um流動相：A：水B：乙腈。梯度如下：0～7min，有機(jī)相比例從30％～80％。7min～7.1min，有機(jī)相比例從80％～30％。7.1min～10min，有機(jī)相比例保持30％。柱溫：40℃。進(jìn)樣體積：3ul。實驗步驟：(1)稀釋液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0gDCC，搖勻，密封，40C放置過夜。(2)衍生液B：50mgDNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。(3)樣品溶液D：精密稱取約2.0mg特立齊酮樣品，分別精密取500ulA和500ulB于2mlHPLC進(jìn)樣瓶中，蓋好蓋子，40°烘箱中放置20min，迅速進(jìn)樣。記錄色譜圖，見典型圖譜3。實施例三儀器與條件：高效液相色譜儀：Agilent1260infinity，DAD檢測器。色譜柱：AgilentZorbaxXDB-C182.1mm*50mm3.5um流動相：A：水B：乙腈。梯度如下：0～7min，有機(jī)相比例從30％～80％。7min～7.1min，有機(jī)相比例從80％～30％。7.1min～10min，有機(jī)相比例保持30％。柱溫：40℃。進(jìn)樣體積：3ul。實驗步驟：(1)稀釋液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0gDCC，搖勻，密封，40C放置過夜。(2)衍生液B：50mgDNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液C：精密稱取約60mgD-環(huán)絲氨酸于10ml容量瓶中，加A定容，搖勻，精密吸取100ul于另一10ml容量瓶中，加A定容，即得C約60ug/ml。(4)樣品溶液E：精密稱取約2.0mg特立齊酮樣品，分別精密取500ulC和500ulB于2mlHPLC進(jìn)樣瓶中，蓋好蓋子，40°烘箱中放置20min，迅速進(jìn)樣。記錄色譜圖，見典型圖譜4。