專利名稱：分析vc生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種分析維生素C生產(chǎn)菌株混菌傳代培養(yǎng)過程小分子代謝物變化的方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高，維生素C(VC)在食品、藥品等方面的需求逐年增加。目前，我國多為“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)維生素C。第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混合發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。其中，第二步發(fā)酵中巨大芽孢桿菌為伴生菌，氧化葡糖桿菌為產(chǎn)酸菌。兩菌在混合發(fā)酵的過程中，通過相互作用促進(jìn)產(chǎn)酸菌的生長和產(chǎn)酸。通過混菌傳代培養(yǎng)，混菌發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的能力得到提高，但其作用機(jī)理尚不明確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分析檢測維生素C生產(chǎn)菌株傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物變化的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)和保藏于體積濃度為15_30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(BaciIIusmegaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C，培養(yǎng)24_48h ；②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在28-350C，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24_48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X107-2X101(lCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2X 108_2X 10nCFU/mL，在28-35°C，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24_48h為傳代周期，以體積比為1%_10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天得到混菌細(xì)胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-5個時間取樣,取3-5個樣；③分純將步驟(I)②獲得的3-5個樣的混菌細(xì)胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28-35°C培養(yǎng)24-48h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28_35°C，200-280rpm搖床振蕩培、養(yǎng)24-48h，分別得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中；④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107-2 X 1010CFU/mL,進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108_2 X 10nCFU/mL,在28-35°C，200-280rpm 搖床振蕩培養(yǎng) 10_15h ；(2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定①各取在步驟(I)④獲得的三種細(xì)胞懸液100 - 200mL，分別在1000 - 3000rpm離心3 - lOmin，去除上清液，保留細(xì)胞，用pH=7. 2-7.4的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞I _ 3次，相同條件離心，去除上清，得到細(xì)胞；
②將步驟(2)①所得細(xì)胞制成干粉，各稱取30 - 60mg細(xì)胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入0. 5 - I. 5mL提取液，加入30-70 ii L濃度為0. 020-0. 060mg/mL氘標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；1000 - 3000rpm離心3 - lOmin，取上清液置于三個新的離心
管中冷凍干燥；③將步驟(2)②獲得三個離心管中分別加入40-100 ii L濃度為10-30mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C -40°C水浴中肟化反應(yīng)60-120min ;再加入50-100 y LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C _40°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30-60min ；所述提取液為體積分?jǐn)?shù)為50-70%的甲醇水溶液；④ GC-TOF/MS 檢測將I ii L步驟(2)③獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i. d.，進(jìn)樣口溫度為250°C _280°C，載氣為高純氦氣，恒壓80-100KPa,分流比3 1-20 :1，柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C -80 °C,保持3min_6min，以4 °C /min-8 V /min的升到260 V -300 V，保持3min_8min，使用EI電離源，源溫230°C-260°C，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV_80eV，電流30 y A-50 y A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;小分子代謝物的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和代謝物相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照，得到小分子代謝物的相對含量；(3)主成分分析①將步驟(2)④獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的小分子代謝物的相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto預(yù)處理；②用SMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的小分子代謝物標(biāo)志物；(4)過程分析將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。所述細(xì)胞制成干粉的方法為液氮研磨細(xì)胞。本發(fā)明提供的一種分析檢測維生素C生產(chǎn)菌種傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物的方法，涉及代謝物的提取和分析檢測，通過對不同傳代時間的巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌以及混菌的小分子代謝物分別進(jìn)行定性和定量分析，找到與增強(qiáng)維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的代謝物分子和代謝途徑，為了解傳代培養(yǎng)促進(jìn)氧化葡糖桿菌生長及2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)的作用機(jī)理提供依據(jù)，為提高2 -酮基-L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向，為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。


圖I為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌小分子代謝物的主成分分析得分圖(圖1-1)和載荷圖(圖1-2)；圖2為不同傳代時間的氧化葡糖桿菌傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物標(biāo)志物的含 量變化；圖3為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌小分子代謝物的主成分分析得分圖(圖3-1)和載荷圖(圖3-2)；圖4為不同傳代時間的巨大芽孢桿菌傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物標(biāo)志物的含量變化；圖5為不同傳代時間的混菌小分子代謝物的主成分分析得分圖(圖5-1)和載荷圖(圖 5-2)；圖6為不同傳代時間的混菌傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物標(biāo)志物的含量變化；
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，并不對本發(fā)明作任何限制。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程小分子代謝物變化的方法，其特征是包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取液氮的IOOy L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和100 U L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，30°C,培養(yǎng)36h ;(2)種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在300C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)36h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X108CFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 101(lCFU/mL，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以36h為傳代周期，以體積比為5%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天得到混菌細(xì)胞，在傳代第0，50，100，150天時間點(diǎn)取4個樣；③分純
將步驟(I)②獲得的4個樣的混菌細(xì)胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)36h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)36h，分別得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中；④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X108CFU/mL,進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 101(lCFU/mL，在30°C，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)13h ；(2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定①各取在步驟(I)④獲得的三種細(xì)胞懸液150mL,分別在2000rpm離心5min,去除 上清液，保留細(xì)胞，用PH=7. 3的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞2次，相同條件離心，去除上清，得到細(xì)胞；②將步驟(2)①所得細(xì)胞用液氮研磨的方法制成干粉，各稱取50mg細(xì)胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入I. OmL提取液,加入50 ii L濃度為0. 040mg/mL氣標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；2000rpm離心5min，取上清液置于三個新的離心管中冷凍干燥；③將步驟(2)②獲得三個離心管中分別加入50y L濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C水浴中肟化反應(yīng)90min ;再加入80 u LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于37°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min ；所述提取液為體積分?jǐn)?shù)為50的甲醇水溶液；④GC-T0F/MS 檢測將Iy L步驟(2)③獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i.d.，進(jìn)樣口溫度為280°C，載氣為高純氦氣，恒壓91KPa，分流比10 :1，柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C，保持5min，以5°C /min的升到280°C，保持5min，使用EI電離源，源溫250°C，檢測器電壓2500V，電離電壓70eV，電流40 y A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;小分子代謝物的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和代謝物相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照，得到小分子代謝物的相對含量；(3)主成分分析①將步驟(2)④獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的小分子代謝物的相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto預(yù)處理；②用SMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的小分子代謝物標(biāo)志物；(4)過程分析將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)在混菌傳代培養(yǎng)過程中起關(guān)鍵作用的代謝物分子及相關(guān)代謝途徑，從而為揭示混菌傳代培養(yǎng)過程中兩菌的相互作用機(jī)制和以提高2-酮基L-古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向。以0、50、100和150代的氧化葡糖桿菌傳代培養(yǎng)的小分子代謝物的相對含量為樣本矩陣，進(jìn)行主成分分析(圖I)。其得分圖(圖1-1)明顯可以分為四類，其中150代明顯與0、50和100代的代謝物譜差異較遠(yuǎn)，O代與50代相距較近，說明其傳代進(jìn)化差異不是很大。圖2為區(qū)分氧化葡糖桿菌不同傳代時間的分子標(biāo)志物相對含量變化圖，其中十六烷酸、十八烯酸和十八烷酸隨著傳代時間的延長含量降低，說明細(xì)胞生長過程中消耗更多的脂肪酸生成細(xì)胞膜磷脂，因此游離脂肪酸在100代后顯著減少。以0、50、100和150代的巨大芽孢桿菌傳代培養(yǎng)的小分子代謝物的相對含量為樣本矩陣，進(jìn)行主成分分析(圖3)，從得分圖(圖3-1)中可以看出巨大芽孢桿菌不同傳代培養(yǎng)的代謝物譜差異較大，明顯分為四類。圖4為區(qū)分不同傳代時間巨大芽孢桿菌小分子代謝標(biāo)志物隨時間的變化其相對含量的變化趨勢圖。其中十六烷酸和十八烷酸隨著巨大芽孢桿菌傳代時間的延長含量顯著降低，說明細(xì)胞生長消耗更多的脂肪酸生成細(xì)胞膜磷脂，因此游離脂肪酸顯著減少。此外多數(shù)氨基酸，如脯氨酸和4-羥基脯氨酸顯著減少，5-氧脯氨酸和谷氨酰胺等的含量也都有較明顯的減少，也說明傳代過程中巨大芽孢桿菌消耗大量氨基酸用來維持自身生長，合成胞內(nèi)蛋白。以混菌細(xì)胞在傳代時間為0、50、100和150天時的小分子代謝物的相對含量為樣本矩陣進(jìn)行主成分分析(圖5)，得分圖(圖5-1)顯示O代與50、100和150代的混菌樣本明顯區(qū)分，說明混菌傳代培養(yǎng)過程中，由于兩菌的相互作用，其傳代進(jìn)化的菌株體系與原始出發(fā)菌體系明顯不同，但50代和100代較為接近，在第一主成分上不能明顯區(qū)分。圖6為區(qū)分不同傳代時間混菌小分子代謝物標(biāo)志物相對含量的變化趨勢圖。在這些標(biāo)志物中，多數(shù)氨基酸如脯氨酸、甘氨酸、4-羥基脯氨酸、5-氧脯氨酸和谷氨酰胺等隨著傳代時間的延長含量成降低趨勢，尤其是脯氨酸和5-氧脯氨酸在150代混菌中濃度達(dá)到最低，這兩種物質(zhì)是影響混菌發(fā)酵2-酮古龍酸產(chǎn)量的關(guān)鍵物質(zhì)。這些變化表明，隨著混菌傳代增加，兩菌相互作用更加協(xié)調(diào)，有助于目的產(chǎn)物的生成。實(shí)施例2 I. 一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的IOyL保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和10 μ L保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28°C,培養(yǎng)48h ;②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在280C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107CFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108CFU/mL，在28°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以48h為傳代周期，以體積比為1%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100天得到混菌細(xì)胞，在傳代0-100天選定3個時間取樣，取3樣，分別為O天、50天、100天；
③分純將步驟(I)②獲得的3樣的混菌細(xì)胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，分別得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15%的甘油水溶液中；④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 107CFU/mL,進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 108CFU/mL,在28°C，200rpm搖床振蕩培養(yǎng) 15h ；(2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定 ①各取在步驟(I)④獲得的三種細(xì)胞懸液IOOmL,分別在IOOOrpm離心IOmin,去除上清液，保留細(xì)胞，用pH=7. 2的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞I次，相同條件離心，去除上清，得到細(xì)胞；②將步驟(2)①所得細(xì)胞用液氮研磨細(xì)胞的方法制成干粉，各稱取30mg細(xì)胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入O. 5mL提取液,加入30 μ L濃度為O. 020mg/mL氣標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；1000rpm離心lOmin，取上清液置于三個新的離心管中冷凍干燥；③將步驟(2)②獲得三個離心管中分別加入40μ L濃度為10mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C水浴中肟化反應(yīng)60min ;再加入50 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30min ；所述提取液為體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇水溶液；④GC-T0F/MS 檢測將IyL步驟(2)③獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i.d.，進(jìn)樣口溫度為250°C，載氣為高純氦氣，恒壓80KPa，分流比3 :1，柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C，保持3min，以4°C /min的升到260°C，保持3min，使用EI電離源，源溫230°C，檢測器電壓2300V，電離電壓60eV，電流30 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;小分子代謝物的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和代謝物相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照，得到小分子代謝物的相對含量；(3)主成分分析①將步驟(2)④獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的小分子代謝物的相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto預(yù)處理；②用SMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的小分子代謝物標(biāo)志物；(4)過程分析將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。
實(shí)施例3一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，包括如下步驟(I)混菌傳代培養(yǎng)①固體培養(yǎng)取存于液氮的500 μ L保藏于體積濃度為30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和500 μ L保藏于體積濃度為30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上,35°C,培養(yǎng)24 ;②種子培養(yǎng)將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在350C，280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2X101(lCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2 X 10nCFU/mL，在35°C，280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24h為傳代周期，以體積比為10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代150天得到混菌細(xì)胞，在傳代0-150天中選定4個時間取樣，取4個樣，分別在第0、50、100和第150天取4個樣；③分純將步驟(I)②獲得的4個樣的混菌細(xì)胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，35°C培養(yǎng)24h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在35°C，280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24h，分別得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為30%的甘油水溶液中；④發(fā)酵將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2 X 1010CFU/mL,進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2 X 10nCFU/mL,在35°C，280rpm搖床振蕩培養(yǎng)10 ；(2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定①各取在步驟(I)④獲得的三種細(xì)胞懸液200mL,分別在3000rpm離心3min,去除上清液，保留細(xì)胞，用PH=7. 4的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞3次，相同條件離心，去除上清，得到細(xì)胞；②將步驟(2)①所得細(xì)胞用液氮研磨細(xì)胞的方法制成干粉，各稱取60mg細(xì)胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入I. 5mL提取液,加入70 μ L濃度為O. 060mg/mL氣標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；3000rpm離心3min，取上清液置于三個新的離心管中冷凍 干燥；③將步驟(2)②獲得三個離心管中分別加入100 μ L濃度為30mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于40°C水浴中肟化反應(yīng)120min ;再加入100 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于40°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)60min ；所述提取液為體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇水溶液；④GC-T0F/MS 檢測
將IyL步驟(2)③獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i. d.，進(jìn)樣口溫度為280°C，載氣為高純氦氣，恒壓lOOKPa，分流比20 :1，柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C，保持6min，以8°C /min的升到300°C，保持8min，使用EI電離源，源溫260°C，檢測器電壓2700V，電離電壓80eV，電流50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50-800m/z ;小分子代謝物的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和代謝物相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照，得到小分子代謝物的相對含量；(3)主成分分析①將步驟(2)④獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的小分子代謝物的相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto預(yù)處理；②用SMCA-P 11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的小分子代謝物標(biāo)志物；(4)過程分析將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。本發(fā)明提供了一種分析檢測維生素C生產(chǎn)菌種傳代培養(yǎng)過程中小分子代謝物的方法，涉及代謝物的提取和分析檢測，通過對不同傳代時間的巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌以及混菌的小分子代謝物分別進(jìn)行定性和定量分析，找到與增強(qiáng)維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的代謝物分子和代謝途徑，為了解傳代培養(yǎng)促進(jìn)氧化葡糖桿菌生長及2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)的作用機(jī)理提供依據(jù)，從而為進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)施例2和實(shí)施例3與實(shí)施例I的結(jié)果類似。本發(fā)明所采用的固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基的組成選自中國專利申請?zhí)枮?01110314740. 9公開的培養(yǎng)基，例如固體培養(yǎng)基按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 10g，瓊脂 20g，KH2PO4 Ig，MgSO4 O. 2g, CaCO3 lg，加水至 1L，調(diào) ρΗ=6· 8，121。C滅菌20min，制成固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 10g，KH2PO4 lg，MgSO4 0. 2g，CaCO3 lg，加水至 1L，調(diào) ρΗ=6· 8，121。C 滅菌 20min，
制成種子培養(yǎng)基。本發(fā)明所采用的菌株巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)CGMCC No I. 459和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No I. 110只用于說明本發(fā)明，但并不用于限定本發(fā)明，實(shí)驗(yàn)證明，巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌的其它菌株也可以用于本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.ー種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，其特征是包括如下步驟 (1)混菌傳代培養(yǎng) ①固體培養(yǎng) 取保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans )和保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Baci I Iusmegaterium)分別接種于固體培養(yǎng)基上，28_35°C，培養(yǎng)24_48h ； ②種子培養(yǎng) 將經(jīng)步驟(I)①培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基，在.28-350C，200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)24_48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液； 將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到ー個新的種子培養(yǎng)基中，使巨大芽孢桿菌的密度為 2X 107-2X 101QCFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為 2 X 108_2 X 10nCFU/mL，在 28_35°C，.200-280rpm搖床振蕩培養(yǎng)，以24_48h為傳代周期，以體積比為1%_10%為傳代比接入新的種子培養(yǎng)基中，傳代100-150天得到混菌細(xì)胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3_4個時間取樣，取3-4個樣； ③分純 將步驟(I)②獲得的3 - 5個樣的混菌細(xì)胞劃線分純后再分別接種于固體培養(yǎng)基上，.28-35°C培養(yǎng)24-48h ;再分別轉(zhuǎn)入新的種子培養(yǎng)基，在28_35°C，200_280rpm搖床振蕩培養(yǎng).24-48h，分別得到進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30%的甘油水溶液中； ④發(fā)酵 將步驟(I)③獲得的進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養(yǎng)基中，使進(jìn)化了的巨大芽孢桿菌的密度為2X 107-2X 1010CFU/mL,進(jìn)化了的氧化葡糖桿菌的密度為2X 108_2X 10nCFU/mL,在.28-35°C，200-280rpm 搖床振蕩培養(yǎng) 10_15h ； (2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定 ①各取在步驟(I)④獲得的三種細(xì)胞懸液100-200mL，分別在1000-3000rpm離心.3 - lOmin，去除上清液，保留細(xì)胞，用pH=7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞1_3次，相同條件離心，去除上清，得到細(xì)胞； ②將步驟(2)①所得細(xì)胞制成干粉，各稱取30-60mg細(xì)胞干粉，分別置于三個離心管中，再加入O. 5 - I. 5mL提取液，加入30-70 μ L濃度為O. 020-0. 060mg/mL氘標(biāo)記的琥珀酸甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)物，混勻；1000 - 3000rpm離心3 - lOmin，取上清液置于三個新的離心管中冷凍干燥； ③將步驟(2)②獲得三個離心管中分別加入40-100μ L濃度為10-30mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30°C -40°C水浴中肟化反應(yīng)60-120min ;再加入50-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟こ酰胺于35°C _40°C水浴進(jìn)行硅烷化反應(yīng)30-60min ； 所述提取液為體積分?jǐn)?shù)為50-70%的甲醇水溶液； ④GC-T0F/MS 檢測將I μ L步驟(2)③獲得的樣品進(jìn)到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規(guī)格為30mX0. 25mm i. d.，進(jìn)樣ロ溫度為250°C _280°C，載氣為高純氦氣，恒壓80_100KPa，分流比3 1-20 :1，柱溫箱升溫程序?yàn)槌跏?0°C -80°C，保持3min_6min，以4°C /min_8°C /min的升到260°C -300°C，保持3min_8min，使用EI電離源，源溫230°C _260°C，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV_80eV，電流30 μ Α-50 μ A ;質(zhì)譜檢測范圍50_800m/z ;小分子代謝物的鑒定使用NIST 2005數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理和代謝物相對含量的測定使用Masslynx 4. I軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內(nèi)標(biāo)物的峰面積對照，得到小分子代謝物的相對含量； (3)主成分分析 ①將步驟(2)④獲得的維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程的小分子代謝物的相對含量數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto預(yù)處理； ②用SIMCA-P11. 5軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到區(qū)分不同傳代時間維生素C生產(chǎn)菌株的小分子代謝物標(biāo)志物； (4)過程分析 將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程小分子代謝物變化的方法，其特征是所述細(xì)胞制成干粉的方法為液氮研磨細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中小分子代謝物變化的方法，步驟(1)混菌傳代培養(yǎng)；(2)胞內(nèi)小分子代謝物樣品的制備和測定；(3)主成分分析；(4)過程分析將小分子代謝物標(biāo)志物的含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析小分子代謝物標(biāo)志物變化的規(guī)律，檢測出維生素C生產(chǎn)菌株傳代過程中細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的變化。本發(fā)明的方法通過對不同傳代時間的巨大芽孢桿菌、氧化葡糖桿菌以及混菌的小分子代謝物分別進(jìn)行定性和定量分析，找到與增強(qiáng)維生素C生產(chǎn)菌株兩菌相互作用相關(guān)的代謝物分子和代謝途徑，為提高2–酮基–L–古龍酸為目的的菌種改造和培養(yǎng)條件優(yōu)化提供方向，為優(yōu)化發(fā)酵過程，提高維生素C產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。
文檔編號G01N27/62GK102680562SQ20121014803
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者元英進(jìn), 李霞, 胡夢龍, 鄒旸 申請人:天津大學(xué)