專利名稱：基于小分子代謝物質(zhì)譜分析的快速高靈敏度微生物鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于小分子代謝物質(zhì)譜分析的快速高靈敏度微生物鑒定方法。
背景技術(shù)：
微生物快速鑒定在臨床感染菌株檢測，食品安全，公共衛(wèi)生預(yù)警，以及生物反恐等領(lǐng)域具有重要實踐意義。實現(xiàn)快速的鑒定可以大大縮短應(yīng)對時間，為籌措治療及應(yīng)對方案提供更充分的時間。此外高區(qū)別靈敏度快速微生物鑒定可以更加精細(xì)區(qū)分種以下分類水平的突變菌株，可為臨床檢測耐藥株以及病原微生物突變株的疾控安全監(jiān)測提供參考。有多種方法可以實現(xiàn)微生物的鑒定。當(dāng)前可靠的鑒定方法，都是建立在將采集的樣品在實驗室中進行一定分離培養(yǎng)的樣品。通過對培養(yǎng)的菌落特征和生化特征進行觀察，測試，對表型特征綜合分析實現(xiàn)微生物鑒定。這種方法較為普遍，成本低廉，但是依賴于人的經(jīng)驗對形貌和指標(biāo)進行判讀，難以實現(xiàn)高通量分析，可靠性受制于技術(shù)人員的能力、狀態(tài)和經(jīng)驗。基于生化和抗體反應(yīng)的方法盡管更加有效，但是速度很慢，并且樣品分析成本高?；诤怂嵝蛄袡z測的方法，例如PCR擴增后進行測序，可以得到可靠的檢測結(jié)果。這是因為基因組的序列相對穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響小，但是速度較慢，成本較高，難以應(yīng)用到大量樣品高通量分析。上述方法都不能在這幾方面滿足可普遍推廣的快速微生物鑒定的要求:方法具有普遍適應(yīng)性，高通量分析，分析成本低廉，分析方法簡單易于傳授掌握。質(zhì)譜法的引入為微生物快速鑒定起到了重大的推進作用，不但可以基本滿足以上要求，而且種屬水平的鑒別已經(jīng)可以很可靠?！ぎ?dāng)前的方法主要是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)法。該方法信號靈敏度高，通量高于電噴霧方法，常用的基質(zhì)如DHB和CCA非常適合分析蛋白質(zhì)、多肽以及核酸序列。根據(jù)中心法則，可知蛋白/多肽的序列與核酸序列關(guān)聯(lián)密切，其蛋白組成具有種屬特異性。因此測定蛋白/多肽的組成模式或者分析特定核酸序列，可以對微生物進行鑒定。為了保證快速鑒定的時間限制因素，基于MALD1-TOF MS的快速微生物鑒定法所采取的樣品提取方法都不能有太多的步驟。通常核酸樣品的獲取較為繁瑣，故最常見的是測試范圍通常是分子量在2000-20000Da的多肽和蛋白質(zhì)。這一分子量范圍主要是高豐度的核糖體蛋白，通過分析這一區(qū)間的譜峰模式，可以穩(wěn)定、可靠的獲得種屬水平的鑒定。這是因為高豐度且遺傳保守的核糖體蛋白不太容易發(fā)生改變。然而這一優(yōu)點也是它的缺點，例如當(dāng)某些菌株的差異僅為低豐度蛋白時則不能獲得有效區(qū)別，例如耐藥突變菌株。微生物快速鑒定不僅需要實現(xiàn)種屬水平的鑒別，也需要得到更高區(qū)別靈敏度的鑒另O。很多方法都嘗試進行了不同程度的種以下水平，即株的區(qū)別。這些方法當(dāng)前還只能對差異較大的株實現(xiàn)區(qū)別，主要是因為上述蛋白質(zhì)的影響。因此，改變質(zhì)譜的質(zhì)量檢測窗口，避開蛋白干擾，利用代謝組可放大反映不同菌株基因組區(qū)別的特點，將有可能提供更高區(qū)別靈敏度的微生物快速鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速高靈敏度微生物鑒定方法。本發(fā)明所提供的快速高靈敏度鑒定微生物的方法是通過以微生物的小分子代謝物為檢測對象，以質(zhì)譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)的。本發(fā)明方法的基礎(chǔ)依據(jù)是微生物小分子代謝物是生物體實現(xiàn)其表型特征和發(fā)揮功能的直接參與者，而且也反應(yīng)了不同菌株的物種特征。本發(fā)明的方法具體包括下述步驟:a、選取若干已知微生物采用下述方法得到相應(yīng)微生物的小分子代謝物的質(zhì)譜圖，并用化學(xué)計量學(xué)方法進行分析，然后采用模式識別的算法建立不同已知微生物樣本的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫；所述方法如下(技術(shù)方案路線參見圖1):I)按照平行操作，指定的條件(包括培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基，溫度，轉(zhuǎn)速等)，培養(yǎng)單克隆生長的待鑒定微生物菌株，于統(tǒng)一的生長濃度下收集待鑒定單克隆菌體；2)將步驟I)獲得的待鑒定單克隆微生物菌體樣本離心去除培養(yǎng)基，再加入30-100倍體積的水或者pH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液洗滌，離心去除殘余培養(yǎng)基，通常5-10mg濕重單克隆微生物菌體即足以用于鑒定；3)向步驟2)處理后的待鑒定單克隆微生物菌體中加入2-4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為75-95%的乙醇水溶液滅活兼具提取，得到提取液樣品；4)將步驟3)所述的提取液樣品進行質(zhì)譜測試，獲得質(zhì)譜譜圖；5)每種樣品采集5-20個質(zhì)譜峰，所得數(shù)據(jù)用基于多元統(tǒng)計分析的化學(xué)計量學(xué)方法進行分析；b、將待鑒定的微生物按照上述方法處理，獲得待鑒定微生物的小分子代謝物的質(zhì)譜譜圖；C、將待鑒定微生物的質(zhì)譜譜圖與數(shù)據(jù)庫對比，實現(xiàn)對微生物的鑒別。所用的化學(xué)計量學(xué)方法是以主成分分析為核心的方法。模型識別的算法有遺傳算法(Genetic Algorithm)、支持向量機(Support Vector Machine)、有監(jiān)督的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(SNN)和快速分類器(QuickClassifier)算法。不同微生物的質(zhì)譜譜圖的譜峰組成模式是不同的，化學(xué)計量學(xué)方法可以計算這種譜峰模式的類似性并以數(shù)值和圖形的方式表示。將各個樣品每張質(zhì)譜譜圖作為一個主成分分析的樣本，構(gòu)成每張譜圖的數(shù)據(jù)點為變量。將樣本和變量輸入給主成分分析可以得到每一樣本在主成分空間中的坐標(biāo)。取前三個主成分-包含了樣本的主要信息-作三維直角坐標(biāo)圖。同一類樣本由于其相似性因而最終在主成分空間中聚在一起。主成分分析可以確定所建立的方法是否可以將不同類樣本區(qū)分。這一點確定后可以進一步采用模式識別的算法建立不同樣本的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，通過待測的質(zhì)譜譜圖與數(shù)據(jù)庫對比，可實現(xiàn)數(shù)據(jù)歸類，即鑒別。其中，步驟I)中所述微生物包括細(xì)菌，真菌，病毒等。步驟I) 中通常對數(shù)生長期中晚期是菌株成熟穩(wěn)定的收集時機，在此時收集單克隆菌體可降低假陽性鑒別。
步驟2)中，洗滌時，所述水或者磷酸鹽緩沖液的用量為單克隆微生物菌體樣本體積的30-100倍。步驟3)中，通常取5-10mg濕重步驟2)處理后的待鑒定單克隆微生物菌體即足以滿足鑒定需要。根據(jù)菌株特性，提取時間在2-20分鐘不等。在將步驟3)中得到的提取液樣品進行質(zhì)譜分析前，還可對其進行離心，將離心得到的上清液用于質(zhì)譜測試或置于冰箱保存。步驟4)中，所述質(zhì)譜測試中的質(zhì)譜法，其常采用的質(zhì)譜離子化方法包括基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)，解吸電噴霧電離(DESI)，等離子體輝光放電電離等。上述所用電離方法均為軟電離方法，其中基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)采用低分子量區(qū)間背景干擾小的基質(zhì)，例如鹽酸萘乙二胺，硝酸奈乙二胺，質(zhì)子海綿，I，5- 二氨基萘等。質(zhì)量測試范圍為微生物小分子代謝物分布范圍,質(zhì)荷比區(qū)間為m/z0-1500。所用電離方法及條件均為儀器產(chǎn)品說明或常規(guī)文獻報道的方法。質(zhì)量分析器為飛行時間、離子阱 或四極桿，包括它們的組合或變種，如四極桿-飛行時間，四極桿離子阱，三級四極桿。當(dāng)采用解吸電噴霧電離(DESI)質(zhì)譜或等離子體輝光放電質(zhì)譜進行質(zhì)譜測試時，可將提取液樣品直接上樣；當(dāng)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)進行質(zhì)譜測試時，需將提取液樣品與基質(zhì)混合后點靶入基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)，其中，所述提取液樣品與基質(zhì)溶液可按照體積比10: 1-1: 100的比例混合。微生物小分子代謝物樣品提取僅通過簡單處理，無復(fù)雜費時步驟，可以滿足快速鑒定的需要。本發(fā)明所采用的樣品提取液和基質(zhì)溶液都較為溫和，不造成菌體破裂，可以減少不同樣本操作提取時間的析出物差異，也可降低菌體高豐度小分子組分的大量析出。單個樣品從制備到分析用時10-30分鐘。對于批量制備和高通量分析，可實現(xiàn)平均每小時鑒別10-30個樣品。本發(fā)明適用上述多種質(zhì)譜儀器及離子化方法，但采用通用統(tǒng)一的樣品處理方法。本發(fā)明所采用的數(shù)據(jù)分析手段是基于多元統(tǒng)計分析的化學(xué)計量學(xué)方法，如主成分分析法等。本發(fā)明以微生物的小分子代謝物為分析對象，通過質(zhì)譜和化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)微生物快速高靈敏度鑒定。該方法的基本原理是根據(jù)中心法則，基因組的變化往往影響行使表型功能的代謝組。對于突變菌株，其基因組或蛋白質(zhì)組并不一定有顯著的改變，然而其代謝組由于居于下游，則往往由于放大效應(yīng)而得到顯著變化。應(yīng)用高通量高靈敏度的質(zhì)譜法可以有效分析這種放大效應(yīng)，同時利用化學(xué)計量學(xué)方法以實現(xiàn)通過譜圖鑒別差異菌株。本發(fā)明和以往的基于質(zhì)譜的微生物快速鑒定技術(shù)相比，具有能夠精細(xì)分辨在分類學(xué)上株水平的菌體，包括單基因改變的菌株。這一結(jié)果是當(dāng)前已知最靈敏的結(jié)果。這是通過將測量小分子代謝物變化與基因組變化(株分類的遺傳基礎(chǔ))相聯(lián)系實現(xiàn)的。而以往的方法由于不能同避高豐度核糖體蛋白從而難以得到更靈敏的分辨，此外高分子質(zhì)量區(qū)的譜圖信噪比和譜數(shù)都低于低分子質(zhì)量區(qū)。與基于核酸測序的方法相比，本發(fā)明具有快速和成本低廉的特點。本發(fā)明以簡潔明了的技術(shù)路線實現(xiàn)快速微生物鑒定。菌體經(jīng)培養(yǎng)后，只需簡單后處理，以一步法乙醇滅活兼提取后即可用質(zhì)譜分析。樣品用量少，樣品制備方法統(tǒng)一通用，可向后兼容多種離子化方法和質(zhì)譜儀器。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)基于多元統(tǒng)計分析的化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)鑒別。


圖1為本發(fā)明方法的技術(shù)路線圖。圖2為實施例1中代表性質(zhì)譜譜圖。圖3為實施例1中細(xì)菌種-屬鑒定的主成分分析結(jié)果。圖4為實施例2中突變體菌株鑒定的主成分分析結(jié)果。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明所涉及的不同的離子化方法采用統(tǒng)一的樣品前處理方法，其中基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)法在樣品處理結(jié)束后再與基質(zhì)液混合點靶上樣檢測。下述實施例1，2中所使用方法為基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)-飛行時間質(zhì)譜法，所用基質(zhì)為鹽酸萘乙二胺?；|(zhì)的質(zhì)譜背景非常簡單，對測試樣本，包括復(fù)雜體系均無干擾。下述實施例中所用的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀的型號為BIFLEXTMIII (Bruker)和 uItraileXtreme(Bruker)。本發(fā)明不同的離子化方法采用統(tǒng)一的樣品前處理方法(見圖1)。下述實施例中所采用的恥垢分枝桿菌(Mycobaterium smegmatis)的菌株為mc2155 ;鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis,MAP)購自 ATCC, ATCC 19698 0實施例1、鑒定區(qū)分不同種-屬微生物(細(xì)菌)培養(yǎng)的三種分枝桿菌(恥垢分枝桿菌，鳥分枝桿菌，海分枝桿菌)，K12大腸桿菌兩種亞種(DH5 α和ΗΒ101)細(xì)菌生長到大于OD600 = 0.8-1.0后收集。收集的菌體用50倍pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌后_20°C冷凍保存或者直接用于進一步處理。磷酸鹽緩沖液懸浮的細(xì)菌用去離子水置換，5000rpm離心留沉淀，向IOmg沉淀中加入3倍(即30ul)體積的體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇水溶液,懸浮后靜置5min。再經(jīng)5000rpm離心后取上清,或者不離心直接取適量樣品用于質(zhì)譜分析。取樣品和基質(zhì)( 鹽酸萘乙二胺)溶液(20mg/ml)以1:1體積比混合，向MALDI靶板加入I μ I混合樣品，充分干燥。入質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為:電壓:加速電壓:19.0OOkv ；延遲引出電壓:14.920kv ;反射器電壓:20.0OOkv ;透鏡電壓:7.0OOkv ;頻率:1.000Hz ;激光器能量:75-80% ;負(fù)離子模式。通過將獲得的質(zhì)譜譜圖(圖2為代表性譜圖)進行化學(xué)計量學(xué)分析(主成分分析)，可以快速靈敏區(qū)分不同細(xì)菌的種，亞種(見圖3)。圖3的制備方法如下:將每張質(zhì)譜譜圖作為一個樣本，構(gòu)成每張譜圖的數(shù)據(jù)點為變量。將樣本和變量輸入給主成分分析可以得到每一樣本在主成分空間中的坐標(biāo)。取前三個主成分-包含了樣本的主要信息-作三維直角坐標(biāo)圖。同一類樣本由于其相似性在空間中聚在一起。橢圓覆蓋圖是由每一類樣本點在空間中定位的重心計算得到的。實施例2、鑒定區(qū)分同種不同突變株微生物(細(xì)菌)培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌(野生型，菌株為mc2155)以及五種單基因突變株(Msmeg2415K0、Msmegl640K0、Msmegl641K0、Msmegl804K0 和 Msmeg_3312K0) (Msmeg_2415K0為 Hemerythrin HHE cation binding region 基因敲除(起始位點 2497580,結(jié)束位點 2498158)，Msmeg_1640K0 為 mfpB 基因敲除(起始位點 1732495，結(jié)束位點 1733076)；Msmeg_1641K0 為 mfpA 基因敲除(起始位點 1733082，結(jié)束位點 1733657) ;Msmeg_1804K0 為結(jié)核分枝桿菌SigF同源基因敲除(起始位點1881660，結(jié)束位點1882412) ；Msmeg_3312K0為 Hemerythrin HHE cation binding domain subfamily 基因敲除(起始位點 3391207,結(jié)束位點3391764)。所有基因信息均可通過該網(wǎng)站輸入MSMEG_XXXX格式的基因名稱后查得才目關(guān)/[言息 http: //mycobrowser.epf 1.ch/smegmalist.html )生長至Ij OD600 = 0.8-1.0 后收集。收集的菌體用50倍pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌后_20°C冷凍保存或者直接用于進一步處理。磷酸鹽緩沖液懸浮的細(xì)菌用去離子水置換，5000rpm離心留沉淀，向IOmg沉淀中加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液，懸浮后靜置lOmin。再經(jīng)5000rpm離心后取上清，或者不離心直接取適量樣品用于質(zhì)譜分析。取樣品和基質(zhì)(鹽酸萘乙二胺)溶液(20mg/ml)以1:1體積比混合，向MALDI靶板加入I μ I混合樣品，充分干燥。入質(zhì)譜分析，質(zhì)譜條件為:電壓:加速電壓:19.0OOkv ；延遲引出電壓:14.920kv ;反射器電壓:20.0OOkv ;透鏡電壓:7.0OOkv ;頻率:1.000Hz ;激光器能量:75-80%。負(fù)離子模式。每株菌采集多張譜圖，將獲得的質(zhì)譜譜圖歸一化后進行化學(xué)計量學(xué)分析(主成分分析)，可以快速靈敏的區(qū)分細(xì)菌的單基因突變，其結(jié)果優(yōu)于當(dāng)前已知的方法(圖4)。圖4的制備方法:將每張質(zhì)譜譜·圖作為一個樣本，構(gòu)成每張譜圖的數(shù)據(jù)點為變量。將樣本和變量輸入給主成分分析可以得到每一樣本在主成分空間中的坐標(biāo)。取前三個主成分-包含了樣本的主要信息-作三維直角坐標(biāo)圖。同一類樣本由于其相似性在空間中聚在一起。橢圓覆蓋圖是由每一類樣本點在空間中定位的重心計算得到的。
權(quán)利要求
1.一種鑒定微生物的方法，包括下述步驟: a、選取若干已知微生物采用下述方法得到相應(yīng)微生物的小分子代謝物的質(zhì)譜圖，并用化學(xué)計量學(xué)方法進行分析，然后采用模式識別的算法建立不同已知微生物樣本的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫； 所述方法如下: 1)培養(yǎng)單克隆生長的微生物菌株，待OD6tltlnm值大于0.8后，收集待鑒定單克隆微生物菌體； 2)將步驟I)獲得的單克隆微生物菌體樣本離心去除培養(yǎng)基，再加入水或者pH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液洗滌，離心去除殘余培養(yǎng)基； 3)向步驟2)處理后的單克隆微生物菌體中加入2-4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為75-95%的乙醇水溶液進行滅活和提取，得到提取液樣品； 4)將步驟3)所述的提取液樣品進行質(zhì)譜測試，獲得測試樣品質(zhì)譜譜圖； 5)從獲得的樣品質(zhì)譜譜圖中采集5-20個譜峰，所得數(shù)據(jù)用基于多元統(tǒng)計分析的化學(xué)計量學(xué)方法進行分析； b、將待鑒定的微生物按照上述方法處理，獲得待鑒定微生物的小分子代謝物的質(zhì)譜譜圖； C、將待鑒定微生 物的質(zhì)譜譜圖與數(shù)據(jù)庫對比，實現(xiàn)對微生物的鑒別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a)中所述微生物包括細(xì)菌、真菌及病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟2)中，所述水或者pH值為7.2-7.6磷酸鹽緩沖液的用量為所述單克隆微生物菌體體積的30-100倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:步驟3)中，所述提取時間為2-20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟4)中，所述質(zhì)譜測試中的質(zhì)量測試范圍為微生物小分子代謝物分布范圍，質(zhì)荷比區(qū)間為m/Z0-1500。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:步驟4)中，所述質(zhì)譜測試中采用的質(zhì)譜離子化方法為基質(zhì)輔助激光解吸電離、解吸電噴霧電離或等離子體輝光放電電離； 所述質(zhì)譜測試中采用的質(zhì)量分析器選自下述任意一種或它們的組合及變種:飛行時間、離子阱和四極桿。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述質(zhì)譜測試采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜進行質(zhì)譜測試；將所述提取液樣品與基質(zhì)溶液混合后點靶入基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜，其中，所述提取液樣品與基質(zhì)溶液按照體積比10: 1-1: 100的比例混合，所述基質(zhì)選自下述任意一種:鹽酸萘乙二胺，硝酸奈乙二胺，質(zhì)子海綿和1，5-二氨基萘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于:所述方法將所述微生物鑒定到屬水平、種水平或菌株水平。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述菌株包括單基因突變的菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速高靈敏度鑒定微生物的方法。該方法以微生物的小分子代謝物為檢測對象，通過質(zhì)譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)對微生物的鑒定。具體步驟如下1)培養(yǎng)單克隆生長的待鑒定微生物菌株；2)將獲得的待鑒定單克隆微生物菌體樣本離心去除培養(yǎng)基，再加入水或者pH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液洗滌，離心去除殘余培養(yǎng)基；3)向待鑒定單克隆微生物菌體中加入2-4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為75-95％的乙醇水溶液進行滅活和提取，得到提取液樣品；4)將提取液樣品進行質(zhì)譜測試；5)從獲得的樣品質(zhì)譜譜圖中采集5-20個譜峰，所得數(shù)據(jù)用基于多元統(tǒng)計分析的化學(xué)計量學(xué)方法進行分析，實現(xiàn)對菌體的鑒別。
文檔編號G01N27/62GK103245716SQ201310194000
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者聶宗秀, 王佳寧, 陳素明, 侯劍, 何清 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所