專利名稱：一種用于檢測原料乳及乳制品中β-內酰胺酶的檢測裝置及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測技術領域，具體為一種用于檢測原料乳和乳制品中β -內酰胺酶的檢測裝置及其檢測方法。
背景技術：
β -內酰胺酶(β-lactamase)，俗稱生鮮牛乳抗生素分解劑，又名解抗劑或金玉蘭酶制劑，它是由革蘭氏陽性細菌產生和分泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的內酰胺類抗生素，使微生物法、酶聯(lián)免疫法等常規(guī)的檢測方法失效，從而無法正確判斷是否為“無抗奶”，掩蓋抗生素超標的事實。內酰胺類抗生素是在牛奶生產中應用最廣泛的抗生素，用于治療牛乳房炎和其他細菌感染性疾病，如果不嚴格按照規(guī)定治療牛乳炎等疾病，濫用抗生素，就會造成牛乳中的抗生素超標。由于抗生素的存在，一方面難以成為安全合格的產品，另一方面，還會影響酸奶、奶酪等奶制品的加工生產。Korycka-Dahl Μ.等(1985)利用β -內酰胺酶降解牛奶中殘留的抗生素，可降低至常規(guī)檢測方法無法檢測的水平。一些不法分子將內酰胺酶用作牛奶中抗生素的分解劑，以掩蓋其抗生素殘留超標的事實，從而使抗生素超標奶變成合格奶，這就造成了外源性內酰胺酶的違法添加。β -內酰胺酶能夠使青霉素內酰胺結構破壞而失去活性，導致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身體健康帶來危害。青霉素在β-內酰胺酶作用下，酶中親核性基團向β-內酰胺環(huán)進攻，開環(huán)后可脫羧重排生成中間體青霉噻唑酸。以青霉素為代表的內酰胺類抗生素過敏反應非常普遍，引起過敏反應的基本物質有兩種，一種是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，與蛋白質結合形成抗原而致敏。另一種過敏源是一些高聚物，為β-內酰胺環(huán)開環(huán)后自身聚合而成，聚合程度越高，過敏反應越強。雖然由于添加內酰胺酶造成青霉素過敏的病例并未被研究證明，但根據青霉素的過敏機理，以及β _內酰胺酶的添加可能會造成β"內酰胺類抗生素耐藥性的原因，確實應該對β-內酰胺酶的濫加提高警惕，嚴加管理。有些微生物雖然可以產生內酰胺酶，但由于采奶方式、牛奶的組分、消毒方法和包裝儲存方法等不適于產
內酰胺酶微生物的生存，在非人為添加內酰胺酶的條件下是無法檢測到微生物產生的β -內酰胺酶的。2009年2月4日，根據衛(wèi)生部等九部門《關于開展全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治的緊急通知》的規(guī)定，為配合全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治工作的深入開展，專項整治專家委員會提出《食品中可能違法添加的非食用物質名單》，其中就包括β-內酰胺酶。外源性內酰胺酶是我國不允許在食品中使用的化學物質，它的使用掩蓋了牛奶中抗生素的殘留的事實。為了廣大消費者的身體健康，維護乳制品市場良好的競爭環(huán)境，建立一種簡單、方便、經濟的乳制品中β-內酰胺酶的快速檢測試紙已經是一個亟需解決的問題。

發(fā)明內容
為了克服上述現(xiàn)有技術中的不足，本發(fā)明的提供一種原料乳及乳制品中β -內酰胺酶檢測試紙及其標準比色卡，并提供一種利用該試紙方便、快捷測定樣品中內酰胺酶含量的方法。一種用于檢測原料乳及乳制品中β -內酰胺酶的裝置，包括檢測試紙和β “內酰胺酶標準比色卡；其中所述的檢測試紙由過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3)和基板 (4)組成，過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3)粘貼在基板(4)上，且同時依次連接；其中所述的β -內酰胺酶標準比色卡由9個色塊(5)組成，從淺到深對應于β -內酰胺酶濃度梯度分別為 0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL。所述的檢測試紙過濾層(1)用玻璃棉制成，顯色層(2)由醋酸纖維素膜制成，吸水層⑶由中性濾紙制成，基板⑷由PVC薄片制成。所述顯色層(2)的制備包括步驟配置0. 5% 1. 0 % 2，2’ -聯(lián)喹啉乙醇溶液和 0. Γ0. 3mol/L CuSO4溶液，混合均勻后，將醋酸纖維素膜浸入上述混合溶液5 IOmin后取出，放入真空干燥箱內40 80°C干燥20 50min后組裝成檢測試紙。所述β -內酰胺酶標準比色卡的具體制備步驟如下
(1)配制青霉素底物濃度為5000U/mL的溶液9份，分別加入濃度為0U/mL、6U/mL、12U/ mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β -內酰胺酶標準溶液，混合均勻后 37°C 水浴 60min ；
(2)取出后加入5mL添加10% 15%TCA，4000rpm離心lOmin，取上清液100μ L，然后取制備的檢測試紙浸入上清液5 10min后取出，進行顯色反應；
(3)根據測色儀測量試紙顯色的色度值，利用顏色模塊軟件對色彩數(shù)據進行模擬，制作標準比色塊；或者利用計算機Adobe Photoshop編輯不同顏色的RGB值，編輯出與標準 β -內酰胺酶濃度相匹配的顏色，制備出標準色塊；按β -內酰胺酶濃度標準顯色排列、粘貼，制成內酰胺酶標準比色卡。用于檢測原料乳及乳制品中β -內酰胺酶的裝置的測定方法為取原料乳或乳制品按1:1比例添加10°/Γ15%的TCA，倒入離心管中，混合均勻后放入離心機，4000rpm離心 lOmin，取上清液。取β-內酰胺酶檢測試紙，浸入待測樣品溶液2 5min，取出后內與β-內酰胺酶標準比色卡對照，即得到β -內酰胺酶的濃度范圍。積極有益效果本發(fā)明的原理基于β “內酰胺酶分解青霉素鉀的分解產物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有還原性，可將Cu2+還原為Cu+，而亞銅試劑2，2’-聯(lián)喹啉與Cu+ 偶聯(lián)生成紫紅色絡合物，且顏色隨著內酰胺酶濃度大小成正相關，該檢測方法快捷、方便，且準確率高，有利于市場的普及。


圖1檢測試紙條結構示意圖2 β-內酰胺酶標準比色卡的結構圖； 圖中為過濾層1、顯色層2、吸水材料層3、基板4、色塊5。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明
一種用于檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的裝置，包括檢測試紙條和內酰胺酶標準比色卡；所述的檢測試紙由過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3)和基板(4)組成，過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3)粘貼在基板⑷上，且同時依次連接，如圖1 所示；其中所述的β -內酰胺酶標準比色卡由9個色塊(5)組成，從淺到深對應于β -內酰胺酶濃度梯度分別為 0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、 250U/mL，如圖2所示。所述的檢測試紙條的過濾層(1)用玻璃棉制成，顯色層(2)由醋酸纖維素膜制成， 吸水層⑶由中性濾紙制成，基板⑷由PVC薄片制成。所述顯色層(2)的制備包括步驟配置0. 5% 1. 0 % 2，2’ -聯(lián)喹啉乙醇溶液和 0. Γ0. 3mol/L CuSO4溶液，混合均勻后，將醋酸纖維素膜浸入上述混合溶液5 IOmin后取出，放入真空干燥箱內40 80°C干燥20 50min后組裝成檢測試紙。所述β -內酰胺酶標準比色卡的具體制備步驟如下
(1)配制青霉素底物濃度為5000U/mL的溶液9份，分別加入濃度為0U/mL、6U/mL、12U/ mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β -內酰胺酶標準溶液，混合均勻后 37°C 水浴 60min ；
(2)取出后加入5mL10% 15%TCA，4000rpm離心5 lOmin，取上清液100μ L，然后取制備的檢測試紙浸入上清液5 10min后取出，進行顯色反應；
(3)根據測色儀測量試紙顯色的色度值，利用顏色模塊軟件對色彩數(shù)據進行模擬，制作標準比色塊；或者利用計算機Adobe Photoshop編輯不同顏色的RGB值，編輯出與標準 β -內酰胺酶濃度相匹配的顏色，制備出標準色塊；按β -內酰胺酶濃度標準顯色排列、粘貼，制成內酰胺酶標準比色卡。用于檢測原料乳及乳制品中β -內酰胺酶的裝置的測定方法為取原料乳或者乳制品按1 1比例添加109Γ15%的TCA，倒入離心管中，混合均勻后放入離心機，4000rpm離心 5 10min，取上清液。取β _內酰胺酶檢測試紙條，浸入待測樣品溶液2 5min，取出后內與 β-內酰胺酶標準比色卡對照，即得到β “內酰胺酶的濃度范圍。
實施例1
1.檢測試紙的制備
稱取2，2’ -聯(lián)喹啉0. 5g,溶解在IOOmL乙醇溶液中，配制成0. 5%的2，2’ -聯(lián)喹啉乙醇水溶液，稱取2. 5g的無水CuSO4,溶解在IOOmL的水溶液中，配制成0. lmol/L CuSO4的硫酸銅溶液，混合均勻后即得顯色液。將醋酸纖維素膜浸入顯色液中浸泡lOmin，取出置于玻璃板上真空干燥箱中45°C干燥30min，制備出顯色層。將過濾層、顯色層和吸收材料層粘貼在基板上，裁剪成lOcmXl.Ocm，即得β -內酰胺酶檢測試紙(見圖1)。
2.標準比色卡的制備
(1)配制分別含有濃度梯度 0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、lOOU/mL、150U/mL、 200U/mL、250U/mL β -內酰胺酶的標準品溶液，分別加入青霉素鉀底物濃度為5000U/mL的溶液中；混合均勻后37°C溫浴60min后，4000rpm離心5 lOmin，取上清液在試紙上進行顯
5色反應；
(2)利用分光測色儀測定試紙L*、a*和b*值數(shù)據，輸入計算機，利用顏色模塊軟件對色彩L*、a*和b*數(shù)據進行模擬，制作標準比色塊。按內酰胺酶的標準品溶液的濃度的高低，將標準比色塊進行排列、粘貼，制成內酰胺酶的標準比色卡(見圖2)。3. β-內酰胺酶含量的測定
(1)待測樣品的制備用市售牛奶配制含有0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、 100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β -內酰胺酶，青霉素鉀底物濃度皆為5000U/mL的9 個樣品，分別標記為1、2、3、4、5、6、7、8、9號樣品，37°C水浴60min，按1:1比例添加10%的 TCA,倒入離心管中，混合均勻后放入離心機，4000rpm離心lOmin，取上清液，制備出不同濃度的待測樣品。(2)取β -內酰胺酶測定試紙，浸入待測樣品溶液5min，取出與標準比色卡對照， 即得到β-內酰胺酶的濃度范圍。實施例2
ι. β-內酰胺酶檢測試紙的制備
稱取2，2’ -聯(lián)喹啉0. 8g,溶解在IOOmL乙醇溶液中，配制成0. 8%的2，2’ -聯(lián)喹啉乙醇水溶液。稱取7. 5g的無水CuS04，溶解在IOOmL的乙醇溶液中，配制成0. 3mol/L CuS04的硫酸銅溶液，混合均勻后即得顯色液。將醋酸纖維素膜浸入顯色液中浸泡15min，取出置于玻璃板上真空干燥箱中50°C干燥20min，制備出顯色層。將過濾層、顯色層和吸收材料層粘貼在基板上，裁剪成12cmX 1.2cm，即得β -內酰胺酶檢測試紙(見圖1 )。2. β-內酰胺酶標準比色卡的制備
(1)配制分別含有 OU/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、lOOU/mL、150U/mL、200U/mL、 250U/mL β -內酰胺酶的標準品溶液，青霉素鉀底物濃度為5000U/mL的溶液；混合均勻后放進水浴鍋內37°C溫浴60min ；4000rpm離心5 10min，取上清液在試紙上進行顯色反應。(2)以標準濃度的β -內酰胺酶顯色為基準，利用計算機Adobe Photoshop編輯不同顏色的RGB值，以RGB值編輯成各種顏色的色塊，再與標準濃度的β -內酰胺酶在試紙顯色的顏色對比，編輯出與標準β-內酰胺酶濃度相匹配的顏色，制備出標準色塊，按β-內酰胺酶濃度標準顯色排列、粘貼，制成β “內酰胺酶標準比色卡(見圖2)。3. β-內酰胺酶含量的測定
(1)待測樣品的制備用市售牛奶配制含有0U/mL、6U/mL、15U/mL、30U/mL、60U/mL、 120U/mL、180U/mL、210U/mL、250U/mL β -內酰胺酶，青霉素鉀底物濃度皆為5000U/mL的9個樣品，分別標記為1、2、3、4、5、6、7、8、9號樣品，37°C水浴Ih，按1 1比例添加15%的TCA，倒入離心管中，混合均勻后放入離心機，4000rpm離心lOmin，取上清液，制備出不同濃度的待測樣品。(2)取β -內酰胺酶測定試紙，浸入待測樣品溶液5min，取出后與標準比色卡對照，即得到β “內酰胺酶的濃度范圍。實施例3 與高效液相法、分光光度計法的對比
將試紙法與高效液相法、可見分光光度法在檢測限、相關性、可操作性、檢測時間、操作簡易程度上進行比較，如表1所示
表1試紙法與分光光度法測試方法的對比表
權利要求
1.一種用于檢測原料乳及乳制品中β-內酰胺酶的裝置，其特征在于包括檢測試紙條和β-內酰胺酶標準比色卡；所述的檢測試紙由過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3) 和基板⑷組成，過濾層(1)、顯色層(2)、吸水材料層(3)粘貼在基板⑷上，且同時依次連接；其中所述的β -內酰胺酶標準比色卡由9個色塊(5)組成，從淺到深對應于β -內酰胺酶濃度梯度分別為 0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、 250U/mL。
2.根據權利要求1所述的一種用于檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的裝置，其特征在于所述的檢測試紙條過濾層(1)用玻璃棉制成，顯色層(2)由醋酸纖維素膜制成，吸水層(3)由中性濾紙制成，基板(4)由PVC薄片制成。
3.根據權利要求1或2所述的一種用于檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的裝置，其特征在于所述顯色層(2)的厚度為0. 1 1mm，其制備步驟如下配置0. 5 1. 0 % 2，2’ -聯(lián)喹啉乙醇溶液和0. Γ0. 3mol/L CuSO4溶液，混合均勻后，將醋酸纖維素膜浸入上述混合溶液5 IOmin后取出，放入真空干燥箱內40 80°C干燥20 50min，然后組裝成檢測試紙條。
4.根據權利要求1所述的一種用于檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的裝置，其特征在于所述β-內酰胺酶標準比色卡的具體制備步驟如下(1)配制青霉素底物濃度為5000U/mL的溶液9份，分別加入濃度為0U/mL、6U/mL、12U/ mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL β -內酰胺酶標準溶液，混合均勻后 37°C 水浴 60min ；(2)取出后加入5mL10% 15%TCA，4000rpm離心lOmin，然后取制備的檢測試紙條浸入上清液5min，進行顯色反應；(3)依據不同濃度的內酰胺酶標準液酶解液在試紙上的顯色結果，制作標準色塊， 將標準色塊按內酰胺酶標準品的濃度依次排列，粘貼，制得標準比色卡。
5.根據權利1或4所述的內酰胺酶標準比色卡，在特征在于根據測色儀測量試紙顯色的色度值，利用顏色模塊軟件對色彩數(shù)據進行模擬，制作標準比色塊；或者利用計算機Adobe Photoshop編輯不同顏色的RGB值，編輯出與標準β -內酰胺酶濃度顯色相匹配的顏色，制備出標準色塊；按β _內酰胺酶標準溶液顯色排列、粘貼，制成β “內酰胺酶標準比色卡。
6.根據權利要求1所述的一種用于檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的裝置，其特征在于，用上述裝置檢測原料乳及乳制品中內酰胺酶的測定方法為取原料乳或乳制品按1:1比例添加10°/Γ15%的TCA，倒入離心管中，混合均勻后放入離心機，4000rpm離心 lOmin，上清液備用；取內酰胺酶檢測試紙條，浸入上述待測樣品上清液進行顯色反應 5min，與β-內酰胺酶標準比色卡對照，即得到β-內酰胺酶的濃度范圍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測原料乳及乳制品中β-內酰胺酶的檢測裝置及其檢測方法，包括檢測試紙條、標準比色卡；標準比色卡由9個色塊組成，從淺到深分別對應于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-內酰胺酶濃度；檢測試紙條由過濾層、顯色層、吸水材料層和基板組成，以2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液作為顯色劑和CuSO4作為絡合劑制備而成。根據待測樣品顯色程度與標準比色卡的對比，快速判定β-內酰胺酶的含量范圍。這種檢測試紙條用于原料乳或乳制品中β-內酰胺酶含量的快速檢測，方法簡單、快捷、方便，成本低廉，易于實施推廣。
文檔編號G01N21/78GK102221547SQ20111016241
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者姚永志, 張鑫瀟, 李雪琴, 林敏剛, 謝巖黎, 韓小賢 申請人:河南工業(yè)大學