一種巴氏殺菌乳中復(fù)原乳的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種乳制品檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種己氏殺菌乳中復(fù)原乳的鑒別方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在液態(tài)奶中大量使用進(jìn)口乳粉，是發(fā)展中國(guó)家乳品消費(fèi)處于快速增長(zhǎng)時(shí)期的特有 現(xiàn)象。加工企業(yè)用乳粉生產(chǎn)復(fù)原乳(reconstitutedmilk,將干燥的或者濃縮的乳制品與水 按比例混勻后獲得的乳液)操作方便，風(fēng)險(xiǎn)低，不需要建設(shè)奶源基地，但是嚴(yán)重?fù)p害了農(nóng)民 的利益，侵犯了消費(fèi)者的知情權(quán)。更為嚴(yán)重的是，復(fù)原乳完全割斷了加工企業(yè)與養(yǎng)殖戶之間 共同提高原料奶質(zhì)量的責(zé)任關(guān)系，使進(jìn)口乳粉成為我國(guó)的境外奶源基地。
[0003] 目前國(guó)際組織和國(guó)外都沒(méi)有頒布用于復(fù)原乳鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，因此，有必要開(kāi)發(fā)一種 鑒定己氏殺菌乳中復(fù)原乳的方法，保護(hù)奶農(nóng)利益，維護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，促進(jìn)乳品行業(yè)的健 康發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明不添加營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或僅添加礦物質(zhì)、維生素的己氏殺菌乳。復(fù)原乳鑒定是 世界性的難題。在國(guó)內(nèi)外無(wú)同類標(biāo)準(zhǔn)可W借鑒的情況下，本發(fā)明創(chuàng)新性提出了復(fù)原乳鑒定 方法，不僅為我國(guó)復(fù)原乳監(jiān)管奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，而且推動(dòng)我國(guó)在該領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新處于國(guó) 際先進(jìn)水平。本發(fā)明進(jìn)一步提高了乳制品檢測(cè)方法的權(quán)威性，保障消費(fèi)者知情權(quán)、保護(hù)奶農(nóng) 利益、促進(jìn)民族奶業(yè)健康發(fā)展等方面更好地發(fā)揮作用。
[0005] 本發(fā)明中的生乳(rawmilk)是指從健康奶畜擠下的經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)過(guò)濾和冷卻，但 未經(jīng)過(guò)任何加熱和其他除菌處理的常乳。乳粉包括全脂、脫脂、部分脫脂等不同類型，此外 乳清粉、濃縮乳也可能被企業(yè)用于液態(tài)奶生產(chǎn)。復(fù)原乳(reconstitutedmiIk)是指將干燥 的或者濃縮的乳制品與水按比例混勻后獲得的乳液。本發(fā)明將"熱處理"具體定義為"采用 加熱技術(shù)且強(qiáng)度不低于己氏殺菌、殺滅和抑制生乳中微生物生長(zhǎng)使得堿性憐酸酶呈陰性， 同時(shí)控制其物理化學(xué)性狀只發(fā)生有限變化的操作統(tǒng)稱"。本發(fā)明將"己氏殺菌"具體定義為 "經(jīng)低溫長(zhǎng)時(shí)間（62°C~65°C，保持30min)或經(jīng)高溫短時(shí)間（72°C~76°C，保持15s;或80°C~ 85°C，保持10s~15s)的處理方式"。
[0006] 下面對(duì)慷氨酸、乳果糖含量的測(cè)定方法進(jìn)行描述。
[0007] ( - )慷氨酸含量的測(cè)定方法：
[000引牛奶在加熱過(guò)程中梅拉德反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和糖生成慷氨酸（ε-Ν-2-巧喃甲基-1^-賴 氨酸）。試樣經(jīng)鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)C18萃取，用高效液相色譜化PLC)或超 高效液相色譜(WLC)在紫外(280nm)檢測(cè)器下對(duì)慷氨酸樣品進(jìn)行分析，W外標(biāo)法定量慷氨 酸。最后計(jì)算每百克蛋白質(zhì)中慷氨酸的含量。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明對(duì)慷氨酸含量的測(cè)定方 法中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中一級(jí)水。
[0009]本發(fā)明慷氨酸含量測(cè)定方法所使用的試劑為：
[0010] 甲醇（c出OH):色譜純。
[001" 3mol/L鹽酸溶液：在7.5mL水中加入2.5mL濃鹽酸（12mol/U，混勻。
[001 ^ 10.6mo1/L鹽酸溶液：在12mL水中加入88mL濃鹽酸（12mo1/U，混勻。
[0013] 0.1%Ξ氣乙酸溶液:吸取1血Ξ氣乙酸(色譜純)溶于水中，定容至1L，超聲波脫氣 35min〇
[0014] 6g/LKC1溶液(m/v):準(zhǔn)確稱量6gKC1溶于部分水中，定容至1L，過(guò)0.45皿水相濾 膜，超聲波脫氣35min。
[001引慷氨酸(furosine)(e-N-(2-巧喃甲基)-k賴氨酸)標(biāo)準(zhǔn)膽備溶液:將慷氨酸標(biāo)準(zhǔn) 物按其純度換算后，用3mol/L鹽酸溶液配制成2(K)yg/mL的標(biāo)準(zhǔn)膽備溶液，-20°C條件下可膽 存24個(gè)月。
[0016] 慷氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：微量移液器吸取250化標(biāo)準(zhǔn)膽備溶液于25mL容量瓶，W 3mol/L鹽酸溶液定容，配制成化g/mL慷氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
[0017] 高純度氮?dú)?99.99 %。
[0018] 本發(fā)明慷氨酸含量的測(cè)定方法使用的儀器為：
[0019] 高效液相色譜儀:配有梯度洗脫系統(tǒng)及紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。
[0020] 凱氏定氮儀。
[0021] C18萃取柱:柱容量500mg。
[0022] 干燥箱:110°C±2°C。
[0023] 密封耐熱試管:容積為20mL。
[0024] 注射器：10mL。
[00巧]容量瓶:容積分別為25mL和1L。
[00%]超高效液相色譜儀:配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。
[0027] 有機(jī)相濾膜:0.45皿。
[0028] 水相濾膜:0.45皿。
[0029] 慷氨酸含量的測(cè)定步驟如下：
[0030] 步驟一、采樣:取不少于200mL液態(tài)奶作為實(shí)驗(yàn)樣品，將樣品在0°C~4°C條件下保 存。
[00別]步驟二、水解液的制備：吸取2 .OOmL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6mL的 10.6mol/L鹽酸溶液，混勻，往試管中緩慢通入所述高純度氮?dú)釯min~2min，密閉試管，將試 管置于干燥箱，在ll〇°C下加熱約比后，輕輕搖動(dòng)試管，繼續(xù)加熱直至加熱2祉~2地。加熱結(jié) 束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后過(guò)濾，制得水解液。
[0032] 步驟Ξ、水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：吸取2.OOmL步驟二制得的水解液，按GB/T 5009.5測(cè)定試樣溶液中蛋白質(zhì)含量。
[0033] 步驟四、水解液的純化:將C18萃取柱安裝在注射器上。分別用5mL甲醇和lOmL水潤(rùn) 濕萃取柱，保持萃取柱濕潤(rùn)狀態(tài)。吸取0.500mL步驟二中水解液于萃取柱，用注射器緩慢推 入C18萃取柱內(nèi)。吸取3mol/L鹽酸溶液緩慢洗脫萃取柱中的樣品至3mL。
[0034] 步驟五、慷氨酸含量的測(cè)定:該步驟采用W下兩種方法測(cè)定。（a)HPLC法；（b)UPLC 法。
[0035] (a)HPLC法：
[0036] 1)色譜參考條件
[0037] 色譜柱:C18硅膠色譜柱，250mmX4.6mm，5μηι粒徑，或相當(dāng)者。
[003引柱溫：32°C。
[0039] 流動(dòng)相:0.1 %Ξ氣乙酸溶液(5.1.2.4)為流動(dòng)相A，甲醇(5.1.2.1)為流動(dòng)相B。
[0040] 洗脫梯度:見(jiàn)表1。
[0041 ]表1洗脫梯度
[0042]
[00創(chuàng) 2)測(cè)定
[0044] 利用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液巧0:50)?ImL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。注入20 化~50化的3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，W檢測(cè)溶劑的純度。注入10化待測(cè)溶液(步驟四得到 的純化后的水解液)測(cè)定慷氨酸含量。
[0045] b)lPLC法
[0046] 1)色譜參考條件
[0047] 色譜柱:WATERSACQUITYUPLC彩HSST3色譜柱 1.祉m(100mmX2.1mm)，或相當(dāng) 者。
[004引柱溫：30。(3。
[0049] 流動(dòng)相:6g/LKC1溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，純水為流動(dòng)相C。
[(K)加]洗脫條件:流動(dòng)相A，0.4mL/min。
[005U2)測(cè)定
[0化2] 分別利用流動(dòng)相B、C、AW〇.4mL/min的流速依次平衡色譜系統(tǒng)。注入化L~化L的 3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，W檢測(cè)溶劑的純度。注入化L待測(cè)溶液(步驟四得到的純化后的 水解液)測(cè)定慷氨酸含量。
[0053] 步驟六、慷氨酸含量計(jì)算結(jié)果:慷氨酸含量W質(zhì)量分?jǐn)?shù)W計(jì)，數(shù)值W毫克每百克蛋 白質(zhì)(mg/lOOg蛋白質(zhì))表示，按公式(2)計(jì)算：
[0054]
...............................................(2)
[0055] 式中；
[0056] W樣品中慷氨酸含量，單位為毫克每百克蛋白質(zhì)(mg/lOOg蛋白質(zhì)）；
[0057] At測(cè)試樣品中慷氨酸峰面積的數(shù)值；
[0058] Astd慷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，慷氨酸峰面積的數(shù)值；
[0059] Cstd慷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mg/l;
[0060] D測(cè)定時(shí)稀釋倍數(shù)(D= 6);
[0061] m樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，單位為克每升(g/L)。
[0062] 計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位。
[0063] 本發(fā)明中，上述慷氨酸含量的測(cè)定方法精密度控制如下：
[0064] 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的10%， 在重現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的20%。
[0065] 上述HPLC和UPLC檢測(cè)方法的檢測(cè)限和定量限分別如表2所示。
[0066] 表2HPLC和UPLC的檢測(cè)限和定量限
[0067]
[006引（二)乳果糖含量的測(cè)定
[0069]奶樣中加入硫