專利名稱：單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及單克隆抗體的生成，具體涉及識別纖維蛋白yC結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體以及將所述單克隆抗體用作治療劑的方法。介紹當(dāng)免疫系統(tǒng)攻擊大腦和脊髓時發(fā)生多發(fā)性硬化，從而損害隔離和保護(hù)神經(jīng)纖維的髓鞘。稱為小膠質(zhì)細(xì)胞的腦細(xì)胞參與這種攻擊并且在本應(yīng)保護(hù)腦部不受入侵物損害的細(xì)胞襯里血腦屏障(BBB)受到破壞時被激活。由于BBB受到破壞，稱為纖維蛋白原的血蛋白滲漏至腦部。除在凝血中的已知作用以外，纖維蛋白原還激活小膠質(zhì)細(xì)胞并因此增加多發(fā)性硬化動物模型的炎癥反應(yīng)。另外，已經(jīng)確定纖維蛋白原牽涉某些癌癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和其它疾病的發(fā)病機(jī)理以及發(fā)生組織損傷并由此使纖維蛋白原“滲漏”的病變。參見例如， Akassoglou 等，2002，Neuron, 33 :861-875 ；Akassoglou 等，2004，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 :6698-6703 ；Adams 等，2007，J. Exp. Med. ,35 :2428_34。還已確定纖維蛋白原用于介導(dǎo)這些效應(yīng)的特異性受體Mac-I不牽涉纖維蛋白原的有益凝結(jié)性質(zhì)。然而，至今未開發(fā)出纖維蛋白原/Mac-I結(jié)合的特異性抑制劑。因此，需要的是降低受試者腦部和其它部位纖維蛋白原的促炎影響，同時保持纖維蛋白原在凝血中的有益作用的纖維蛋白原/Mac-I結(jié)合的特異性抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的分離抗體。在本發(fā)明的某些方面，抗體表現(xiàn)出對小膠質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域粘附高于20%的抑制。另一方面，抗體表現(xiàn)出對Mac-I與纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域結(jié)合高于50%的抑制。又一方面，抗體抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)復(fù)發(fā)時的臨床癥狀。在各個實(shí)施方案中，抗體結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y377—395表位。本發(fā)明的抗體可選地結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y19°_2(l2表位。這種抗體為單克隆抗體，并且在各個方面為人源化抗體或人抗體。在本發(fā)明的各個方面，抗體包含具有3個包含包括RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ IDNO :2)、QMSNLAS(SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT(SEQ ID NO :4)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈。在各個方面，抗體包含具有3個包含包括GYTFTSYWIH(SEQ ID NO :6)、 LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO 7)和 SDPTGC(SEQ ID NO 8)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈。某些情況下，抗體包含具有3個包含包括RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO :2)、 QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有 3 個包含包括 GYTFTSYWIH(SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO :7)禾口 SDPTGC(SEQ ID NO :8)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈。在各個方面，以上抗體包含SEQ ID NO 1的輕鏈可變氨基酸序列。在各個方面，以上抗體包含SEQ ID NO 5的重鏈可變氨基酸序列。在又一方面，以上抗體包含SEQ ID NO 1的輕鏈可變氨基酸序列和SEQ ID NO 5的重鏈可變氨基酸序列。在本發(fā)明的又一方面，以上抗體單獨(dú)包含具有3個包含與包括 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的序列有至少80%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與包 GYTFTSYffIH (SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO 7)和 SDPTGC (SEQ ID N0: 8)序列有至少80%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。在本發(fā)明的又一方面，以上抗體單獨(dú)包含具有3個包含與包括 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與包 GYTFTSYffIH (SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO 7)和 SDPTGC (SEQ ID N0: 8)序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。在本發(fā)明的又一方面，以上抗體單獨(dú)包含具有3個包含與包括 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的序列有至少95%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與包 GYTFTSYffIH (SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO 7)和 SDPTGC (SEQ ID N0: 8)序列有至少95%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。在本發(fā)明的又一方面，以上抗體單獨(dú)包含具有3個包含與包括 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的序列有至少99%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與包 GYTFTSYffIH (SEQ ID NO :6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO :7)和 SDPTGC (SEQ ID NO 8)序列有至少99%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。還提供了一種減輕與Mac-I結(jié)合纖維蛋白或Mac-I結(jié)合纖維蛋白原相關(guān)的病變癥狀的方法，所述方法包括向期望這種減輕的受試者按足以減輕受試者病變癥狀的量施用權(quán)利要求1所述的抗體。在本方法的各個方面，受試者為人。在各個方面，病變包括多發(fā)性硬化、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥。還提供了一種包含以上抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另一方面，提供包含上述抗體的試劑盒。又一方面，提供了一種包含編碼纖維蛋白y377—395表位、 CKKTTMKIIPFN RLTIG(SEQ ID NO 18)或其生物活性衍生物的核酸序列的載體。另一方面， 提供了一種包含載體的細(xì)胞。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種生成免疫特異性結(jié)合纖維蛋白y377_395表位或其生物活性衍生物的抗體的方法，所述方法包括向受試者施用第一劑量的權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述第一劑量足以在所述受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在各個方面，所述方法可進(jìn)一步包括向所述受試者施用第二劑量的所述細(xì)胞的步驟，其中所述第二劑量足以在所述受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在各個方面，所生成的抗體抑制所述受試者體內(nèi)的纖維蛋白/ Mac-I結(jié)合。另一方面，提供了一種篩選結(jié)合Mac-I受體并調(diào)節(jié)Mac-Ι受體活性的配體的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求1所述的抗體；(b)接觸纖維蛋白y377—395表位 CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO :18)或其生物活性衍生物，并且形成抗體/多肽復(fù)合體； (c)使所述抗體/多肽復(fù)合體與包含候選化合物的組合物接觸；和(d)確定候選化合物是否結(jié)合單克隆抗體；由此候選化合物的結(jié)合表明所述候選化合物為調(diào)節(jié)Mac-I受體活性的配體。參考以下描述、實(shí)例和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將變得更好理解。附圖本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解以下所述附圖僅僅為了說明目的。附圖并非旨在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。

圖1。與市售的Mac-I封閉性抗體(M1/70)相比，在595nm下進(jìn)行吸光度測量評估的單克隆抗體。圖2。ELISA測量與纖維蛋白原結(jié)合的單克隆抗體的結(jié)果。圖3。針對修飾的纖維蛋白y377_395表位的單克隆抗體5B8顯示出在抑制吞噬作用中的效果增強(qiáng)。圖4。在PLP EAE中與抗體(A)4E11和(B) 5B8有關(guān)的臨床癥狀首次發(fā)生后施用抗纖維蛋白抗體的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體5B8在復(fù)發(fā)時顯示抑制。發(fā)明詳述縮寫和定義除非另外定義，關(guān)于本發(fā)明使用的科學(xué)技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員普遍所理解的含義。另外，除非上下文另有需要，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)形式，而復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)形式。通常，結(jié)合本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)和寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)和雜交使用的命名法及其技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知且常用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。使用市售的試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明或如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)那樣或如本文所述進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。除非另外注明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到全面解釋，例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版(Sambrook 等，1989) Cold Spring Harbor Press ；Oligonucleotide Synthesis(MJ. Gait編，1984) ；Methods inMolecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook(J. E. Cellis 編，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編，1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 禾口 P.Ε· Roberts，1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures(A. Doyle、J. B. Griffiths 禾口 D· G. Newell 編，1993-1998)J.Wiley 禾口 Sons ;Methods in Enzymology (Academic Press，Inc.)； Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 禾口 CC. Blackwell 編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Mille 禾口 M. P. Calos 編，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等編，1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction， (Mullis 等編，1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E Coligan 等編，1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley 禾口 Sons，1999) ；Immunobiology (CA. Janeway 禾口 P.Travers,1997) ；Antibodies(P. Finch, 1997) ；Antibodies :apractical approach(D· Catty.編，IRL Press，1988-1989) ；Monoclonal antibodies :apractical approach(P. Shepherd 禾口 C·Dean 編，Oxford University Press,2000) ；Using antibodies :a laboratory manual (E. Harlow禾口D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)； The Antibodies (M. Zanetti 禾口 J. D. Capra 編，Harwood Academic Publishers，1995)； 禾口 Cancer Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等編，J. B. Lippincott Company,1993)。結(jié)合使用的命名法和本文所述抗體生成、雜交瘤生成、分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和藥物和制藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)程序和技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知且常用的。標(biāo)準(zhǔn)方法用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和遞送以及患者的治療。除非另外注明，根據(jù)本公開所用的以下術(shù)語應(yīng)被理解為具有以下含義抗體如本文所使用的術(shù)語“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有免疫結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子?？贵w包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、dAb (結(jié)構(gòu)域抗體)、單鏈、Fab、Fab,和F(ab, )2片段、單鏈Fv片段(scFv)和Fab表達(dá)文庫。已知抗體基本結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。每個四聚體由2對相同的多肽鏈組成，每一對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括約100至110個或更多個主要負(fù)責(zé)抗原識別的氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分限定了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。通常，從人獲得的抗體分子涉及任何類別IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD，分子中存在的重鏈的性質(zhì)互不相同。某些類別也具有子類，例如IgG1Ugh和其它。而且，在人體中，輕鏈可為κ鏈或λ鏈。單克隆抗體如本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體” (MAb)或“單克隆抗體組合物”指含有由唯一輕鏈基因產(chǎn)物和唯一重鏈基因產(chǎn)物組成的唯一一個物種的抗體群體。具體而言，在群體的所有分子中單克隆抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域(CDR)相同。Mab含有能夠免疫結(jié)合特征在于對其有獨(dú)特結(jié)合親和力的抗原的特定表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)/結(jié)合部分術(shù)語“抗原結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部分”指抗體分子參與抗原結(jié)合的部分。抗原結(jié)合位點(diǎn)由重鏈(“H”)和輕鏈(“L”)的N端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。重鏈和輕鏈的V區(qū)內(nèi)3個稱為“高變區(qū)”的高度分支延伸插入多個稱為“骨架區(qū)”或“FR”的保守側(cè)向延伸段之間。因此，術(shù)語“FR”指免疫球蛋白的高變區(qū)之間天然存在且與之相鄰的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的3個高變區(qū)和重鏈的3個高變區(qū)相對于彼此呈三維空間布置以形成抗原結(jié)合表面?？乖Y(jié)合表面與結(jié)合抗原的三維表面互補(bǔ)，并且每條重鏈和輕鏈的3個高變區(qū)稱為“互補(bǔ)性決定區(qū)域”或“⑶R”。根據(jù)Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health， Bethesda， Md. (1987及 1991))或Chothia&Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987) ,Chothia等，Nature 342 :878-883(1989)的定義為每個結(jié)構(gòu)域分配氨基酸。CDR鑒定指南可在http://www. bioinf. org. Uk/abs/#cdrid 得到。表位如本文所使用的術(shù)語“表位”包括抗原能夠特異性結(jié)合抗體或T細(xì)胞受體的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基群(grouping)組成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。例如，可增加針對多肽的N端或C端肽的抗體。據(jù)稱當(dāng)解離常數(shù)彡1 μ M，優(yōu)選彡IOOnM且最優(yōu)選彡IOnM 時，抗體特異性結(jié)合抗原?？扇绫绢I(lǐng)域中技術(shù)人員提供的那樣確定y377—395表位CKKTTM KIIPFNRLTIG(SEQ ID NO :18)的生物活性衍生物。參見例如，Ugarova 等，Identification of a novel recognition sequence for integrin a M β 2within the y-chain of fibrinogen.J Biol Chem. 1998 ；273 :22519-22527 ；Ugarova φ, Recognition of fibrinogen by leukocyte integrins. Ann N Y Acad Sci. 2001 ；936 :368_385。免疫結(jié)合如本文所使用的術(shù)語“免疫結(jié)合”和“免疫結(jié)合性質(zhì)”指免疫球蛋白分子和對免疫球蛋白有特異性的抗原之間發(fā)生的這種類型的非共價相互作用。免疫結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或親和力根據(jù)相互作用的解離常數(shù)(Kd)表示，其中Kd越小表示親和力越強(qiáng)。可使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法定量所選多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)。一種這樣的方法需要測量抗原結(jié)合位點(diǎn)/抗原復(fù)合體形成和解離的速率，其中那些速率取決于復(fù)合體伴侶的濃度、相互作用的親和力和同樣影響兩個方向的速率的幾何參數(shù)。因此，可通過計(jì)算濃度和締合和解離的實(shí)際速率確定“結(jié)合速率常數(shù)”(Kg合)和“解離速率常數(shù)”(Kiiw)。(參見Nature361 186-87 (1993) )。之比使得能夠消除與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，并且等于解離常數(shù) Kd(通常參見，Davies 等(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。據(jù)稱，當(dāng)通過例如放射性配體結(jié)合檢測或本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的相似檢測測定，平衡結(jié)合常數(shù)(Kd) ^ ΙμΜ, 優(yōu)選彡ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選彡IOnM且最優(yōu)選彡IOOpM至約IpM時，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合纖維蛋白原y377_395表位。纖維蛋白和纖維蛋白原如本文所使用的術(shù)語“纖維蛋白”和“纖維蛋白原”可交換地使用并且指保持Mac-I結(jié)合能力的多肽、片段或類似物。纖維蛋白原是纖維蛋白的可溶性前體并且均保持yC結(jié)構(gòu)域并因此保持本發(fā)明的表位。分離的多核苷酸如本文所使用的術(shù)語“分離的多核苷酸”應(yīng)指基因組、cDNA或其合成起源或一些組合的多核苷酸，由于其起源，“分離的多核苷酸”(1)與其中“分離的多核苷酸”天然存在的所有或部分多核苷酸無關(guān)，(2)可操作地與在自然界中并未連接的多核苷酸連接，或(3)并非作為較大序列的一部分天然存在。分離蛋白質(zhì)本文所指的術(shù)語“分離蛋白質(zhì)”指cDNA、重組RNA或其合成起源或一些組合的蛋白質(zhì)，由于其起源或衍生來源，“分離蛋白質(zhì)”(1)與自然界中存在的蛋白質(zhì)無關(guān)，(2)無來自相同來源的其它蛋白質(zhì)，(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)在自然界中不存在。多肽本文使用的術(shù)語“多肽”指天然蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和多肽序列的片段或類似物。天然蛋白質(zhì)片段和類似物被認(rèn)為是多肽屬種類。根據(jù)本發(fā)明，多肽的實(shí)例包括表示為SEQ ID NO :1的輕鏈免疫球蛋白分子和表示為SEQ ID NO :5的重鏈免疫球蛋白分子以及表示為SEQ ID N0:2、3、4、6、7和8的⑶R，由包含重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子，例如κ輕鏈免疫球蛋白分子的組合(反之亦然)形成的抗體分子及其片段和類似物。天然存在如本文所使用的應(yīng)用于一個對象的術(shù)語“天然存在”指對象在自然界中存在的事實(shí)。例如，可從自然界中的來源分離的生物(包括病毒)中存在并且在實(shí)驗(yàn)室未受人為有意修飾的多肽或多核苷酸序列天然存在?？刹僮鞯剡B接如本文所使用的術(shù)語“可操作地連接”指所述組分所處的位置關(guān)系允許它們按預(yù)期的方式發(fā)揮作用。“可操作地連接”至編碼序列的控制序列按照在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)的方式連接?？刂菩蛄腥绫疚乃褂玫男g(shù)語“控制序列”指實(shí)現(xiàn)與之相連的編碼序列的表達(dá)和加工所必需的多核苷酸序列。這種控制序列的性質(zhì)存在差異，這取決于宿主生物。在原核生物中，這種控制序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。在真核生物中， 通常這種序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“控制序列”旨在至少包括其存在對于表達(dá)和加工所必需的所有組分并且還可包括其存在有利的另外的組分，例如前導(dǎo)序列和融合伴侶序列。多核苷酸如本文所使用的術(shù)語“多核苷酸”指長度為至少10個堿基的核苷酸聚合化合物，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。寡核苷酸如本文所使用的術(shù)語寡核苷酸包括通過天然存在和非天然存在的寡核苷酸鍵連在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸。寡核苷酸為通常包含長度為200個或更少堿基的多核苷酸亞類。優(yōu)選地，寡核苷酸長度為10至60個堿基，并且最優(yōu)選地長度為12、 13、14、15、16、17、18、19或20至40個堿基。雖然寡核苷酸可能為雙鏈，例如用于構(gòu)建基因突變體中，但是例如對于探針而言，寡核苷酸通常為單鏈。本發(fā)明的寡核苷酸為正義或反義寡核苷酸。天然存在的核苷酸如本文所使用的術(shù)語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提到的術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷酸”包括具有經(jīng)修飾或取代的糖基等的核苷酸。本文提到的術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括例如硫代磷酸、phosphoroselerloate, phosphoroaniIothioate、phoshoraniIadate 等寡核苷酸鍵。參見例如，LaPlanche 等， Nucl. Acids Res. 14 :9081 (1986) ；Stec 等，J. Am. Chem. Soc. 106 :6077 (1984)，Stein 等， Nucl. Acids Res. 16 :3209(1988), Zon^, Anti Cancer Drug Design 6 :539(1991) ；Zon 等，Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach,第 87-108頁(F. Eckstein 編，Oxford University Press,Oxford England(1991)) ；Stec等，美國專利No. 5，151，510 ; Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)。若需要，寡核苷酸可包括用于檢測的標(biāo)記。選擇性雜交如本文所使用的術(shù)語“選擇性雜交”指可檢測地和特異性地結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明所述的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在將與非特異性核酸可檢測結(jié)合的可觀量減到最少的雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性雜交。高嚴(yán)格性條件可用于實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域已知的和本文所討論的選擇性雜交條件。通常，本發(fā)明的多核苷酸、寡核苷酸和片段與目標(biāo)核酸序列之間的核酸序列同源性為至少80%，且更為典型的是優(yōu)選提高的同源性，至少85%、 90 %、95 %、99 %和100 %。如果2個氨基酸序列之間存在部分或完全同一性，則2個氨基酸序列同源。例如，85%同源性指在比對2個序列的最大匹配時85%的氨基酸相同。在最大匹配中允許(在匹配的2個序列的任一個中)空位，空位長度優(yōu)選為5或更小，更優(yōu)選為2 或更小?？蛇x且優(yōu)選地，如本文使用的這個術(shù)語，如果使用具有突變數(shù)據(jù)矩陣的ALIGN程序測量2個蛋白質(zhì)序列的比對得分大于5 (標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)且空位罰分為6或更高，則2個蛋白質(zhì)序列(或源自蛋白質(zhì)序列的長度為至少30個氨基酸的多肽序列)同源。參見Dayhoff， Μ. 0. , Atlas of Protein Sequence and Structure 中第 101-110 頁(第 5 卷，National Biomedical Research Foundation (1972))和本卷的增刊 2，第 1-10 頁。如果使用 ALIGN 程序最優(yōu)比對時2個序列的氨基酸大于或等于50%相同，這2個序列或其部分更優(yōu)選為同源。本文使用術(shù)語“相應(yīng)”指多核苷酸序列與所有或一部分參考多核苷酸序列同源(即，相同，非嚴(yán)格性進(jìn)化相關(guān))，或多肽序列與參考多肽序列相同。相反，本文使用術(shù)語“互補(bǔ)”指互補(bǔ)序列與所有或一部分參考多核苷酸序列同源。舉例說明，核苷酸序列“TATAC”相應(yīng)于參考序列“TATAC”并且與參考序列“GTATA”互補(bǔ)。以下術(shù)語用于描述兩個或多個多核苷酸或氨基酸序列之間的序列關(guān)系“參考序列”、“比較窗口(comparison window) ”、“序列同一性”、“序列同一性％ ”和“大體同一性”。參考序列“參考序列”是用作序列比較的基準(zhǔn)的定義序列。參考序列可為較大序列亞類，例如序列表中指定的全長cDNA或基因序列的一段或可能包含完整cDNA或基因序列。通常，參考序列長度為至少18個核苷酸或6個氨基酸，經(jīng)常長度為至少M(fèi)個核苷酸或 8個氨基酸，并且常常長度為至少48個核苷酸或16個核苷酸。由于兩個多核苷酸或氨基酸序列可能各自(1)包含兩個分子之間的相似序列(即，完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，并且( 可能進(jìn)一步包含兩個多核苷酸或氨基酸序列之間的分支序列，通常通過比較兩個分子“比較窗口 ”上的序列進(jìn)行兩個(或多個)分子之間的序列比較以鑒定和比較序列相似的局部區(qū)域。比較窗口 如本文所使用的術(shù)語“比較窗口”指至少18個鄰近核苷酸位置或6 個氨基酸的概念片段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可與至少18個鄰近核苷酸或6個氨基酸序列的參考序列比較，并且其中與參考序列(不包含添加或缺失)相比進(jìn)行兩個序列的最優(yōu)比對，比較窗口中這部分的多核苷酸序列可能包含20%或更少的添加、缺失、 取代等?？赏ㄟ^Smith和Waterman Adv. App 1. Math. 2 =482(1981)的局部同源性算法，通過 Needleman 和 Wunsch J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同源性比對算法，通過 Pearson 禾口 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 85 :2444 (1988)的相似性搜索法，通過計(jì)算機(jī)化執(zhí)行這些算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0 中 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA(Genetics Computer Group,575Science Dr. , Madison, Wis.), Geneworks 或 MacVector軟件包)，或通過檢查進(jìn)行比對比較窗口的序列最優(yōu)比對，并且選擇用各種方法生成的最佳比對(即，產(chǎn)生比較窗口的同源性時期最高％ )。序列同一性術(shù)語“序列同一性”指比較窗口上兩個多核苷酸或氨基酸序列相同 (即在核苷酸與核苷酸或殘基與殘基基礎(chǔ)上)。術(shù)語“序列同一性％”通過以下進(jìn)行計(jì)算 比較比較窗口上兩個最優(yōu)比對序列，確定兩個序列中相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、U或 I)或殘基出現(xiàn)的位置的數(shù)量以獲得匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中位置的總數(shù)量(即，窗口大小)，并用結(jié)果乘以100，獲得序列同一性％。如本文所使用的術(shù)語 “大體同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中多核苷酸或氨基酸包含與至少18個核苷酸(6個氨基酸)位置的比較窗口上，通常在至少M(fèi)-48個核苷酸(8-16個氨基酸)位置的窗口上的參考序列相比，具有至少85%序列同一性，優(yōu)選至少90至95%序列同一性， 更通常具有至少99%序列同一性的序列，其中通過在比較窗口上比較參考序列和可能包括為參考序列總計(jì)20%或更少的缺失或添加的序列計(jì)算序列同一性％。參考序列可為較大序列的亞類。氨基酸如本文所使用，20個常規(guī)氨基酸及其縮寫按照常規(guī)使用。參見 Immunology-Α Synthesis (第 2 版，E. S. Golub 禾口 D. R. Gren 編，Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991))。20個常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(例如α _，α - 二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸)和其它非常規(guī)氨基酸也可能為本發(fā)明多肽的適合組分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4-羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、ε-N， N，N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、 3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、α -N-甲基精氨酸和其它相似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。在本文所使用的多肽標(biāo)記法中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例，左側(cè)方向?yàn)榘被朔较蚨覀?cè)方向?yàn)轸然朔较?。類似地，除非另外說明，單鏈多核苷酸序列的左側(cè)端為5'端，而雙鏈多核苷酸序列的左側(cè)方向稱為5'方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物的5'至3'添加方向稱為 DNA鏈上具有與RNA相同序列的轉(zhuǎn)錄方向序列區(qū)域，RNA轉(zhuǎn)錄物的5'至5'端稱為“上游序列”，DNA鏈上具有與RNA相同序列的序列區(qū)域，并且RNA轉(zhuǎn)錄物的3'至3'端稱為“下游序列”。大體同一性如應(yīng)用于多肽，術(shù)語“大體同一性”指例如通過GAP或BESTFIT程序， 使用默認(rèn)空位權(quán)重進(jìn)行最優(yōu)比對時，兩個肽序列共有至少80%序列同一性，優(yōu)選至少90% 序列同一性，更優(yōu)選至少95%序列同一性和最優(yōu)選至少99%序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置由于保守性氨基酸取代不同。保守性氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的可交換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸為甘氨酸、丙胺酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸； 一組具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺的側(cè)鏈的氨基酸為天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸為半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸取代基團(tuán)為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙胺酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。如本文所討論，認(rèn)為抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的變化涵蓋于本發(fā)明中，條件是氨基酸序列的變化保持至少75 %，更優(yōu)選至少80 %、90 %、95 %和最優(yōu)選99 %。 包括其間的某些百分比，例如 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 和 99%序列同一性。尤其，包括保守性氨基酸置換。保守性置換是在與側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中發(fā)生的置換。遺傳編碼的氨基酸通常分為以下家族(1)酸性氨基酸為天冬氨酸、谷氨酸；(2) 堿性氨基酸為賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，和(4)不帶電的極性氨基酸為甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。親水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。其它氨基酸家族包括(i)為脂肪族羥基家族的絲氨酸和蘇氨酸；(ii)為含有酰胺的家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)為脂肪族的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；和(iv)為芳香族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，有理由期望用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)置換亮氨酸，用谷氨酸單獨(dú)置換天冬氨酸，用絲氨酸單獨(dú)置換蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸對氨基酸進(jìn)行相似置換對所得分子的結(jié)合或性質(zhì)無較大影響，特別是如果置換不牽涉骨架位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸時。通過檢測多肽衍生物的特異性活性可易于確定氨基酸變化是否產(chǎn)生功能性肽。本文對檢測進(jìn)行了詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可易于制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。片段或類似物的優(yōu)選氨基端和羧基端出現(xiàn)在功能結(jié)構(gòu)域邊界附近。可通過比較核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)和公共或私有序列數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地， 使用計(jì)算機(jī)化比較法鑒定其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的序列基序或預(yù)測蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。鑒定折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法已知。Bowie等義化?。、?253 =164(1991)。因此，前述實(shí)例證明本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明識別可能用于限定結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。優(yōu)選的氨基酸取代為(1)降低蛋白質(zhì)水解易感性的取代，(2)降低氧化易感性的取代，(3)改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)合親和力的取代，(4)改變結(jié)合親和力的取代，和
賦予或修飾這種類似物的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)的取代。類似物可包括除天然存在的肽序列之外的序列的各種突變蛋白質(zhì)。例如，可在天然存在序列(優(yōu)選地在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外的多肽部分)中產(chǎn)生單個或多個氨基酸取代(優(yōu)選地保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代不應(yīng)大體上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，置換氨基酸不應(yīng)趨于打破親本序列中存在的螺旋，或破壞表征親本序列的其它類型的二級結(jié)構(gòu))。Proteins，Structures and Molecular Principles (Creighton 編，W. H. Freeman and Company,New York(1984))； Introduction to Protein Structure(C. Branden禾口 J. Tooze編，Garland Publishing,New York,N. Y. (1991))；和 Thornton 等 Nature 354 :105(1991)中描述了本領(lǐng)域公認(rèn)的多肽二級和三級結(jié)構(gòu)的實(shí)例。多肽片段如本文所使用的術(shù)語“多肽片段”指具有氨基端和/或羧基端缺失，但是其中剩余氨基酸序列與(例如)由全長cDNA序列推斷的天然存在序列中相應(yīng)位置相同的多肽。片段通常為至少5、6、8或10個氨基酸長，優(yōu)選至少14個氨基酸長，更優(yōu)選至少20 個氨基酸長，通常為至少50個氨基酸長，甚至更優(yōu)選至少70個氨基酸長。如本文所使用的術(shù)語“類似物”指由具有至少5個氨基酸，具有與推斷氨基酸序列的一部分的大體同一性的片段組成并且在適合結(jié)合條件下對纖維蛋白y377_395表位、CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO: 18)或其生物活性衍生物具有特異性結(jié)合的多肽。通常，多肽類似物包含關(guān)于天然存在序列的保守性氨基酸取代(或添加或缺失)。通常類似物為至少5個氨基酸長，優(yōu)選至少10個氨基酸長或更長，并且常常可與天然存在的全長多肽一樣長。肽類似物通常作為具有與模板肽類似性質(zhì)的非肽藥物用于制藥業(yè)中。這些類型的非肽化合物稱為“肽模擬物”或“模擬肽”。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 29 (1986), Veber 和 Freidinger TINS，第 392 頁(1985)；和 Evans 等，J. Med. Chem. 30 :12 (1987)。常常借助于計(jì)算機(jī)化分子建模研發(fā)這種化合物。與治療上有用的肽結(jié)構(gòu)上相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生等效治療或預(yù)防效果。通常，模擬肽與范例性多肽(即，具有生物化學(xué)性質(zhì)或藥理學(xué)活性的多肽，例如人抗體)結(jié)構(gòu)相似，但是有一個或多個肽鍵通過本領(lǐng)域眾所周知的方法被選自以下的鍵任選地置換-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH = CH-(順式和反式)、-C0CH2-、 CH(OH)CH2-*-CH2SO-。用相同類型的D-氨基酸對共有序列的一個或多個氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)性取代(例如用D-賴氨酸置換L-賴氨酸)可用于生成更穩(wěn)定的肽。另外，可通過本領(lǐng)域已知的方法(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387(1992))；例如通過添加能夠形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基生成包含共有序列或大體上相同的共有序列變化的限制性肽。試劑如本文所使用的術(shù)語“試劑”表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制備的提取物。標(biāo)記如本文所使用的術(shù)語“標(biāo)記”或“標(biāo)記的”指(例如)通過并入放射性標(biāo)記的氨基酸或可由標(biāo)記抗生物素蛋白(例如含有可通過光學(xué)或測熱法檢測的熒光標(biāo)記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白)檢測的生物素部分的多肽連接來并入可檢測的標(biāo)記物。在某些情況下，標(biāo)記或標(biāo)記物也可為治療性的。標(biāo)記多肽和糖蛋白的各種方法在本領(lǐng)域中已知并且可使用。多肽標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素(例如，咕、 wC、15N、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、131I)、-*#E (例如，F(xiàn)ITC、若丹明、稀土元素磷光體)、酶標(biāo)記(例如，辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光的生物素組、 由二級報(bào)告子識別的預(yù)定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈成對序列、二次抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記與各種長度的間隔臂連接以減少可能的位阻。藥劑或藥物如本文所使用的術(shù)語“藥劑”或“藥物”指當(dāng)向患者適當(dāng)施用時能夠誘導(dǎo)預(yù)期療效的化合物或組合物。如 The McGraw-Hi 11 Dictionary of Chemical Terms (Parker, S.編， McGraw-Hill, San Francisco (1985))例證，根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)用法使用本文的其它化學(xué)術(shù)語?；旧霞兊娜绫疚乃褂玫男g(shù)語“基本上純的”指目標(biāo)種類為存在的主要種類 (即，按摩爾計(jì)，比組合物中任何其它個別種類量更大)，并且優(yōu)選地，基本上純的成分是其中目標(biāo)種類包含存在的所有大分子種類的至少約50% (按摩爾計(jì))的組合物。通常，基本上純的組合物包含組合物中存在的所有大分子種類的約80%以上，更優(yōu)選地約85%、90%、 95%和99%以上。最優(yōu)選地，將目標(biāo)種類純化至基本均一(通過常規(guī)檢測方法在組合物中不可檢測出污染種類)，其中組合物基本上由單個大分子種類組成?；颊呷绫疚乃褂玫男g(shù)語患者包括人和獸醫(yī)受試者。單克隆抗體本發(fā)明提供了抑制纖維蛋白原-Mac-I結(jié)合的單克隆抗體。尤其，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合纖維蛋白和纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y377—395表位的單克隆抗體。本發(fā)明還提供了結(jié)合纖維蛋白和纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y19°_2°2表位的抗體。這種抗體阻斷了神經(jīng)系統(tǒng)中纖維蛋白的損害作用，而不影響其在血液凝固中的有益作用。這種單克隆抗體可阻斷MS斑和某些癌癥的形成。本發(fā)明的示例性抗體包括(例如)5B8抗體(靶向y377—395表位)。另外，本發(fā)明的抗體包括(例如)1E3抗體(靶向y19°_2(l2表位)。本文提供了與5B8抗體相關(guān)的各種多核苷酸和多肽序列和這些序列的用途。這些序列包括5B8輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO 1)、3 個輕鏈 CDR 氨基酸序歹Ij (CDR-L1,SEQ ID NO :2 ;CDR_L2，SEQ ID NO :3 ；和 CDR-L3，SEQ ID NO :4)、重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO :5)、3個重鏈CDR氨基酸序列(CDR-H1,SEQ ID NO: 6 ；CDR-H2，SEQ ID NO 7 ；禾口 CDR-H3, SEQ ID NO 8)、輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO 9)、重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO 10)、3 個輕鏈 CDR 的核苷酸序列(CDR-L1,SEQ ID NO 11 ；CDR-L2, SEQ ID NO 12 ；禾口 CDR-L3, SEQ ID NO 13)和 3 個重鏈 CDR 的核苷酸序列(CDR-H1, SEQ ID NO 14 ；CDR-H2, SEQ ID NO 15 ；和 CDR-H3，SEQ ID NO 16)。本發(fā)明的單克隆抗體具有抑制體外和體內(nèi)吞噬作用，阻斷體內(nèi)和體外細(xì)胞因子釋放和巨噬細(xì)胞激活、體內(nèi)和體外小膠質(zhì)細(xì)胞激活、體內(nèi)和體外炎癥性脫髓鞘和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，多發(fā)性硬化動物模型的臨床癥狀的能力。參見例如，通過引用整體并入本文的PCT公布WO 2007/038407。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識到本發(fā)明的單克隆抗體也可影響癌癥。參見例如，通過引用整體并入本文的PCT公布WO 2007/024817o另外，這種單克隆抗體可用于治療牽涉從受損組織的纖維蛋白原滲漏的疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病和中風(fēng)。參見例如，F(xiàn)lick等，J. Clin. Investigation, 2007,117, 11 :3224-3235 ；Akassoglou 等，2002，Neuron, 33 :861-875 ；Akassoglou 等，2004，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 :6698-6703 ；Adams 等，2007，J. Exp. Med.，35 :2428_34。應(yīng)注意，本發(fā)明的單克隆抗體降低了受試者腦部和其它地方纖維蛋白原的促炎性影響，同時保持纖維蛋白原在凝血中的有益作用，與影響凝血的化合物不同。本發(fā)明還包括結(jié)合與本文所述抗體相同的表位的抗體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到無需過度實(shí)驗(yàn)，通過確定單克隆抗體是否阻止本發(fā)明的單克隆抗體與纖維蛋白yC結(jié)構(gòu)域的y377—395表位或y19°_2°2表位結(jié)合就可能確定前者是否具有與后者相同的特異性。如果試驗(yàn)的單克隆抗體與本發(fā)明的單克隆抗體競爭，表現(xiàn)為本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合減少，則很可能兩種單克隆抗體與相同或密切相關(guān)的表位結(jié)合?？赏ㄟ^測量通過全長纖維蛋白原多肽上Mac-I受體阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞粘附的能力進(jìn)行本發(fā)明單克隆抗體的篩選。本文提供了這樣篩選的實(shí)例。本領(lǐng)域中已知的各種方法均可用于生產(chǎn)針對纖維蛋白原-Mac-I結(jié)合或針對其衍生物、片段、類似物、同源物或直系同源物的多克隆或單克隆抗體。(參見例如，Antibodies A Laboratory Manual,如上)。通過眾所周知的技術(shù)，例如使用主要提供免疫血清的IgG成分的蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G進(jìn)行親和色譜法純化抗體。隨后或可選地，可通過免疫親和色譜法將免疫球蛋白尋求的靶標(biāo)的特異性抗原或其表位固定在柱上以純化免疫特異性抗體。本發(fā)明的抗體(例如，5B8和1E3)為單克隆抗體。例如，用從經(jīng)肽抗原免疫的動物獲得的克隆生成抑制纖維蛋白原/Mac-I結(jié)合的單克隆抗體。通過使來自免疫動物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合生成細(xì)胞系。在體外從生成小鼠腹水的培養(yǎng)基純化抗體。以下實(shí)施例部分中還提供了生成抗體的方法。例如，使用雜交瘤方法，例如Kohler和Milstein，Nature, 256 :495(1975)所述的方法制備單克隆抗體。在雜交瘤方法中，通常用免疫試劑使小鼠、倉鼠或其它適當(dāng)?shù)乃拗鲃游镆砸錾苫蚰軌蛏蓪⑻禺愋越Y(jié)合免疫試劑的抗體的淋巴細(xì)胞。可選地，可在體外免疫淋巴細(xì)胞。
免疫試劑通常包括蛋白質(zhì)抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果需要人源細(xì)胞， 使用外周血淋巴細(xì)胞，或者如果需要非人哺乳動物來源，使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后使用適合的融合劑，例如聚乙二醇使淋巴細(xì)胞與永生化細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞 (Goding,Monoclonal Antibodies Principles and Practice,Academic Press, (1986)第 59-103頁)。永生化細(xì)胞系通常為轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，尤其是嚙齒動物、牛和人源骨髓瘤細(xì)胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？稍趦?yōu)選含有一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)的適合培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。例如，如果親本細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培養(yǎng)基”)，這些物質(zhì)阻礙HGPRT缺乏細(xì)胞的生長。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是有效融合，支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平抗體表達(dá)的細(xì)胞系，并且對培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是(例如)可從美國加利福尼亞州圣地亞哥沙克研究所細(xì)胞配送中心和馬納薩斯美國模式培養(yǎng)物保藏所獲得的鼠骨髓瘤系。還描述了將人骨髓瘤和小鼠-人異質(zhì)骨髓瘤細(xì)胞系用于生成單克隆抗體。(參見 Kozbor, J. Immunol.，133 :3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)第 51-63 頁))。然后可檢測培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中針對抗原的單克隆抗體的存在。優(yōu)選地，通過免疫沉淀反應(yīng)或通過體外結(jié)合檢測，例如放射性免疫檢測(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)確定雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這種技術(shù)和檢測在本領(lǐng)域中已知。例如，可通過 Munson 禾口 Pollard，Anal. Biochem.，107 :220 (1980) ；Patrono, C.禾口 Peskar, B. A.(編)Radioimmunoassay in Basic and Clinical Pharmacology. Heidelberg,Springer—Verlag, 1987 ；Dwenger,A. Radioimmunoassay :An Overview. J Clin Biochem 22 :883，1984的katchard分析確定單克隆抗體的結(jié)合親和力。而且，在單克隆抗體的治療應(yīng)用中，重要的是鑒定對靶抗原具有高度特異性和高結(jié)合親和力的抗體。鑒定所需雜交瘤細(xì)胞后，可通過限制稀釋法亞克隆克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長。(參見Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice，Academic Press， (1986)第59-103頁)。為此目的適合的培養(yǎng)基包括(例如)達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?？蛇x地，可使雜交瘤細(xì)胞在體外，如哺乳動物腹水中生長?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化亞克隆分泌的單克隆抗體。也可通過例如美國專利No. 4，816，567中所述的重組DNA法制備單克隆抗體。使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)易于分離并測序編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA。例如，SEQ ID NO :9和10提供了本發(fā)明5B8單克隆抗體的核苷酸序列。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞用作這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，就將DNA置于表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染到不會以其它方式生成免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中， 例如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以獲得在重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成。例如，也可通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源鼠序列(參見美國專利No. 4，816，567 ；Morrison, Nature 368,812-13(1994))或通過共價結(jié)合非免疫球蛋白多肽的免疫球蛋白編碼序列或編碼序列的一部分修飾DNA。可用這種非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或取代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生嵌合二價抗體。全人抗體為其中由人基因產(chǎn)生的輕鏈和重鏈的整個序列(包括⑶R)的抗體。這種抗體本文稱為“人抗體”或“全人抗體”。單克隆抗體可使用以下技術(shù)制備三源雜交瘤技術(shù)；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見Kozbor等，1983 Immunol Today 4 72)；和EBV雜交瘤技術(shù)以生成單克隆抗體(參見Cole等，19851η =Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)。可利用單克隆抗體并且可通過使用人雜交瘤(參見Cote 等，1983. Proc Natl Acad Sci USA 80 :2026-2030)或通過用體外易普斯坦-巴爾病毒轉(zhuǎn) itA B MM ( Cole φ, 19851η =Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)生成單克隆抗體。另外，還可使用另外的技術(shù)，包括噬菌體展示文庫生成人抗體(參見Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227 :381 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581 (1991))。類似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物(例如內(nèi)源免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠)體內(nèi)制備人抗體。一經(jīng)激發(fā)，就會觀察到人抗體生成，在各個方面與在人體中看到的非常類似，包括基因重排、裝配和抗體譜。例如，在美國專利No. 5，545, 807、 5，545，806、5，569，825、5，625，126、5，633，425、5，661，016 和 Marks 等，Bio/technology 10,779-783(1992) ；Lonberg 等，Nature 368 856-859(1994) ；Morrison, Nature 368， 812-13(1994) ；Fishwild φ, Nature Biotechnology 14,845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14,826 (1996)；禾口 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)中描述了這種方法。另外，可使用經(jīng)修飾以生成全人抗體而不生成對抗原激發(fā)反應(yīng)的動物內(nèi)源抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物生成另外的人抗體。在這種動物中，已經(jīng)使非人宿主中編碼重和輕免疫球蛋白鏈的內(nèi)源基因失能，并且將編碼人重鏈和輕鏈免疫球蛋白的活性基因座插入宿主基因組中。例如，SEQ ID NO :11-16提供了編碼單克隆抗體5B8的3個輕鏈和3個重鏈⑶R的核苷酸序列。例如，使用含有必需人DNA片段的酵母人工染色體并入人基因。然后通過雜交繁殖含有少于全部修飾的中間轉(zhuǎn)基因動物獲得提供了所有所需修飾的動物作為后代。這種非人動物的實(shí)例為Amgen (Thousand Oaks, CA)提供的稱為Xenomouse 的小鼠。這種動物生成分泌全人免疫球蛋白的B細(xì)胞。用目標(biāo)免疫原例如多克隆抗體制劑免疫后，可直接從動物獲得抗體，或可選地從源自動物的永生化B細(xì)胞，例如生成單克隆抗體的雜交瘤獲得抗體。另外，可回收并表達(dá)編碼具有人可變區(qū)的免疫球蛋白的基因以直接獲得抗體，或可進(jìn)一步修飾基因以獲得抗體的類似物，例如單鏈Fv(SCFV)分子。以缺乏內(nèi)源免疫球蛋白重鏈表達(dá)的小鼠為例，美國專利No. 5，939，598中公開了生成非人宿主的方法的實(shí)例?？赏ㄟ^包括以下步驟的方法獲得從胚胎干細(xì)胞中至少一個內(nèi)源重鏈基因座刪除J片段基因以防止基因座重排并防止重排免疫球蛋白重鏈基因座的轉(zhuǎn)錄物形成，通過含有編碼可選標(biāo)記物的基因的靶向載體實(shí)現(xiàn)刪除；和由胚胎干細(xì)胞生成體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有編碼可選標(biāo)記物的基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。美國專利No. 5，916，771中公開了一種生成目標(biāo)抗體(例如人抗體)的方法。這種方法包括將含有編碼重鏈的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO 10)的表達(dá)載體引入一種培養(yǎng)的哺乳動物宿主細(xì)胞中，將含有編碼輕鏈的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO 9)的表達(dá)載體引入另一種哺乳動物宿主細(xì)胞中，和使兩種細(xì)胞融合以形成雜交細(xì)胞。雜交細(xì)胞表達(dá)含有重鏈和輕鏈的抗體?？捎煤芯幋a上述單鏈抗體的DNA片段的載體表達(dá)抗體。這些包括載體、脂質(zhì)體、裸露DNA、佐劑輔助DNA、基因槍和導(dǎo)管。優(yōu)選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)軛合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼氏鼠白血病病毒。優(yōu)選DNA 病毒載體。這些載體包括痘載體(例如正痘病毒或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純皰疹 I 型病毒(HSV)載體)(參見 Geller，A. I.等，J. Neurochem，64 :487(1995) ；Lim, F.等，in DNA Cloning :Mammalian Systems, D. Glover 編，(Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995) ；Geller, A. I.等，ProcNat 1. Acad. Sci. :U. S. A. 90 :7603(1993) ；Geller, A. I.等，Proc Natl. Acad. Sci USA 87 :1149 (1990)、腺病毒載體(參見 LeGal LaSalle 等， Science, 259 :988(1993) ；Davidson 等，Nat. Genet 3 :219(1993) ；Yang 等，J. Virol. 69 2004(1995)和腺伴隨病毒載體(參見 Kaplitt, Μ. G.等，Nat. Genet. 8 :148(1994)。痘病毒載體將基因引入細(xì)胞質(zhì)。禽痘病毒載體僅引起核酸的短期表達(dá)。優(yōu)選腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和單純皰疹病毒(HSV)載體用于將核酸引入神經(jīng)細(xì)胞。腺病毒載體引起比腺伴隨病毒(約4個月)更短期的表達(dá)(約2個月)，而所述腺伴隨病毒比HSV載體更短。選擇的特定載體依賴于靶細(xì)胞和待治療的病狀。可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如感染、轉(zhuǎn)染、 轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化進(jìn)行引入。轉(zhuǎn)基因模式的實(shí)例包括(例如)裸露DNA、CaP04沉淀、DEAE葡聚糖、 電穿孔、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、細(xì)胞微注射和病毒載體。可采用載體基本上靶向任何所需靶細(xì)胞。例如，立體定位注射可用于將載體(例如，腺病毒、HSV)導(dǎo)向所需位置。另外，可通過使用微型輸注系統(tǒng)，例如SynchroMed輸注系統(tǒng)(Medtronic，Minneapolis，MN)進(jìn)行腦室內(nèi)(icv)輸注遞送顆粒?？墒褂玫钠渌椒ò▽?dǎo)管、靜脈內(nèi)、腸胃夕卜、腹膜內(nèi)和皮下注射和口服或其它已知施用途徑?？墒褂眠@些載體表達(dá)大量可按各種方法使用的抗體。例如，可使用抗體檢測纖維蛋白原和纖維蛋白原/Mac-I結(jié)合的存在?？墒辜夹g(shù)適于生成對本發(fā)明的抗原蛋白質(zhì)有特異性的單鏈抗體(參見例如，美國專禾Ij No. 4，946，778)。另外，可使方法適于構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(參見例如，Huse等，1989 Science 246:1275-1281)以使快速并有效鑒定對蛋白質(zhì)或其衍生物、片段、類似物或其同源物具有所需特異性的單克隆Fab片段?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的技術(shù)生成含有蛋白質(zhì)抗原的個體基因型的抗體片段，包括但不限于(i)由胃蛋白酶消化抗體分子生成的F(ab, )2片段；(ii)通過還原F(ab, )2片段的二硫鍵生成的Fab片段；(iii)通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子生成的Fab片段和(iv)Fv片段。本發(fā)明還包括Fv、Fab、Fab,和F(ab, )2抗纖維蛋白y19°_2°2和y3 片段、單鏈抗y19°_2°2和y377_395纖維蛋白抗體、雙特異性抗y19°_2°2和y377_395 纖維蛋白抗體和異質(zhì)軛合物抗y19°_2°2和y377—395纖維蛋白抗體。雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的抗體。在目前這種情況下，結(jié)合特異性之一是對y19°_2(l2和y377—395纖維蛋白表位的特異性。第二結(jié)合靶標(biāo)為任何其它抗原，并且有利的是細(xì)胞表面蛋白或受體或受體亞單位。制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域中已知。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生成是基于兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共同表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同的特異性(Milstein 和Cuello，Nature，305 :537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤)生成10種不同抗體分子的可能混合物，其中僅一種具有恰當(dāng)?shù)碾p特異性結(jié)構(gòu)。恰當(dāng)分子的純化通常通過親和色譜步驟實(shí)現(xiàn)。具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原組合位點(diǎn))的抗體可變結(jié)構(gòu)域可與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，包括至少一部分的鉸鏈、 CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選具有含有至少一種融合物中存在的輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合物的DNA和(若需要)免疫球蛋白輕鏈插入單獨(dú)的表達(dá)載體中，并且共轉(zhuǎn)染至適合宿主生物中。生成雙特異性抗體的更多詳情，參見例如 Suresh 等，Methods in Enzymology，121 :210(1986)?？蓪㈦p特異性抗體制成全長抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)(ab, )2雙特異性抗體)。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229 :81(1985)描述了經(jīng)蛋白水解將完整抗體裂解以生成F(ab, )2 片段的方法。在二巰基絡(luò)合劑砷化鈉的存在下還原這些片段以穩(wěn)定鄰位二巰基并防止分子間二硫化物形成。然后將生成的Fab,片段轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通過用巰基乙胺還原將一種Fab, -TNB衍生物再轉(zhuǎn)化為Fab'-巰基并且與等摩爾量的另一種 Fab, -TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。生成的雙特異性抗體可用作酶選擇性固定的試劑。另外，可直接從大腸桿菌(E. coli)回收Fab,片段并且化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217-225(1992)描述了全人源化雙特異性抗體Fu, )2分子的生成。還描述了直接由重組細(xì)胞培養(yǎng)物制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成了雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。這種方法還可用于生成抗體同型二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 =6444-6448(1993)描述的“雙鏈抗體”技術(shù)已提供了制備雙特異性抗體片段的替代性機(jī)制。片段包含通過太短而不允許相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的連接子與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(\)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)。因此，迫使一個片段的V1^n八結(jié)構(gòu)域與另一片段的互補(bǔ)\和Vh結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。已報(bào)道了使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一策略。參見，Gruber等，J. Immunol. 152 5368(1994)。包括具有兩種以上化合價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 :60(1991)。本發(fā)明還涉及包含與細(xì)胞毒素試劑(例如毒素(例如，靶向癌細(xì)胞的化學(xué)治療劑， 細(xì)菌、真菌、植物或動物源酶活性毒素或其片段))或放射性同位素(即，放射性軛合物)軛合的抗體的免疫軛合物?；瘜W(xué)治療劑的實(shí)例包括烷化劑、亞硝基脲、抗代謝物、蒽環(huán)類抗生素和相關(guān)藥物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素和其它化療藥物。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A 鏈(來自銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、垂序商陸蛋白(ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ和PAP-S)、 苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、分裂素、限制素、酚霉素、依諾霉素和端孢霉烯族毒素。各種放射性核素可用于生產(chǎn)放射性軛合抗體。實(shí)例包括％Bi、131K131In^90Y 和 186Re。使用各種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑制備抗體和細(xì)胞毒素試劑的軛合物，所述雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、亞氨硫醇(IT)、 亞氨酸酯的雙功能衍生物(例如己二亞氨鹽酸二甲酯)、活性酯(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二疊氮化合物(例如二(P-疊氮苯甲?；ｋ?己二胺)、二重氮衍生物(例如二(P-重氮苯甲酰基酰胼)乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2，6_ 二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)所述制備篦麻毒素免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1_異硫氰芐基_3_甲基二乙烯基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用于軛合放射性核苷酸與抗體的示例性螯合劑。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到很多種類的可能部分可與本發(fā)明的所得抗體偶聯(lián)。(參見例如，通過引用整體并入本文的"Conjugate Vaccines"，Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse 禾口 R. Ε. Lewis, Jr (編)，Carger Press, New York, (1989))ο可通過使兩個分子結(jié)合的任何化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)，只要抗體和其它部分保持它們各自的活性。這種連接包括多種化學(xué)機(jī)制，例如共價結(jié)合、親和性結(jié)合、嵌插、配位結(jié)合和絡(luò)合作用。然而，優(yōu)選的結(jié)合為共價結(jié)合?？赏ㄟ^現(xiàn)有側(cè)鏈的直接縮合或通過并入外部橋接分子實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合。許多二價或多價連接劑均可用于使蛋白質(zhì)分子(例如本發(fā)明的抗體) 與其它分子偶聯(lián)。例如，代表性的偶聯(lián)劑包括有機(jī)化合物，例如硫酯、碳二亞胺、琥珀酰亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺。該列表并非旨在詳盡列出本領(lǐng)域中已知的各種類別的偶聯(lián)劑，而是示例更多常見偶聯(lián)劑。(參見Killen和Lindstrom，Jour. Immun. 133 1335-2549(1984) Jansen等，Immunological Reviews 62:185-216(1982)；和 Vitetta等， Science 238 :1098(1987)。文獻(xiàn)中描述了連接子。(參見例如，Ramakrishnan, S.等，Cancer Res. 44 201-208 (1984)，描述了 MBS (Μ-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)的用途。同樣參見，美國專利No. 5，030，719，描述了經(jīng)由寡肽連接子與抗體偶聯(lián)的鹵化乙酰胼的用途。 示例性連接子包括(i) EDCd-乙基-3-(3- 二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸化物；(ii) SMPT (4-琥珀酰亞胺基氧化羧基- α-甲基- α-(2-吡啶基-二巰基)_甲苯(Pierce Chem. Co.，Cat. (21558G) ； (iii) SPDP (琥珀酰亞胺基-6 [3-(2-吡啶基二巰基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co.，Cat#21651G) ； (iv)硫代-LC-SPDP (硫代琥珀酰亞胺基 6 [3-(2-吡啶基二巰基)_丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G)；和(ν)與EDC軛合的硫代-NHS (N-羥基硫代-琥珀酰亞胺=Pierce Chem. Co.，Cat. #24510)。上述連接子含有具有不同屬性的組分，從而產(chǎn)生具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的軛合物。例如，烷基羧酸鹽的硫代-NHS酯比芳香族羧酸鹽的硫代-NHS酯更穩(wěn)定。含有連接子的NHS酯比硫代-NHS酯溶解性差。進(jìn)一步地，連接子SMPT含有位阻二硫鍵并且可形成穩(wěn)定性更高的軛合物。因?yàn)槎蜴I在體外裂解，產(chǎn)生更少的可用軛合物，所以通常二硫鍵比其它鍵穩(wěn)定性差。尤其，硫代-NHS可增強(qiáng)碳二亞胺偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。當(dāng)用于與硫代-NHS軛合時，碳二亞胺偶聯(lián)物(例如EDC)形成比單獨(dú)的碳二亞胺偶聯(lián)物更具水解抗性的酯類。也可將本文公開的抗體制成免疫脂質(zhì)體。通過本領(lǐng)域中已知的方法，例如Epstein 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，82 :3688(1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，77 4030(1980)；和美國專利No. 4，485，045和4，544，545中所述的方法制備含有抗體的脂質(zhì)體。美國專利No. 5，013，556中公開了循環(huán)時間增加的脂質(zhì)體。可通過逆相蒸發(fā)法用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG源性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE) 的脂質(zhì)組合物生成特別有用的脂質(zhì)體。通過限定孔徑的過濾器擠出脂質(zhì)體以獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin等，J. Biol. Chem.，257 :286-288 (1982)所述，通過二硫化物交換反應(yīng)使本發(fā)明抗體的Faiy片段與脂質(zhì)體軛合。針對纖維蛋白表位y19°_2°2和y377_395抗體的用途包括本發(fā)明單克隆抗體的本發(fā)明治療制劑用于治療或減輕與纖維蛋白相關(guān)病癥 (例如，多發(fā)性硬化、傷口愈合、肺部缺血、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥)有關(guān)的癥狀，優(yōu)選不影響血凝固。本發(fā)明還提供了治療或減輕與纖維蛋白相關(guān)病癥(例如，多發(fā)性硬化、傷口愈合、肺部缺血、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥)有關(guān)的癥狀，優(yōu)選不影響血凝固的方法。通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定患有(或有發(fā)展風(fēng)險)與纖維蛋白相關(guān)病癥(例如，多發(fā)性硬化、傷口愈合、肺部缺血、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥)的受試者(例如，人)實(shí)現(xiàn)治療方案。與這些纖維蛋白相關(guān)病癥有關(guān)的癥狀包括(例如)炎癥、疼痛和感官知覺喪失。聯(lián)合診斷或治療特定纖維蛋白相關(guān)病癥的任何已知方法確定治療的功效。纖維蛋白相關(guān)病癥的一種或多種癥狀減輕表明抗體賦予了臨床受益。向受試者施用抗體制劑，優(yōu)選對靶抗原具有高特異性和高親和力的抗體制劑，并且由于其與靶標(biāo)結(jié)合通常有效。施用抗體可消除或抑制或干擾靶標(biāo) (例如，y19°_2(l2和y377—395纖維蛋白表位)的信號功能。施用抗體可消除或抑制或干擾靶標(biāo) (例如，纖維蛋白)與靶標(biāo)自然結(jié)合的內(nèi)源配體(例如，Mac-I)的結(jié)合。例如，抗體結(jié)合靶標(biāo)并抑制纖維蛋白/Mac-I結(jié)合。應(yīng)了解，根據(jù)本發(fā)明施用治療實(shí)體將與適合載體、賦形劑和并入制劑的其它試劑一起施用以提供經(jīng)改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性等。在Blaug，Seymour的處方集Remington' s Pharmaceutical Sciences (第 19 片反，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)), 尤其是其中的第87章中可找到大量適當(dāng)制劑。這些制劑包括(例如)粉劑、膏劑、藥膏、 凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、含有囊泡的脂質(zhì)(日離子或陰離子)(例如Lip0fectinTM)、DNA軛合物、無水吸收膏劑、水包油和油包水乳劑、乳劑碳蠟(各種分子質(zhì)量的聚乙二醇)、半固體凝膠和含有碳醋的半固體混合物。任何前述混合物可適于根據(jù)本發(fā)明的治療和療法，條件是制劑中的活性成分不被制劑失活并且制劑在生理上相容并可耐受施用途徑。同樣參見 Baldrick P. “ Pharmaceutical excipient development :the need for preclinical guidance. “ Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2) :210-8(2000), Wang W. “ Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. “ Int. J. Pharm. 203(1-2) 1-60(2000)， Charman W N" Lipids， lipophilic drugs， and oral drug delivery-some emerging concepts. ” J Pharm Sci.89 (8) :967-78(2000)，Powell 等 ” Compendium of excipients for parentalteral formulations 〃 PDA J Pharm Sci Technol.52 238-311(1998)和其中藥物化學(xué)家眾所周知的有關(guān)制劑、賦形劑和載體的另外的信息的引用。本發(fā)明的抗體(本文也稱為“活性化合物”)及其衍生物、片段、類似物及其同源物可并入可包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物中。如本文所使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括任何及所有與藥物施用相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、 等滲和吸收延遲試劑等。通過引用并入本文的本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考文本的最新版Remington' s Pharmaceutical Sciences中描述了適合的載體。這種載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂質(zhì)體和非水媒介物，例如不揮發(fā)性油。本領(lǐng)域中眾所周知這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途。包括任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性在組合物中的用途，除非其與活性化合物不相容，。補(bǔ)充活性化合物也可并入組合物中。將本發(fā)明的藥物組合物配制為與其預(yù)期施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔(例如，吸入)、經(jīng)皮(即，局部)、跨粘膜和直腸施用。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、 鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH?？蓪⒛c胃外制劑裝入用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶內(nèi)。適于注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性)或分散劑和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、 Cremophor EL (BASF, Parsippany, N J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物可為無菌并且應(yīng)為易于注射程度的流動性。它可在生產(chǎn)和儲存條件下穩(wěn)定并且必須保存免受微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可為含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如， 丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其混合物。例如，可通過使用包衣 (例如卵磷脂)，通過在分散情況下保持所需粒徑和通過使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。可通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等實(shí)現(xiàn)微生物作用的預(yù)防。在許多情況下，在組合物中可優(yōu)選包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)、氯化鈉?？赏ㄟ^將延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鉛和明膠)包括在組合物內(nèi)引起可注射組合物的延長吸收?？赏ㄟ^將適當(dāng)溶劑中所需量的活性化合物與以上所列成分的組合合并，根據(jù)需要，然后過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。通常，可通過將活性化合物并入含有堿性分散介質(zhì)和來自以上所列成分的其它所需成分的無菌媒介物中制備分散劑。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑情況下，制備方法為真空干燥和冷凍干燥，由先前無菌過濾的溶液獲得活性成分和任何另外的所需成分的粉劑?？诜M合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體?？蓪⑺鼈冄b入明膠膠囊內(nèi)或壓縮成片劑。為了口服治療施用的目的，可將活性化合物與賦形劑合并并且以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。也可使用用作嗽口水的液體載體制備口服組合物，其中液體載體中的化合物經(jīng)口服應(yīng)用并且漱口、咳出或吞咽?？勺鳛榻M合物的一部分將藥學(xué)上相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下任何成分或相似性質(zhì)的化合物 粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、 Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Merotes ；助流劑，例如膠質(zhì)二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或芳香劑，例如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橘子調(diào)味品。
對于經(jīng)吸入施用，以來自含有適合推進(jìn)物(例如二氧化碳等氣體)壓力容器或分配器或噴霧器的氣溶膠噴霧形式遞送化合物。也可通過跨粘膜或經(jīng)皮方式進(jìn)行全身性施用。對于跨粘膜或經(jīng)皮施用，將適于待滲透屏障的滲透劑用于制劑中。這種滲透劑通常在本領(lǐng)域中已知，并且對于跨粘膜施用而言包括(例如)去垢劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物?？缯衬な┯每赏ㄟ^使用鼻用噴霧或栓劑實(shí)現(xiàn)。對于經(jīng)皮施用，可將活性化合物配制成如本領(lǐng)域中通常已知的藥膏、軟膏、凝膠或乳膏。也可將化合物制成栓劑(例如，具有常規(guī)栓劑基質(zhì)(例如可可油)和其它甘油酯) 或保持灌腸劑形式用于直腸遞送。在一個實(shí)施方案中，用防止化合物從體內(nèi)迅速消除的載體，例如控釋制劑，包括植入物和微囊遞送系統(tǒng)制備活性化合物。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，制備這種制劑的方法顯而易見。也可從Alza Corporation禾口 Nova Pharmaceuticals, Inc.購買獲得材料。脂質(zhì)懸浮液(包括靶向具有單克隆抗體或病毒抗原的感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如美國專利 No. 4，522,811中所述的方法。尤其有利的是按易于施用和劑量均勻性的劑量單位形式配制口服和腸胃外組合物。如本文所使用的劑量單位形式指作為待治療的受試者的單位劑量的物理離散單位；每個單位含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生預(yù)期療效的預(yù)定量的活性化合物和所需藥物載體。規(guī)定了本發(fā)明劑量單位形式的說明并且直接取決于活性化合物的獨(dú)特特征和要達(dá)到的特定療效，和化合領(lǐng)域中固有的限制，例如用于治療個體的活性化合物。藥物組合物可與施用說明一起包括在容器、包裝或分配器中。使用抗體片段時，優(yōu)選特異性結(jié)合靶蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最小抑制性片段。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可將肽分子設(shè)計(jì)為保持結(jié)合靶蛋白序列的能力。可經(jīng)化學(xué)合成和/ 或通過重組DNA技術(shù)生成這種肽。(參見例如，Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 7889-7893(1993))。制劑也可含有一種以上待治療的特定指征所必須的活性化合物，優(yōu)選不會相互產(chǎn)生不利影響的具有互補(bǔ)活性的活性化合物?？蛇x地或另外地，組合物可包含增強(qiáng)其功能的試劑，例如細(xì)胞毒素試劑、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑或生長抑制劑。這些分子適合以對預(yù)期目的有效的量以組合方式存在。也可將活性成分分別誘捕于膠質(zhì)遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微型乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或微型乳劑中(例如)通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如羥甲基纖維素或凝膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。用于體內(nèi)施用的制劑可為無菌。這易于通過無菌濾膜過濾實(shí)現(xiàn)?？芍苽渚忈屩苿＞忈屩苿┑倪m合實(shí)例包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠 (例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No. 3，773，919)、 L-谷氨酸和Y乙基L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUP ON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球))和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間段更短。本發(fā)明抗體的治療有效量通常涉及達(dá)到治療目標(biāo)所需的量。如上所述，這可能是抗體及其在某些情況下干擾靶標(biāo)作用的靶抗原之間的結(jié)合相互作用。而且，需要施用的量還取決于施用的抗體從施用的受試者自由體積損耗的速率。就非限制性實(shí)例而言，本發(fā)明抗體或抗體片段的治療有效劑量的常見范圍為約0. lmg/kg體重至約50mg/kg體重。例如， 常見劑量頻率范圍為每日兩次至每周一次。抗體篩選方法篩選具有所需特異性的抗體的方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和本文領(lǐng)域中已知的其它免疫介導(dǎo)技術(shù)。在本領(lǐng)域中已知關(guān)于纖維蛋白定位和/或定量的方法中可使用針對y19°_2(l2和 y377—395纖維蛋白表位的抗體。在指定實(shí)施方案中，對含有抗體源抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的y19°_2(l2和 y377_395纖維蛋白表位或其衍生物、片段、類似物或同源物有特異性的抗體用作藥理學(xué)活性化合物(此后稱為“治療劑”)。也可使用對y19°_2°2和y377—395纖維蛋白表位有特異性的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如免疫親和色譜法或免疫沉淀分離纖維蛋白多肽。可通過偶聯(lián)(即，物理連接)抗體與可檢測物質(zhì)促進(jìn)檢測。可檢測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。適合酶類的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適合輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素； 適合熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、 丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、 螢光素和水母發(fā)光蛋白，并且適合放射性材料的實(shí)例包括1251、1311、3$或咕。根據(jù)本發(fā)明的抗體可用作用于檢測樣本中y19°_2°2和/或y377—395纖維蛋白表位的存在的試劑。在一些實(shí)施方案中，抗體含有可檢測標(biāo)記?？贵w為多克隆，或更優(yōu)選為單克隆。使用完整抗體或其片段(例如，F(xiàn)ab、scFv或F(ab)2)。關(guān)于探針或抗體的術(shù)語“標(biāo)記的”旨在涵蓋通過偶聯(lián)(即，物理連接)可檢測物質(zhì)與探針或抗體對探針或抗體進(jìn)行的直接標(biāo)記，以及通過與另一種被直接標(biāo)記的試劑反應(yīng)對探針或抗體進(jìn)行的間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二級抗體檢測一級抗體和用生物素對DNA探針進(jìn)行末端標(biāo)記使得可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測。術(shù)語“生物樣本”旨在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物液體以及受試者體內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和液體。因此，在術(shù)語“生物樣本”的使用中包括血液和血液成分或組分，包括血清、血漿或淋巴。即，本發(fā)明的檢測方法可用于檢測體外以及體內(nèi)生物樣本中的分析物mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，體外檢測分析物mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。體外檢測分析物蛋白質(zhì)的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光。體外檢測分析物基因組 DNA 的技術(shù)包括 Southern 雜交。例如，在〃 ELISA :Theory and Practice =Methods in Molecular Biology ",第 42 卷，J. R. Crowther (編)Human Press, Totowa, N. J., 1995 ； " Immunoassay" , E. Diamandis 禾口 T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego，Calif.，1996 ；禾口 〃 Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" , P.Tijssen, Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985中描述了進(jìn)行免疫檢測的方法。而且,體內(nèi)檢測分析物蛋白質(zhì)的技術(shù)包括將標(biāo)記的抗分析物蛋白質(zhì)抗體引入受試者體內(nèi)。例如，可用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測所述放射性標(biāo)記物在受試者體內(nèi)的存在和位置。抑制劑篩選方法本發(fā)明提供了鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(本文也稱為“篩選檢測”)，即調(diào)節(jié)或以其它方式干擾纖維蛋白和Mac-I的候選或試驗(yàn)化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物、小分子或其它藥物)，或調(diào)節(jié)或以其它方式干擾纖維蛋白、Mac-I和/或纖維蛋白/Mac-I復(fù)合物的信號功能的候選或試驗(yàn)化合物或試劑。本發(fā)明還包括在本文所述的篩選檢測中鑒定的化合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選調(diào)節(jié)纖維蛋白/Mac-I復(fù)合物的信號功能和/或纖維蛋白與Mac-I之間的相互作用的候選或試驗(yàn)化合物的檢測法。可使用本領(lǐng)域中已知組合文庫法中大量方法中的任一種獲得本發(fā)明的試驗(yàn)化合物，包括生物文庫、空間可尋址的平行固體相或溶液相文庫、需要去卷積的合成文庫法和使用親和色譜選擇的合成文庫法。生物文庫方法限于肽文庫，而其它4種方法可應(yīng)用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫。(參見例如，Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12 :145)。如本文所使用的“小分子”意在指分子量低于約5kD且最優(yōu)選低于約4kD的組合物。小分子可為(例如)核酸、肽、多肽、肽模擬物、碳水化合物、脂質(zhì)或其它有機(jī)或無機(jī)分子?；瘜W(xué)和/或生物混合物文庫，例如真菌、細(xì)菌或藻類提取物在本領(lǐng)域中已知并且可用本發(fā)明的任何檢測法篩選。分子文庫合成方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域中找到，例如在DeWitt等，1993. ftOC. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :6909 ；Erb 等，1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 :11422 ； Zuckermann 等，1994. J. Med. Chem. 37 :2678 ；Cho 等，1993. Science 261 :1303 ；Carre 11 等， 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 :2059 ；Care 11 等，1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33 2061 ；和 Gallop 等，1994. J. Med. Chem. 37 :1233 中。在溶液中(參見例如，Houghten，1992.Biotechniques 13 :412-421)或珠子上 (參見 Lam，1991. Nature 3 :82-84)、芯片上(參見 Fodor，1993. Nature 364:555-556)、 細(xì)菌(參見美國專利No. 5，223，409)、孢子(參見美國專利No. 5，233，409)、質(zhì)粒(參見 Cull 等，992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :1865-1869)或噬菌體上(參見 kott 和 Smith， 1990.Science249 :386-390 ；Devlin,1990. Science 249 :404-406 ；Cwirla 等，1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 87 :6378-6382 ；Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222 :301-310 ；和美國專利No. 5，233，409)可呈現(xiàn)化合物文庫。在一個實(shí)施方案中，將候選化合物引入抗體-抗原復(fù)合物中并確定候選化合物是否破壞抗體-抗原復(fù)合物，其中這種復(fù)合物破壞表明候選化合物調(diào)節(jié)纖維蛋白/Mac-I復(fù)合物的信號功能和/或纖維蛋白與Mac-I之間的相互作用。例如，單克隆抗體5B8和抗原纖維蛋白原復(fù)合物。可選地，單克隆抗體為1E3且抗原為纖維蛋白原。在另一實(shí)施方案中，提供了纖維蛋白/Mac-I復(fù)合物并暴露于至少一種中和單克隆抗體。檢測到抗體-抗原復(fù)合物形成，并且將一種或多種候選化合物引入復(fù)合物中。如果在引入一種或多種候選化合物之后抗體-抗原復(fù)合物被破壞，則候選化合物可用于治療與纖維蛋白/Mac-I結(jié)合相關(guān)的病癥。在另一實(shí)施方案中，提供了本發(fā)明的可溶性嵌合蛋白并暴露于至少一種中和單克隆抗體。檢測到抗體-抗原復(fù)合物形成，并且將一種或多種候選化合物引入復(fù)合物中。如果在引入一種或多種候選化合物之后抗體-抗原復(fù)合物被破壞，則候選化合物可用于治療與纖維蛋白/Mac-I結(jié)合相關(guān)的病癥。例如可通過偶聯(lián)具有放射性同位素的試驗(yàn)化合物或酶標(biāo)記，使得可通過檢測復(fù)合物中的標(biāo)記化合物而確定試驗(yàn)化合物與抗原或其生物活性部分的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)確定試驗(yàn)化合物干擾或破壞抗體-抗原復(fù)合物的能力。例如，可用^〖^、,(或咕直接或間接標(biāo)記試驗(yàn)化合物，并且可通過無線電發(fā)射直接計(jì)數(shù)或通過閃爍計(jì)數(shù)檢測放射性同位素?？蛇x地，可用(例如)辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶酶促標(biāo)記試驗(yàn)化合物，并且可通過確定適當(dāng)?shù)孜锵虍a(chǎn)物的轉(zhuǎn)化檢測酶標(biāo)記。在一個實(shí)施方案中，檢測包括使抗體-抗原復(fù)合物與試驗(yàn)化合物接觸和確定試驗(yàn)化合物與抗原相互作用或以其它方式破壞現(xiàn)有抗體-抗原復(fù)合物的能力。在該實(shí)施方案中，確定試驗(yàn)化合物與抗原相互作用和/或破壞抗體-抗原復(fù)合物的能力包括確定與抗體相比，試驗(yàn)化合物優(yōu)先結(jié)合抗原或其生物活性部分的能力。在另一實(shí)施方案中，檢測包括使抗體-抗原復(fù)合物與試驗(yàn)化合物接觸和確定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)抗體-抗原復(fù)合物的能力。確定試驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)抗體-抗原復(fù)合物的能力可通過(例如)確定在試驗(yàn)化合物存在下抗原與抗體結(jié)合或相互作用的能力來實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到，在本文公開的任何篩選方法中，抗體可為中和抗體， 例如單克隆抗體5B8和/或1E3，每一種抗體均可調(diào)節(jié)或以其它方式干擾纖維蛋白/Mac-I
纟口口。在一個實(shí)施方案中，可能期望固定抗體或抗原以便在引入候選化合物之后分離一種或兩種的復(fù)合和非復(fù)合形式，以及適應(yīng)檢測的自動化?？稍谶m于容納反應(yīng)物的任何容器中實(shí)現(xiàn)在候選化合物存在和不存在時抗體-抗原復(fù)合物的觀察。這種容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微型離心管。在一個實(shí)施方案中，可提供融合蛋白以增加允許一種或兩種蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如，GST抗體融合蛋白或GST抗原融合蛋白可吸附至谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽源微量滴定板上，然后與試驗(yàn)化合物組合，并且在有益于復(fù)合物形成的條件下(例如，在生理鹽和PH條件下)培育混合物。培育之后，洗滌珠子或微量滴定板孔以去除任何未結(jié)合的組分、固定的基質(zhì)(在為珠子的情況下)，直接或間接確定復(fù)合物?？蛇x地，可使復(fù)合物與基質(zhì)分離，并且可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定抗體-抗原復(fù)合物形成的水平。將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其它技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選檢測中。例如，可利用生物素和鏈霉抗生物素蛋白的軛合固定抗體(例如5B8和/或IE； )或抗原(例如纖維蛋白)。可使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(例如，生物素化試劑盒，Pierce Chemicals, Rockf ord，III.)由生物素-NHS (N-羥基-琥珀酰亞胺)制備生物素化抗體或抗原分子，并固定與涂覆鏈霉抗生物素蛋白的96孔板(Pierce Chemical)上?？蛇x地，可將與目標(biāo)抗體或抗原反應(yīng)，但并不干擾目標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物形成的其它抗體衍生化至板的孔中，并且通過抗體軛合將未結(jié)合抗體或抗原誘捕于孔中。檢測這種復(fù)合物的方法，除以上所述對于 GST固定復(fù)合物的方法外，包括使用這種與抗體或抗原反應(yīng)的其它抗體免疫檢測復(fù)合物。本發(fā)明進(jìn)一步屬于通過前述任何篩選檢測鑒定的新型試劑及其如本文所述用于治療的用途。診斷檢測
2
可通過適當(dāng)檢測，例如常規(guī)類型的免疫檢測來檢測本發(fā)明的抗體。例如，可進(jìn)行夾心分析法，其中使全長纖維蛋白原、纖維蛋白或其片段附于固體相。保持培育足夠長時間以使樣本中的抗體與固體相上的固定多肽結(jié)合。首次培育之后，分離固體相和樣本。洗滌固體相以去除也可能存在于樣本中的未結(jié)合材料和干擾物質(zhì)，例如非特異性蛋白質(zhì)。隨后與第二種標(biāo)記抗體或與偶聯(lián)劑(例如生物素或抗生物素蛋白)結(jié)合的抗體一起培育含有與固定多肽結(jié)合的目標(biāo)抗體(例如單克隆抗體5B8和/或1E3)的固體相。這第二種標(biāo)記抗體可為另一種抗纖維蛋白抗體?？贵w的標(biāo)記在本領(lǐng)域中眾所周知并且包括放射性核素、酶 (例如馬來酸脫氫酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、過氧化氫酶)、氟石(異硫氰酸熒光素、 若丹明、藻藍(lán)蛋白、熒光胺)、生物素等。與固體一起培育標(biāo)記抗體并測量與固體相結(jié)合的標(biāo)記。通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可易于進(jìn)行這些和其它免疫檢測。檢測生物樣本中纖維蛋白的存在或不存在的示例性方法包括從測試受試者獲得生物樣本和使生物樣本與根據(jù)本發(fā)明所述的標(biāo)記單克隆抗體接觸使得檢測出生物樣本中纖維蛋白的存在。如本文所使用的關(guān)于探針或抗體的術(shù)語“標(biāo)記”旨在涵蓋通過偶聯(lián)(即，物理連接)可檢測物質(zhì)和探針或抗體對探針或抗體進(jìn)行的直接標(biāo)記以及通過與直接標(biāo)記的另一試劑反應(yīng)對探針或抗體進(jìn)行的間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二級抗體檢測一級抗體和用生物素對DNA探針進(jìn)行末端標(biāo)記使得可用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測。術(shù)語“生物樣本”旨在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物流體，以及受試者體內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和流體。即，本發(fā)明的檢測方法可用于檢測體外以及體內(nèi)生物樣本中的纖維蛋白。例如，體外檢測纖維蛋白的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光法。而且，體內(nèi)檢測纖維蛋白的技術(shù)包括將標(biāo)記的抗纖維蛋白抗體引入受試者體內(nèi)。例如，可用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，可通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測所述放射性標(biāo)記物在受試者體內(nèi)的存在和位置。在一個實(shí)施方案中，生物樣本含有來自受試者的蛋白質(zhì)分子。一種優(yōu)選的生物樣本是通過常規(guī)方式從受試者分離的外周血白細(xì)胞樣本。試劑盒本發(fā)明還涵蓋用于檢測生物樣本中纖維蛋白的存在的試劑盒。例如，試劑盒可包含能夠檢測生物樣本中纖維蛋白的標(biāo)記化合物或試劑；確定樣本中纖維蛋白的量的方法；和將樣本中纖維蛋白的量與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較的方法?？蓪⒒衔锘蛟噭┌b在適合容器中。試劑盒可進(jìn)一步包含使用試劑盒檢測樣本中的纖維蛋白的說明書。在以下實(shí)施例中將進(jìn)一步描述本發(fā)明，其并不限制權(quán)利要求中所述本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例依照以下實(shí)施例可進(jìn)一步理解本發(fā)明的各方面，其不應(yīng)被理解為以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。實(shí)施例1-單克隆抗體的生成合成與纖維蛋白原y鏈上的精確氨基酸對應(yīng)的肽序列(肽#1 CGffTVLQKRIDGSL (SEQ ID NO: 17)和肽 #2 :CKKTTMKIIPFNRLTIG (SEQ ID NO: 18))，已證實(shí)所述肽序列對纖維蛋白原與Mac-I的相互作用至關(guān)重要。用相應(yīng)的N端半胱氨酸殘基合成這兩種肽以允許軛合促進(jìn)體內(nèi)有力抗體反應(yīng)的載體蛋白鑰孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)。兩種肽均用于免疫3只小鼠，在這些小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。初步血清篩選顯示對這些肽的強(qiáng)抗體滴度并導(dǎo)致隨后生成產(chǎn)生針對這兩種肽序列的克隆抗體的雜交瘤。通過ELISA對兩種肽以及載體蛋白進(jìn)行480個雜交瘤克隆的初始篩選。擴(kuò)展陽性克隆并再次測試以通過ELISA 確認(rèn)肽表位反應(yīng)性。這種初始篩選的最終結(jié)果產(chǎn)生46個對肽#1或#2有特異性的克隆。 在這些ELISA的深層分析中，結(jié)果鑒定出16個靶候選物用于進(jìn)一步檢查。篩選這16個克隆阻斷通過全長纖維蛋白原上的Mac-I受體的小膠質(zhì)細(xì)胞粘附的能力。在這些抗體克隆存在下，為組織培養(yǎng)孔涂覆50 μ g/mL纖維蛋白原，其上接種小膠質(zhì)細(xì)胞(200，000個細(xì)胞/ mL)。30min后洗滌孔并用0.1%結(jié)晶紫為剩余粘附細(xì)胞染色。用1 % PFA固定染色細(xì)胞并用0. 5% TritonX-IOO溶解。在595nm下通過吸光度測量評估，其中5種克隆顯示出與市售的Mac-I封閉性抗體(M1/70)相似的防止小膠質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白原粘附的顯著能力(圖 1 ；經(jīng)吸光度轉(zhuǎn)變測量具有高于20%的抑制)。預(yù)期本發(fā)明的抗體可防止小膠質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白原粘附高于30%、40%或50%。克隆1A5、1D6和1E3識別肽#1表位，而克隆4E11和 5B8識別肽#2表位。通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步分析這5種克隆識別纖維蛋白原的能力。這5 種抗體識別纖維蛋白原的Y鏈程度相似。為檢查這些抗體是否以劑量依賴性方式識別纖維蛋白原，對全長涂覆纖維蛋白原進(jìn)行ELISA(圖2、。發(fā)現(xiàn)所有這5種抗體特異性結(jié)合濃度漸增的全長纖維蛋白原。從這5種抗體中選擇3種(1E3、4E11和5B8 ；當(dāng)通過吸光度轉(zhuǎn)變測量時，對Mac-I結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的抑制高于50%)進(jìn)行分離和大規(guī)模純化。預(yù)期本發(fā)明的抗體可抑制Mac-I結(jié)合纖維蛋白高于50^^60%或70%。最初，純化這3種抗體20mg用于體外吞噬作用檢測和EAE實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2-針對纖維蛋白原y鏈的單克隆抗體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用吞噬作用是Mac-I介導(dǎo)的激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的主要功能。如先前所述對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用檢測。參見，通過引用整體并入本文的Adams等，2007，J.Exp. Med. 204 :571-582。纖維蛋白源性y377—395肽抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活并抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病的復(fù)發(fā)性麻痹。針對修飾纖維蛋白y377—395表位的單克隆抗體5B8在抑制體外吞噬作用中顯示出較高功效。如先前對y377—395肽所述，在體內(nèi)研究中該抗體顯示預(yù)防和治療性施用于MS動物模型中。實(shí)施例3-單克隆抗體5B8抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的緩解-復(fù)發(fā)動物模型中的復(fù)發(fā)發(fā)病率為評估纖維蛋白抗體在調(diào)節(jié)體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活和脫髓鞘作用中的效果，在PLP EAE發(fā)展后向小鼠施用吞噬作用檢測中鑒定的2種克隆。按每只小鼠250 μ g施用抗體5B8 和4E11，每周3次。如圖4所示，抗體4E11對EAE的發(fā)展沒有實(shí)質(zhì)影響。相反，抗體5B8顯示對復(fù)發(fā)時臨床癥狀的抑制。其它實(shí)施方案提供上述詳細(xì)描述是為了幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。然而，本文公開的特定實(shí)施方案并不限制本文所述和要求的本發(fā)明的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等效實(shí)施方案均被預(yù)計(jì)在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)際上，除本文示出和描述的修改外，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，通過不背離本發(fā)明精神和范圍的先前描述，本發(fā)明的各種修改變得顯而易見。這些修改也旨在屬于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。引用的參考文獻(xiàn)本文參考的引用不得被理解為承認(rèn)這是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的分離抗體，其中所述抗體表現(xiàn)出對小膠質(zhì)細(xì)胞與所述纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域粘附高于20%的抑制。
2.一種結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的分離抗體，其中所述抗體表現(xiàn)出對 Mac-I與所述纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域結(jié)合高于50%的抑制。
3.一種結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的分離抗體，其中所述抗體抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)復(fù)發(fā)時的臨床癥狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y377_395表位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域的y19°_2°2表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為人源化抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體為人抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含具有3個包含選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO :2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO :4)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的抗體，其中所述抗體包含具有3個包含選自 GYTFTSYffIH(SEQ ID NO :6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO 7)和 SDPTGC(SEQ ID NO 8) 的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含具有3個包含選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO :2)、QMSNLAS (SEQ ID NO 3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO 4) 的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈和具有3個包含選自GYTFTSYWIH(SEQ ID NO 6)、 LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQID NO 7)和 SDPTGC(SEQ ID NO 8)的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含SEQID NO=I的輕鏈可變氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含SEQID NO 5的重鏈可變氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含SEQID NO=I的輕鏈可變氨基酸序列和SEQ ID NO: 5的重鏈可變氨基酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體單獨(dú)包含具有3個包含與選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO: 4)的序列有至少80%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與選自 GYTFTSYWIH(SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO :7) ^P SDPTGC (SEQ ID NO 8)序列有至少80%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體單獨(dú)包含具有3個包含與選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO 2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO: 4)的序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與選自 GYTFTSYWIH(SEQ ID NO :6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO 7) ^P SDPTGC(SEQ ID NO 8)序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體單獨(dú)包含具有3個包含與選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO :2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO: 4)的序列有至少95%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與選自 GYTFTSYWIH(SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO :7) ^P SDPTGC (SEQ ID NO 8)序列有至少95%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體單獨(dú)包含具有3個包含與選自 RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO :2)、QMSNLAS (SEQ ID NO :3)和 AQNLELPLT (SEQ ID NO: 4)的序列有至少99%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的輕鏈，和具有3個包含與選自 GYTFTSYWIH(SEQ ID NO 6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG (SEQ ID NO :7) ^P SDPTGC (SEQ ID NO 8)序列有至少99%序列同一性的氨基酸序列的互補(bǔ)性決定區(qū)域的重鏈；并且其中所述輕鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域和重鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域保持Mac-I結(jié)合能力。
19.一種減輕與Mac-I結(jié)合纖維蛋白或Mac-I結(jié)合纖維蛋白原相關(guān)的病變癥狀的方法， 其中所述方法包括向期望這種減輕的受試者按足以減輕所述受試者病變癥狀的量施用根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述受試者為人。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述病變選自多發(fā)性硬化、脊髓損傷、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和癌癥。
22.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
23.—種試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的抗體。
24.一種載體，所述載體包含編碼纖維蛋白y377_395表位CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO 18)或其生物活性衍生物的核酸序列。
25.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求M所述的載體。
26.一種生成免疫特異性結(jié)合纖維蛋白y377_395表位或其生物活性衍生物的抗體的方法，所述方法包括向受試者施用第一劑量的根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞，其中所述第一劑量足以在所述受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括向所述受試者施用第二劑量的所述細(xì)胞的步驟，其中所述第二劑量足以在所述受試者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生成的抗體抑制所述受試者體內(nèi)的纖維蛋白/Mac-I結(jié)合。
29.一種篩選結(jié)合Mac-I受體并調(diào)節(jié)Mac-I受體活性的配體的方法，所述方法包括(a)提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體；(b)接觸纖維蛋白y377—395表位 CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO :18)或其生物活性衍生物，并且形成抗體/多肽復(fù)合體； (c)使所述抗體/多肽復(fù)合體與包含候選化合物的組合物接觸；和(d)確定候選化合物是否結(jié)合單克隆抗體；由此所述候選化合物的結(jié)合表明所述候選化合物為調(diào)節(jié)Mac-I受體活性的配體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)合纖維蛋白或纖維蛋白原YC結(jié)構(gòu)域的分離抗體。在各個方面，所述抗體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞與纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域粘附，抑制Mac-1與纖維蛋白或纖維蛋白原yC結(jié)構(gòu)域結(jié)合，和/或抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的臨床癥狀。提供了使用所述抗體、藥物組合物、試劑盒、載體、包含載體的細(xì)胞的各種方法和抗體生成方法。
文檔編號G01N33/53GK102575277SQ201080046037
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者凱特琳娜·阿卡索格魯 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會