專利名稱：一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的檢測(cè)技術(shù)主要涉及以下幾種(1)蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法 該方法基于免疫學(xué)原理，主要針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物外源基因表達(dá)的目的蛋白建立的特異性檢測(cè)方法；(2)核酸檢測(cè)方法主要利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)進(jìn)行外源基因和標(biāo)記基因序列等的檢測(cè)；(3)抗生素溶液涂抹檢測(cè)法將抗生素溶液涂抹在抗性再生植株心葉，3到7天后觀察葉片顏色變化，轉(zhuǎn)基因植株葉片生長(zhǎng)正常，非轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)退綠條帶；(4)人工飼料飼喂法中國專利200610064877公開了一種利用轉(zhuǎn)基因抗蟲棉萌動(dòng)的棉籽與昆蟲人工飼料混合物直接飼喂昆蟲，測(cè)定昆蟲幼蟲的死亡率，以此判斷是否為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。上述轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法存在以下不足(1)蛋白和分子生物學(xué)方法都需要昂貴的測(cè)定儀器，且蛋白質(zhì)檢測(cè)需要試劑盒，核酸的檢測(cè)需要提取棉花的DNA或者RNA以及合成外源基因的特異引物，成本較高，在測(cè)定過程中能產(chǎn)生有毒的化學(xué)物質(zhì)；(2)抗生素法檢測(cè)周期長(zhǎng)；(3)人工飼料飼喂法適用對(duì)象為抗咀嚼式口器棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉花，目前不適用抗刺吸式口器棉蚜的轉(zhuǎn)基因棉的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速、無污染且使用方便的抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案 該快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法。包括以下步驟
(1)設(shè)備和待測(cè)材料的準(zhǔn)備
檢測(cè)儀器為昆蟲刺吸電位儀(electrical penetration graph, EPG)，檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因棉花生育期為4-5片真葉期，首先用水溶性導(dǎo)電銀膠將1頭棉蚜的背板和一根金絲電極相連， 放置該棉蚜于待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗葉背上適應(yīng)1-3小時(shí)后，金絲電極另外一端連接昆蟲刺吸電位儀；
(2)檢測(cè)和記錄
檢測(cè)開始，棉蚜在轉(zhuǎn)基因棉花上的刺吸取食行為產(chǎn)生的一系列電信號(hào)經(jīng)昆蟲刺吸電位儀放大處理后，通過信號(hào)采集軟件和模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡記錄在電腦硬盤上，記錄一段時(shí)間后結(jié)束；
(3)信號(hào)分析和計(jì)算利用分析軟件分析每頭棉蚜口器口針在測(cè)定轉(zhuǎn)基因棉花葉片韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和，計(jì)算該時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比，然后計(jì)算所有測(cè)定的棉蚜該百分比的平均值；
(4)判斷轉(zhuǎn)基因棉花是否為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉
判斷標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)于一個(gè)測(cè)定的轉(zhuǎn)基因棉花品系，棉蚜口針在該品系棉花葉片韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比小于10%，則該棉花為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉；棉蚜口針在棉花韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比大于20%，則該棉花為非轉(zhuǎn)基因抗蚜棉。與現(xiàn)有同類檢測(cè)方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)檢測(cè)速度快，方法簡(jiǎn)單測(cè)定時(shí)間只用4-6小時(shí)，八通道刺吸電位系統(tǒng)2天時(shí)間就可以測(cè)定20頭棉蚜的刺吸行為。而蛋白和核酸檢測(cè)方法需要首先提取植物的蛋白和核酸，樣品較多時(shí)更費(fèi)時(shí)間。本發(fā)明可以直接以轉(zhuǎn)基因棉花植株為測(cè)定對(duì)象，不用對(duì)植株進(jìn)行其他處理。(2)檢測(cè)成本低，無污染一臺(tái)昆蟲刺吸電位系統(tǒng)的價(jià)格為3萬多人民幣，遠(yuǎn)低于 PCR儀以及酶聯(lián)免疫吸附儀等儀器。檢測(cè)時(shí)不需其他的化學(xué)試劑，不用額外購買其他的試劑盒。不涉及如核酸檢測(cè)有關(guān)的溴化乙啶等有毒的化學(xué)物質(zhì)。棉蚜成本極低，且容易在室內(nèi)飼養(yǎng)。而蛋白和核酸檢測(cè)方法成本較高，如果涉及植物較多時(shí)成本更加昂貴。(3)確性高，重復(fù)性好檢測(cè)了多個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，這些描述并非是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)本發(fā)明內(nèi)容所作的等同替換或相應(yīng)改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1:
(1)設(shè)備和待測(cè)材料的準(zhǔn)備
檢測(cè)儀器為4通道昆蟲刺吸電位儀(electrical penetration graph，EPG)，待測(cè)棉花品系為Al和A2，生育期為苗期4片真葉期，4通道昆蟲刺吸電位儀每次檢測(cè)4株棉花；用水溶性導(dǎo)電銀膠將棉蚜無翅成蚜的背板和金絲電極相連，放在1株棉苗葉片上適應(yīng)1小時(shí)，每株棉花上只能放置一頭測(cè)定棉蚜；然后金絲電極另外一端連接刺吸電位儀的一個(gè)通道，每個(gè)通道連接一根金絲電極；
(2)檢測(cè)和記錄
檢測(cè)開始，刺吸電位儀記錄開始，輸出信號(hào)使用WinDaq Lite采集軟件(Dataq instruments, Inc.)，通過模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡(DI—720， Dataq instruments, Inc. ) i己錄在電腦硬盤上，記錄6小時(shí)結(jié)束，每個(gè)待測(cè)品系棉花成功測(cè)定20株棉苗，每株棉苗和每頭棉蚜只能使用一次；
(3)信號(hào)分析和計(jì)算
利用分析軟件WinDaq Lite (Dataq instruments, Inc.)分析每頭棉蚜口器口針在轉(zhuǎn)基因棉花韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和，計(jì)算該時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比，然后計(jì)算20頭棉蚜該百分比的平均值；(4)測(cè)定結(jié)果及判斷棉花是否為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉花
Al棉上棉蚜口針在棉葉韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間百分比的平均值為5. 89%，小于10%，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，則Al為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉；A2棉上棉蚜口針在棉葉韌皮部篩管中被動(dòng)吸食植物汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間百分比的平均值為20. 19%，大于20%，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，則A2為非轉(zhuǎn)基因抗蚜棉。待測(cè)品系A(chǔ)l是轉(zhuǎn)基因抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花，A2為其親本常規(guī)棉花，為非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉。因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際相符。實(shí)施例2:
與實(shí)施例1的操作條件相同，所不同的是待測(cè)棉花品系分別為Bl和B2。計(jì)算結(jié)果顯示Bl棉上棉蚜口針在棉葉韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間占測(cè)定時(shí)間百分比的平均值為5. ，小于10%，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，則Bl為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉；B2棉上棉蚜口針在棉葉韌皮部篩管中被動(dòng)吸食植物汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的總時(shí)間占測(cè)定時(shí)間百分比的平均值為28. 27%，大于20%，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)，則B2為非轉(zhuǎn)基因抗蚜棉。待測(cè)品系Bl是轉(zhuǎn)基因抗蚜轉(zhuǎn)基因棉花，B2為其親本非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉花，因此本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際相符。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，包括以下步驟(1)設(shè)備和待測(cè)材料的準(zhǔn)備檢測(cè)儀器為昆蟲刺吸電位儀(electrical penetration graph, EPG)，檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因棉花生育期為4-5片真葉期，用水溶性導(dǎo)電銀膠將1頭棉蚜的背板和一根金絲電極相連，放置該棉蚜于待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗葉背上適應(yīng)1-3小時(shí)后，金絲電極的另外一端連接昆蟲刺吸電位儀；(2)檢測(cè)和記錄檢測(cè)開始，棉蚜在轉(zhuǎn)基因棉花上的刺吸取食行為產(chǎn)生的一系列電信號(hào)經(jīng)昆蟲刺吸電位儀放大處理后，通過信號(hào)采集軟件和模擬一數(shù)字轉(zhuǎn)化卡記錄在電腦硬盤上，記錄一段時(shí)間后結(jié)束；(3)信號(hào)分析和計(jì)算利用分析軟件分析每頭棉蚜口器口針在測(cè)定轉(zhuǎn)基因棉花葉片韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和，計(jì)算該時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比，然后計(jì)算所有測(cè)定的棉蚜該百分比的平均值；(4)判斷轉(zhuǎn)基因棉花是否為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉判斷標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)于一個(gè)測(cè)定的棉花品系，棉蚜口針在該品系棉花葉片韌皮部篩管中的被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和測(cè)定時(shí)間的百分比小于10%，則該棉花為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉；棉蚜口針在棉花韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比大于20%，則該棉花為非轉(zhuǎn)基因抗蚜棉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑴ 中的檢測(cè)儀器昆蟲刺吸電位儀(electrical penetration graph)系荷蘭Wageningen University生產(chǎn)，為4通道(Giga4型號(hào))或者8通道(Giga8型號(hào))。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑴中昆蟲刺吸電位儀每個(gè)通道每次只能測(cè)定一株待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗，4通道型號(hào)或者8通道型號(hào)可以同時(shí)檢測(cè)4株或者8株待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑴中的一根金絲電極的一端只能連接1頭棉蚜，另外一端連接在刺吸電位儀的一個(gè)通道上，刺吸電位儀的一個(gè)通道只能連接一根金絲電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑴中每株待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗上只能放置1頭棉蚜無翅成蚜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于每個(gè)品系的待測(cè)轉(zhuǎn)基因棉苗至少要成功測(cè)定20株，每株棉苗和每頭棉蚜只能使用一次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑵測(cè)定記錄的時(shí)間為4-6小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法，其特征在于所述步驟⑷中棉蚜口針在棉花葉片韌皮部篩管中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比為所有測(cè)定蚜蟲該百分比的平均值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蚜棉的方法。檢測(cè)的儀器為昆蟲刺吸電位儀。步驟包括連接棉蚜和金絲電極；檢測(cè)和記錄棉蚜在待測(cè)棉花上刺吸取食時(shí)產(chǎn)生的電信號(hào)；記錄一段時(shí)間后結(jié)束，分析和計(jì)算棉蚜在測(cè)定棉花上刺吸取食產(chǎn)生的波形及出現(xiàn)時(shí)間；判斷棉花是否為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉棉蚜口針在測(cè)定棉花葉片韌皮部篩管子中被動(dòng)吸食汁液對(duì)應(yīng)波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比小于10%，則該棉花品系為轉(zhuǎn)基因抗蚜棉；棉蚜口針在測(cè)定棉花韌皮部篩管子中被動(dòng)吸食汁液產(chǎn)生的波形出現(xiàn)的時(shí)間總和占測(cè)定時(shí)間的百分比大于20%，則該棉花品系為非轉(zhuǎn)基因抗蚜棉。與現(xiàn)有同類檢測(cè)方法相比，本發(fā)明檢測(cè)速度快，方法簡(jiǎn)單，成本低，無污染，重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高。
文檔編號(hào)G01N27/00GK102175720SQ201010610888
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者盧紹輝, 崔金杰, 李為爭(zhēng), 湯清波, 白素芬, 閆鳳鳴, 雒珺瑜, 馬英, 高佳 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)