一種快速檢測黃牛apoa2基因多態(tài)性的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測中國地方黃牛APOA2基因序列突變的PCR-RFLP的方法，以包含APOA2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增牛APOA2基因，發(fā)現(xiàn)3個突變位點；針對這3個突變位點，設(shè)計3對引物PR1、PR2和PR1，分別利用Bmgt120Ⅰ，HindⅢ和HaeⅢ三種限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定黃牛APOA2基因3個突變位點的多態(tài)性。因此，本發(fā)明為中國地方黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇（MAS）育種提供了一種在DNA水平篩查和鑒定與黃牛生長性狀密切相關(guān)基因多態(tài)性的方法，有利于快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
【專利說明】—種快速檢測黃牛AP0A2基因多態(tài)性的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物分子育種領(lǐng)域，涉及一種檢測黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G, AC_000160.lg.424G>C 和 AC_000160.lg.540A>G 多態(tài)性的方法，及其在肉牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種中快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在黃牛生長發(fā)育性狀的MAS育種中，研究DNA標(biāo)記與目標(biāo)性狀之間的關(guān)系，有兩種基本方法:候選基因分析和連鎖標(biāo)記分析。在動物研究中，候選基因分析比連鎖標(biāo)記分析更易操作，且不需要進行特意實驗設(shè)計、費用低、統(tǒng)計功效強，被廣泛采用，適用于任何可取得基因型和表型數(shù)據(jù)的群體。該方法通過統(tǒng)計方法建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，從而確定該候選基因與未知基因的關(guān)系或效應(yīng)。一般而言，候選基因通常是一些與研究性狀生長發(fā)育過程有關(guān)的基因，可能是結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因或是在生化代謝途徑中影響該性狀表達的基因。
[0003]PCR-RFLP方法是一種簡單快速檢測基因突變多態(tài)性的有效技術(shù)。利用測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)序列突變后，根據(jù)序列特征選擇合適的酶切位點或設(shè)計合適的引物人工引入酶切位點，經(jīng)PCR后，用對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，然后直接用瓊脂糖凝膠電泳檢測。此方法不僅準(zhǔn)確度高，又克服了費用昂貴、操作繁瑣、假陽性的缺點。
[0004]在本發(fā)明中，AP0A2基因符合黃牛生長發(fā)育性狀候選基因的要求。高密度載脂蛋白是血清中重要的組 成部分，在脂質(zhì)的運輸和脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。AP0A2作為高密度載脂蛋白第二個主要的組成部分，調(diào)節(jié)著高密度載脂蛋白的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)。研究表明AP0A2的代謝決定著高密度載脂蛋白在血清中的濃度，并且其可以作為與高密度載脂蛋白受體特異結(jié)合的信號分子。在人的研究中，AP0A2基因被當(dāng)做是2型糖尿病的候選基因。2型糖尿病主要是由過度肥胖或者食用大量的高能量食物引起的。因此，AP0A2基因可能是影響肥胖或與肥胖相關(guān)的其它性狀的候選基因。在小鼠的研究中，過表達AP0A2基因的小鼠中甘油三酯分解代謝受阻并增加了脂肪的沉積，敲除AP0A2基因的小鼠降低了甘油三酯的合成代謝。因此，分析AP0A2基因遺傳變異特別是多態(tài)位點與黃牛生長性狀的關(guān)聯(lián)程度，對培育具有優(yōu)良性狀的肉牛品種具有重要的理論指導(dǎo)意義。
[0005]國內(nèi)外未見關(guān)于牛AP0A2基因的遺傳變異研究，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟性狀(如體重等)關(guān)聯(lián)研究仍是空白。由于AP0A2基因功能涉及多種黃牛生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為AP0A2基因多態(tài)位點與中國黃牛生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
[0006]主要參考文獻
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明解決的問題在于利用DNA池測序的方法篩查中國地方黃牛AP0A2基因的多態(tài)性，尋找與黃牛相關(guān)的突變作為分子標(biāo)記，從而提供一種快速檢測AP0A2基因多態(tài)性的方法，以此作為黃牛標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記，為中國黃牛品種的改良提供一定的指導(dǎo)作用。
[0016]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0017]一種檢測黃牛AP0A2基因多態(tài)性的方法，以包含AP0A2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛AP0A2基因，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3個突變位點；針對這3個位點設(shè)計3對引物PRUPR2和PR1，分別利用Bmgt120 I ,Hind III和Hae III三種限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳鑒定黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G,AC_000160.lg.424G>C 和 AC_000160.lg.540A>G 三個突變位點的多態(tài)性。
[0018]所述的引物對P為:`[0019]上游引物:5’-CTCCTCCAAAGTCCTTATCACC-3’
[0020]下游引物:5’-GCAGGCTCACAACTTAACTCC-3 ’。
[0021]P:94°C預(yù)變性 5min ；35 個循環(huán) 94°C變性 30s，55°C退火 30s，72。。延伸 lmin30s ；72°C延伸 lOmin。
[0022]所述的引物對PRl為:
[0023]上游引物:5’-AATCCCAAGGAGGAGAAGGTGGCC-3’
[0024]下游引物:5’-ATTCAGCCTCAGCTCTCAGCCCT-3’。
[0025]PRl:94°C預(yù)變性 5min ;32 個循環(huán) 94°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸5min。
[0026]所述的引物對PR2為:
[0027]上游引物:5，-CACTTTCCCTGCCGTTAA-3，
[0028]下游引物:5’-TTTCTGGGCTTTAGAGAGGGGAAG-3，。
[0029]PR2:94°C預(yù)變性 5min ;32 個循環(huán) 94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸5min。
[0030]所述的引物對PRl為:
[0031]上游引物:5’-CCTTGAAGGTGGGTGTGA-3’
[0032]下游引物:5’-CAGGCTCTGCAGATTCGACTCC-3，。
[0033]PR3:94°C預(yù)變性 5min ;32 個循環(huán) 94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸5min。
[0034]所述的檢測AC_000160.lg.360T>G，AC_000160.lg.424G>C 和AC_000160.lg.540A>G位點多態(tài)性的瓊脂糖凝膠濃度均為3%。AC_000160.lg.360T>G位點多態(tài)性為:CC基因型表現(xiàn)為144bp條帶和22bp條帶，CT基因型表現(xiàn)為166bp條帶、144bp條帶和22bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為166bp條帶；AC_000160.lg.424G>C位點多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為171bp條帶和26bp條帶，GT基因型表現(xiàn)為197bp條帶、171bp條帶和26bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為197bp條帶；AC_000160.lg.540A>G位點多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為288bp條帶和26bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為314bp條帶，288bp條帶和26b p條帶；AA基因型表現(xiàn)為314bp條帶。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把DNA池測序技術(shù)和PCR-RFLP技術(shù)相結(jié)合起來大大降低了 SSCP技術(shù)的法所和不穩(wěn)定性，這種方法能夠簡單、快速、低成本、精確的檢測各突變位點的多態(tài)性。
[0036]本發(fā)明根據(jù)AP0A2基因的序列設(shè)計引物，分別以5個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到黃牛AP0A2基因的部分序列。與NCBI公布的序列進行比較后，發(fā)現(xiàn)存在三個單核苷酸突變:AC_000160.lg.360T>G,AC_000160.lg.424G>C和AC_000160.lg.540A>G。針對上述AP0A2基因三個突變位點，本發(fā)明公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計特定的引物進行PCR擴增，然后用特定的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。
[0037]本發(fā)明對AP0A2基 因三個多態(tài)位點進行了基因頻率分析，并對三個位點與南陽牛的生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點可以作為南陽牛生長性狀的分子標(biāo)記。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G位點各基因型個體的測序圖，依次為GG基因型、GT基因型和TT基因型。[0039]圖2為黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.424G>C位點各基因型個體的測序圖，依次為CC基因型、CG基因型和GG基因型。
[0040]圖3為黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.540A>G位點各基因型個體的測序圖，依次為AA基因型、AG基因型和GG基因型。
[0041]圖4為黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G位點PRl擴增經(jīng)酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中M為Marker I (分別是由上及下為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和IOObp) ο
[0042]圖5為黃牛ΑΡ0Α2基因AC_000160.lg.424G>C位點PR2擴增經(jīng)酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中M為Marker I。
[0043]圖6為黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.540A>G位點PR3擴增經(jīng)酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中M為Marker I。
具體實施方案
[0044]本發(fā)明利用PCR-RFLP 方法對黃牛 AP0A2 基因 AC_000160.lg.360T>G,AC_000160.lg.424G>C和AC_000160.lg.540A>G三個位點多態(tài)性進行檢測，下面結(jié)合對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定的。
[0045]一、黃牛AP0A2基因部分DNA序列的克隆及其多態(tài)性的檢測
[0046]1、血液樣品采集
[0047]本發(fā)明具體以4個中國地方黃牛品種共計1021頭黃牛個體為檢測對象，
[0048]具體采集樣本見表1:
[0049]表1樣本米集信息表
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測中國地方黃牛AP0A2基因多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含AP0A2基因的待測牛基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛AP0A2基因，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)3個突變位點；針對這3個位點設(shè)計3對引物PRU PR2和PR1，分別利用Bmgt120 I，Hind III和Hae III三種限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳鑒定了黃牛APOA2基因 AC_000160.lg.360T>G,AC_000160.lg.424G>C 和 AC_000160.lg.540A>G 三個突變位點的多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測黃牛APOA2基因3個突變位點多態(tài)性的方法，其特征在于，所述的篩選APOA2基因突變位點的PCR擴增反應(yīng)所需引物和程序為: 所述的引物對P為: 上游引物:5’ -CTCCTCCAAAGTCCTTATCACC-3’ 下游引物:5’ -GCAGGCTCACAACTTAACTCC-3’ P:94°C 預(yù)變性 5min ;35 個循環(huán) 94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72。。延伸 lmin30s ；72°C延伸IOrnin0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測黃牛APOA2基因3個突變位點多態(tài)性的方法，其特征在于，針對篩選得到的APOA2基因3個突變位點設(shè)計3對引物PRl、PR2和PRl。所述的鑒定APOA2基因突變位點的PCR擴增反應(yīng)所需引物和程序為: 所述的引物對PRl為: 上游引物:5’ -AATCCCAAGGAGGAGAAGGTGGCC-3’ 下游引物:5’ -ATTCAGCCTCAGCTCTCAGCCCT-3’ PRl:94°C預(yù)變性 5min ;32 `個循環(huán) 94°C變性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 IOs ;72°C延伸 5min。 所述的引物對PR2為: 上游引物:5’ -CACTTTCCCTGCCGTTAA-3， 下游引物:5’ -TTTCTGGGCTTTAGAGAGGGGAAG-3’ PR2:94°C預(yù)變性 5min ；32 個循環(huán) 94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 IOs ;72°C延伸 5min， 所述的引物對PRl為: 上游引物:5’ -CCTTGAAGGTGGGTGTGA-3’ 下游引物:5’ -CAGGCTCTGCAGATTCGACTCC-3’ P:94°C預(yù)變性5min ；32個循環(huán)94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸IOs ;72°C延伸5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測黃牛APOA2基因3個突變位點多態(tài)性的方法，其特征在于，分別利用Bmgtl20 I ,HindIII和Hae III三種限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛APOA2基因AC_000160.lg.360T>G位點多態(tài)性為:CC基因型表現(xiàn)為144bp條帶和22bp條帶，CT基因型表現(xiàn)為166bp條帶、144bp條帶和22bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為166bp條帶；AC_000160.lg.424G>C位點多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為171bp條帶和26bp條帶，GT基因型表現(xiàn)為197bp條帶、171bp條帶和26bp條帶，TT基因型表現(xiàn)為197bp條帶；AC_000160.lg.540A>G位點多態(tài)性為:GG基因型表現(xiàn)為288bp條帶和26bp條帶；AG基因型表現(xiàn)為314bp條帶，288bp條帶和26bp條帶；AA基因型表現(xiàn)為314bp條帶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測黃牛AP0A2基因3個突變位點多態(tài)性的方法，其特征在于，檢測3個位點多態(tài)性所用的瓊脂糖濃度為3%。
6.權(quán)利要求1至5中任意一項權(quán)利要求所述的快速檢測黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G,AC_000160.lg.424G>C 和 AC_000160.lg.540A>G 三個突變位點的多態(tài)性的方法在鑒定不同牛群體多態(tài)性中的診斷應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的診斷應(yīng)用，其特征在于，鑒定不同黃牛群體多態(tài)性，黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.360T>G位點的多態(tài)性作為一個在黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中影響黃牛12月齡坐骨端寬、18月齡體長和18月齡胸圍的分子遺傳標(biāo)記，黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.424G>C位點的多態(tài)性作為一個在黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中影響黃牛12月齡體長和12月齡胸圍的分子遺傳標(biāo)記，黃牛AP0A2基因AC_000160.lg.540A>G位點的多態(tài)性作為一個在黃牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇育種中影響黃牛24月齡體重、體高和坐骨端寬的分 子遺傳標(biāo)記。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789407SQ201310466317
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】陳宏 , 周揚, 李彩霞, 蔡含芳, 徐瑤, 藍(lán)賢勇, 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)