專利名稱：一種采用dna為探針的電化學(xué)檢測(cè)環(huán)境污染物方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分析和生物傳感領(lǐng)域，特別是涉及DNA電化學(xué)傳感器檢測(cè)環(huán)境中基因毒性化合物的方法。
背景技術(shù)：
DNA傳感器檢測(cè)主要分為靶DNA檢測(cè)和DNA突變測(cè)定兩種。這些測(cè)定在人類(lèi)疾病診斷、環(huán)境中病原體檢測(cè)、食品安全、檢疫等方面有廣泛的應(yīng)用。隨著人們對(duì)環(huán)境安全及身體健康的日益關(guān)注，迫切需要能對(duì)各種重大疾病進(jìn)行早期診斷和治療，迅速對(duì)周邊環(huán)境進(jìn)行安全評(píng)價(jià)。然而，目前對(duì)環(huán)境中具有基因毒性物質(zhì)的篩查檢測(cè)，主要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞毒理學(xué)評(píng)價(jià)來(lái)得到其毒性強(qiáng)弱的數(shù)據(jù)，此方法費(fèi)用高昂、 周期長(zhǎng)，不適合大批量化合物的毒性篩查。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MQ和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MQ，可以對(duì)已知基因毒性化合物定性定量，然而其設(shè)備大型昂貴很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且檢測(cè)項(xiàng)目單一，通量小，樣品前處理復(fù)雜耗時(shí)。另外，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法無(wú)法對(duì)未知化合物和新化合物可能的毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于動(dòng)物試驗(yàn)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)驗(yàn)存在的缺點(diǎn)，20世紀(jì)70年代以后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始利用微生物傳感器來(lái)檢測(cè)基因毒性物質(zhì)引起的DNA損傷或序列改變，主要有Ames 法，SOS顯色反應(yīng)等及其從中衍生出來(lái)的方法。然而，Ames法檢測(cè)假陽(yáng)性高；SOS顯色反應(yīng)靈敏度不夠。本發(fā)明所使用的DNA電化學(xué)傳感器結(jié)合了 DNA和電化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，總體來(lái)說(shuō)，包括以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)1)、特異性好，DNA分子雙鏈之間通過(guò)特定的堿基配對(duì)而具有非常高的特異性識(shí)別能力。2)、穩(wěn)定性好，離體DNA比多數(shù)蛋白質(zhì)(酶)分子的熱穩(wěn)定性好，制成的傳感器可以保存較長(zhǎng)時(shí)間。3)、制備簡(jiǎn)單，可以大批量合成。4)、電化學(xué)響應(yīng)快，操作比較簡(jiǎn)便。5)、靈敏度高，成本低廉，適合大批量篩查檢測(cè)。然而電化學(xué)方法直接檢測(cè)DNA產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)較低，微弱的響應(yīng)信號(hào)容易受到噪聲干擾，發(fā)生基線偏移，降低了儀器的靈敏度。而環(huán)境中基因毒性化合物的濃度低，引起的電信號(hào)變化不明顯。本發(fā)明使用信號(hào)分子探針增大DNA電化學(xué)傳感器的靈敏度，使得低至皮摩爾濃度的基因毒性化合物產(chǎn)生的電信號(hào)變化也能夠被檢測(cè)到。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)易、快速而靈敏的基因毒性化合物的篩選方法，不僅可以評(píng)價(jià)已知基因毒性化合物毒性強(qiáng)弱；還可以評(píng)價(jià)未知化合物的毒性效應(yīng)；篩查實(shí)際樣品中是否含有基因毒性化合物。儀器設(shè)備小型廉價(jià)，檢測(cè)通量大，樣品前處理簡(jiǎn)單，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)。可直接應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查與檢測(cè)，達(dá)到經(jīng)濟(jì)、靈敏、準(zhǔn)確和快速大批量篩查的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作方便、檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并且能夠用于現(xiàn)場(chǎng)篩查檢測(cè)環(huán)境污染物尤其是基因毒性化合物的生物傳感器檢測(cè)方法。用于基因毒性化合物篩查的DNA電化學(xué)傳感器，應(yīng)用其對(duì)目標(biāo)分析物檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高，適合大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)篩查。核酸傳感器檢測(cè)基因毒性化合物的原理基因毒性化合物與核酸傳感器上的固載 DNA作用后，通過(guò)與雙鏈DNA非共價(jià)結(jié)合、DNA堿基損傷等方式會(huì)引起DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)或配對(duì)的細(xì)微變化，上述變化通過(guò)在雙鏈DNA上引入與DNA特異性結(jié)合的電化學(xué)活性分子亞甲基藍(lán)(MB)能夠進(jìn)行信號(hào)放大。通過(guò)記錄核酸傳感器與基因毒性化合物作用前后的電信號(hào)變化可以判斷目標(biāo)分析物是否具有基因毒性及其毒性大小。對(duì)于單一的目標(biāo)分析物，該核酸傳感器的信號(hào)變化強(qiáng)度與目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)線性相關(guān)。對(duì)于水、土壤、食品、空氣、煙道氣等復(fù)雜的目標(biāo)樣品，該核酸傳感器能夠快速篩查目標(biāo)樣品中是否含有基因毒性化合物。該核酸傳感器還可以通過(guò)與毒性已知的化合物的比對(duì)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)新合成或毒性未知的化合物的毒性效應(yīng)。本發(fā)明使用的DNA捕獲探針和封閉劑(巰基己醇)通過(guò)末端標(biāo)記的巰基固定在金電極表面?；パa(bǔ)靶核酸片段在15 30°C與金電極上固載的DNA捕獲探針在緩沖體系(pH 7. 0)中反應(yīng)1 2小時(shí)。本發(fā)明在核酸傳感器的檢測(cè)溶液中加入與核酸傳感器特性結(jié)合的具有氧化還原活性的信號(hào)分子亞甲基藍(lán)(MB)，增加了電極的響應(yīng)電流信號(hào)。本發(fā)明檢測(cè)的非水溶性已知化合物在助溶劑N，N- 二甲基甲酰胺的作用下溶于檢測(cè)體系進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)分析。未知化合物通過(guò)電化學(xué)分析檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與六氯苯的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比評(píng)價(jià)未知化合物的基因毒性效應(yīng)。目標(biāo)分析物為實(shí)際樣品時(shí)，可以通過(guò)電化學(xué)分析檢測(cè)確定樣品中是否含有基因毒性化合物。本發(fā)明的檢測(cè)方法包括以下步驟a).將單鏈DNA捕獲探針的一端固定在電化學(xué)裝置的工作電極表面，得到核酸捕獲探針，采用封閉劑與工作電極表面的剩余位點(diǎn)結(jié)合；b).在雜交條件下，將互補(bǔ)靶DNA片段與上述的核酸捕獲探針雜合，得到雙鏈DNA 修飾的工作電極探針；C).采用與雙鏈DNA特異性結(jié)合的電活性信號(hào)分子溶液浸泡雙鏈DNA修飾的工作電極探針，得到核酸傳感器；將核酸傳感器、參比電極和輔助電極置于檢測(cè)緩沖體系中，進(jìn)行電化學(xué)掃描并記錄得到的電化學(xué)信號(hào)Ia，氮?dú)獯蹈?。在修飾電極表面滴加空白緩沖溶液，處理10 40分鐘， 隨后浸入含有2 20 μ M信號(hào)探針(MB)的檢測(cè)溶液，掃描電化學(xué)信號(hào)，作空白對(duì)照。；d).取出核酸傳感器，將液態(tài)的目標(biāo)分析物滴加到核酸傳感器表面，靜置10 30 分鐘，緩沖溶液淋洗，得到處理后的核酸修飾傳感器；然后將處理后的核酸修飾傳感器重新浸入到上述檢測(cè)緩沖體系，進(jìn)行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號(hào)Ib ；e).通過(guò)電流下降百分比(Ia-Ib)/Ia是否彡8%，對(duì)基因毒性化合物進(jìn)行篩選檢測(cè)分析；通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)化合物(六氯苯)的電流下降百分比對(duì)比，對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)；通過(guò)核酸傳感器電化學(xué)分析檢測(cè)確定實(shí)際樣品中是否含有目標(biāo)分析物；所述的未知化合物通過(guò)核酸傳感器檢測(cè)的電流下降百分比，來(lái)評(píng)價(jià)未知化合物的基因毒性效應(yīng)。核酸傳感器的制備與樣品的檢測(cè)過(guò)程可以分為以下三個(gè)步驟本發(fā)明使用峰電流信號(hào)下降百分比評(píng)價(jià)化合物毒性大小n為N，N_ 二甲基甲酰胺緩沖溶液處理雙鏈DNA修飾的金電極后掃描的峰電流，即背景溶液掃描的峰電流;m為3， 3’，4,4'-TePCB等檢測(cè)化合物溶液處理雙鏈DNA修飾的金電極后掃描的峰電流；w為3，3’， 4,4' -TePCB等檢測(cè)化合物溶液處理前后峰電流信號(hào)下降百分比。峰電流信號(hào)下降百分比公式如下w = [(n-m)/n]*100%相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、檢測(cè)結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。DNA傳感器具有比蛋白質(zhì)(酶)傳感器對(duì)環(huán)境更好的穩(wěn)定性，從而只有具有基因毒性的化合物才會(huì)引起電信號(hào)變化，提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠、準(zhǔn)確性?？梢杂脕?lái)篩查實(shí)際樣品中是否含有基因毒性化合物。2、擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。非基因毒性助溶劑的使用，使得大量不溶于水的已知有機(jī)污染物列入了 DNA傳感器的檢測(cè)范圍；同時(shí)可以對(duì)未知溶液進(jìn)行檢測(cè)，確定是否具有基因毒性。3、可以實(shí)現(xiàn)便捷、快速高通量篩查。檢測(cè)設(shè)備由一個(gè)微型化的電化學(xué)工作站、一個(gè)三電極體系以及一個(gè)檢測(cè)池組成，設(shè)備簡(jiǎn)單，易于攜帶，適合野外現(xiàn)場(chǎng)篩查。


圖1為本發(fā)明方法中基因毒性化合物與檢測(cè)探針作用模式示意圖。圖2為本發(fā)明方法實(shí)施例1中監(jiān)測(cè)DNA探針與電極組裝過(guò)程，A圖中a為裸金電極在ImM鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安(CV)曲線，b為DNA和巰基己醇修飾金電極的CV曲線。B圖中a為修飾單鏈DNA(捕獲核酸探針)的金電極在10 μ M MB溶液中的CV曲線，b 為修飾雙鏈DNA的金電極在10 μ M MB溶液中CV曲線。插圖中a為修飾單鏈DNA的金電極在10 μ M MB溶液中微分脈沖掃描(DPV)曲線，b為修飾雙鏈DNA的金電極在10 μ M MB溶液中DPV曲線。圖3為核酸修飾電極在MB溶液中不同掃速下掃描曲線，自上到下為80、60、40、20、 10mV/s ；插圖為掃描速度與電信號(hào)線性相關(guān)曲線。圖4為本發(fā)明方法實(shí)施例2的六氯苯濃度與電信號(hào)關(guān)系的曲線。圖5為本發(fā)明方法實(shí)施例3中六氯苯與雙鏈核酸探針作用的紫外可見(jiàn)曲線。分別為曲線a表示MB溶液；曲線b表示MB-DNA溶液；曲線c表示2 μ 1 1(Γ2Μ的六氯苯作用于 MB-DNA。圖6為本發(fā)明方法實(shí)施例4的基因毒性化合物(lOOng/ml)與幾種非基因毒性化合物(lOOng/ml)引起的電信號(hào)下降百分比對(duì)照?qǐng)D1、硝酸鉀；2、檸檬酸鈉；3、草酸鈉； 4、尿素；5、乙酸乙酯；6、碳酸二乙酯；7、三氯甲烷；8、3，3，，4，4，-TePCB ；9、3，3，，4，4，，5， 5，-PePCB ；10、l，2，3，4，7，8-HxCDD ； 11、2，3，7，8-TBrDF。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
以下是部分本發(fā)明實(shí)施例中所用的儀器和設(shè)備，其它未具體注明的實(shí)驗(yàn)條件，按照常規(guī)或儀器制造廠建議的條件。紫外可見(jiàn)所用儀器為紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SP-1901，中國(guó))。紫外可見(jiàn)測(cè)量條件 光源為紫外和可見(jiàn)燈，光源在325nm處自動(dòng)切換，掃描波長(zhǎng)范圍為190 700nm，掃描間隔為lnm。用3ml石英比色皿進(jìn)行測(cè)量，樣品體積為anl，室溫。電化學(xué)檢測(cè)所用儀器為上海辰華電化學(xué)工作站CHI440，三電極體系，檢測(cè)體系處于氮?dú)夥諊?。DNA雙鏈(莫羅尼氏白血病毒片段)皆購(gòu)于Takara (中國(guó)，大連)。DNA序列如表1所示。表1寡聚核苷酸堿基序列
功能名稱堿基組成捕獲探針(a)DNAl5'-SH-(CH2)6-AGCTGCGTCACGCCCA-3'互補(bǔ)片段(b)DNA25 '-TGGGCGTGACGCAGCT -3，雙鏈探針(C)5'- AGCTGCGTCACGCCCA-3，DNA3TGGGCGTGACGCAGCT實(shí)施例1.核酸生物傳感器組裝金電極組裝步驟1)表面積為0. 02cm2金電極用粒徑分別為1，0. 3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末拋光，然后在無(wú)水乙醇和去離子水中反復(fù)超聲清洗3次，每次2分鐘。放入IM硫酸溶液中在 0 1.7V之間循環(huán)掃描活化，當(dāng)掃描曲線完全重合時(shí)，停止掃描(活化完成)。2)圖2A中循環(huán)伏安曲線a表示活化的金電極放入2mM的鐵氰化鉀緩沖溶液， 在-0. 1 0. 6V之間掃描循環(huán)伏安曲線。該曲線氧化還原峰電位差小于75mV，說(shuō)明金電極表面的鐵氰化鉀反應(yīng)屬于完全可逆反應(yīng)，金電極表面沒(méi)有雜質(zhì)并且被完全活化。取出電極后， 用去離子水沖洗并氮?dú)獯蹈?，在電極表面滴加15μ 1 2μ M的巰基末端修飾的單鏈DNA(核酸捕獲探針)，室溫處理6小時(shí)；用去離子水和IOmM PBS緩沖液(ρΗ 7. 0)反復(fù)沖洗，氮?dú)獯蹈?，隨后加入ImM巰基己醇(封閉劑)處理1小時(shí)，封閉電極表面剩余活性位點(diǎn)。3)圖2Α中CV曲線b表示核酸捕獲探針和封閉劑修飾后的金電極放入2mM的鐵氰化鉀溶液，在-0. 1 0.6V之間掃描循環(huán)伏安曲線。CV曲線中鐵氰化鉀的峰電流極大下降，說(shuō)明核酸捕獲探針和封閉劑已經(jīng)完全結(jié)合到金電極表面。圖2B中CV曲線a表示核酸捕獲探針修飾的金電極浸入含有10 μ M MB分子探針的PBS (IOmM)緩沖液中，氮?dú)夥諊聰嚢?0分鐘，在-0. 5 OV范圍內(nèi)掃描(掃速為100mV/s)。圖2B中CV曲線b表示15μ 1 2 μ M的互補(bǔ)鏈DNA滴加到核酸捕獲探針修飾的金電極表面在室溫條件下雜合2小時(shí)，隨后用去離子水和IOmM PBS緩沖液(ρΗ 7.0)反復(fù)沖洗，氮?dú)獯蹈珊?，?0 μ M MB的PBS (IOmM) 緩沖液中掃描。由于MB與單鏈捕獲探針的相互作用大于與雙鏈DNA相互作用，MB與單鏈的結(jié)合量大于雙鏈，捕獲探針修飾金電極產(chǎn)生的電信號(hào)高于雙鏈DNA修飾金電極的電信號(hào)。4)圖3為核酸捕獲探針修飾金電極在10 μ M MB溶液中以10、20、40、60、80mV/s五個(gè)不同的掃速掃描，得出掃速與信號(hào)強(qiáng)度成線性相關(guān)，此反應(yīng)屬于電極表面控制反應(yīng)。實(shí)施例2.核酸生物傳感器檢測(cè)六氯苯用N，N- 二甲基甲酰胺作助溶劑將六氯苯溶于IOmM的PBS緩沖液中，配成ΙΟΟρΜ、 ΙηΜ、ΙΟηΜ、ΙΟΟηΜ、1 μ M 的六氯苯溶液。圖4表示向雙鏈DNA修飾的金電極表面滴加15 μ 1六氯苯溶液，室溫處理20分鐘，然后浸入10μΜ MB的PBS(IOmM)緩沖液中氮?dú)夥諊码娀瘜W(xué)掃描，得到濃度與電信號(hào)之間的相關(guān)曲線。六氯苯與DNA作用，通過(guò)與雙鏈DNA非共價(jià)結(jié)合、DNA堿基損傷等方式引起DNA配對(duì)變化，導(dǎo)致核酸傳感器電信號(hào)改變。隨著濃度的升高，電信號(hào)逐步衰減，信號(hào)變化強(qiáng)度與六氯苯濃度在一定范圍內(nèi)線性相關(guān)。實(shí)施例3.紫外可見(jiàn)檢測(cè)六氯苯與DNA的作用模式圖5表示在石英比色皿中加入anl IOmM的PBS緩沖液，在190 700nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描空白，曲線a為向空白溶液中加入20 μ 1 ImM的MB，全波長(zhǎng)掃描得到MB峰。曲線b為向MB溶液中加入6 μ 1 100 μ M的雙鏈DNA，搖勻靜置10分鐘，掃描得到MB與DNA的混合峰。選擇620-700nm處的無(wú)干擾峰為檢測(cè)波長(zhǎng)范圍。曲線c為在MB和DNA的混合溶液中加入2 μ 1 IO-2M的六氯苯，測(cè)定溶液在620-700nm的吸收峰。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到MB峰出現(xiàn)在190 ；350歷和620 700nm，而DNA峰的位置在220 270nm，與MB 190 350nm處的峰互相干擾，不宜作為分析研究對(duì)象。而MB 620 700nm的峰沒(méi)有受到DNA的峰干擾，可以作為本實(shí)驗(yàn)的分析研究對(duì)象。DNA加入后，MB嵌入雙螺旋DNA，發(fā)生π - π *共軛，MB峰強(qiáng)度明顯減弱(減色效應(yīng))，且吸收峰的位置紅移3nm。 當(dāng)加入2 μ 1 IO-2M的六氯苯后，由于六氯苯與DNA間強(qiáng)烈的相互作用，六氯苯將部分MB從 DNA雙鏈上取代下來(lái)，MB的吸收峰強(qiáng)度增大(增色效應(yīng))，并出現(xiàn)藍(lán)移，當(dāng)加入4μ1以上
六氯苯后，MB峰不再出現(xiàn)藍(lán)移和增色效應(yīng)，六氯苯與DNA的結(jié)合達(dá)到飽和。實(shí)施例4.核酸生物傳感器篩查檢測(cè)基因毒性化合物圖6為用N，N- 二甲基甲酰胺作為助溶劑將下列12種化合物溶于IOmM的PBS， 配成lOOng/ml的溶液，用核酸傳感器記錄電信號(hào)變化；12種檢測(cè)化合物分別為1、硝酸鉀；2、檸檬酸鈉；3、草酸鈉；4、尿素；5、乙酸乙酯；6、碳酸二乙酯；7、三氯甲烷；8、3，3，，4， 4，-TePCB ;9、3，3，，4，4，，5，5，-PePCB ； 10、1，2，3，4，7，8-HxCDD ；11、2，3，7，8-TBrDF。在雙鏈DNA修飾的電極表面，滴加15 μ 1上述化合物溶液，室溫靜置20分鐘，然后浸入10 μ M MB 的PBS(IOmM)緩沖液中氮?dú)夥諊聮呙桦娀瘜W(xué)信號(hào)。沒(méi)有基因毒性的硝酸鉀、檸檬酸鈉、草酸鈉、尿素、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、三氯甲烷等幾乎檢測(cè)不到電信號(hào)下降，為陰性結(jié)果。(經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到電信號(hào)下降百分比小于 8%時(shí)，視為陰性結(jié)果)。2，3，7，8-TBrDF和1，2，3，4，7，8_Hx⑶D毒性大小相似，二者引起的電信號(hào)下降百分比接近。而PCB毒性相對(duì)較小，引起的電信號(hào)下降百分比小于2，3，7， 8-TBrDF和1，2，3，4，7，8_Hx⑶D。從而得出結(jié)論化合物基因毒性的大小不同，導(dǎo)致電信號(hào)不同程度的下降。此方法能夠明顯的區(qū)別背景和具有基因毒性的化合物的響應(yīng)信號(hào)，因此可以用來(lái)做大批量環(huán)境樣品的初篩；不但可以對(duì)已知基因毒性化合物篩查評(píng)價(jià)，確定其毒性與電信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而且可以評(píng)價(jià)未知化合物的毒性效應(yīng)；篩查實(shí)際樣品中是否含有基因毒性化合物。
與現(xiàn)有的生物傳感器相比，該方法主要優(yōu)點(diǎn)是1.靈敏度高，電活性信號(hào)分子與核酸探針結(jié)合，增大了響應(yīng)電流；2.儀器設(shè)備小型廉價(jià)，檢測(cè)通量大，樣品前處理簡(jiǎn)單，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)。此方法不但可以對(duì)已知基因毒性化合物進(jìn)行篩查檢測(cè)，而且可以評(píng)價(jià)新合成化合物的潛在毒性效應(yīng)；篩查實(shí)際樣品中是否含有基因毒性化合物。
權(quán)利要求
1.一種采用雙鏈DNA為檢測(cè)探針的電化學(xué)檢測(cè)環(huán)境污染物的方法，采用三電極體系的電化學(xué)裝置進(jìn)行檢測(cè)，特征在于，該方法包括以下步驟a).將單鏈DNA捕獲探針的一端固定在電化學(xué)裝置的工作電極表面，得到核酸捕獲探針，采用封閉劑與工作電極表面的剩余位點(diǎn)結(jié)合；b).在雜交條件下，將互補(bǔ)靶DNA片段與上述的核酸捕獲探針雜合，得到雙鏈DNA修飾的工作電極探針；c).采用與雙鏈DNA特異性結(jié)合的電活性信號(hào)分子溶液浸泡雙鏈DNA修飾的工作電極探針，得到核酸傳感器；將核酸傳感器、參比電極和輔助電極置于檢測(cè)緩沖體系中，進(jìn)行電化學(xué)掃描并記錄得到的電化學(xué)信號(hào)Ia;d).取出核酸傳感器，將液態(tài)的目標(biāo)分析物滴加到核酸傳感器表面，靜置10 30分鐘， 緩沖溶液淋洗，得到處理后的核酸修飾傳感器；然后將處理后的核酸修飾傳感器重新浸入到上述檢測(cè)緩沖體系，進(jìn)行電化學(xué)掃描并記錄響應(yīng)信號(hào)Ib ；e).通過(guò)電流下降百分比(Ia-Ib)/Ia是否彡8%，對(duì)基因毒性化合物進(jìn)行篩選檢測(cè)分析；通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)化合物(六氯苯)的電流下降百分比對(duì)比，對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)；通過(guò)核酸傳感器電化學(xué)分析檢測(cè)確定實(shí)際樣品中是否含有目標(biāo)分析物；所述的未知化合物通過(guò)核酸傳感器檢測(cè)的電流下降百分比，來(lái)評(píng)價(jià)未知化合物的基因毒性效應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雙鏈核酸為含有12 30個(gè)堿基對(duì)， 并且鳥(niǎo)嘌呤(G)含量彡25%的雙鏈核酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的電化學(xué)裝置的工作電極是貴金屬電極；所述的核酸捕獲探針和封閉劑通過(guò)末端標(biāo)記的功能基團(tuán)固定在電極表面；所述的核酸捕獲探針和封閉劑的功能基團(tuán)為生物素、硅氧基、巰基或氨基中的一種。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的電化學(xué)裝置的工作電極是金電極；所述的核酸捕獲探針和封閉劑的末端標(biāo)記的功能基團(tuán)為巰基。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述封閉劑為巰基末端修飾的封閉劑，即硫代鏈烴或硫代芳香烴，優(yōu)選硫代鏈烴；所述的硫代鏈烴中的鏈烴是指分子中的碳原子結(jié)合成鏈的有機(jī)化合物，硫代芳香烴中的芳香烴是指分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碳?xì)浠衔铩?br> 6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的硫代鏈烴的碳原子數(shù)個(gè)數(shù)為2 30 個(gè)，優(yōu)選6 10個(gè)碳原子。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的雜交條件為0 60°C反應(yīng)0.2 6 小時(shí)，優(yōu)選15 30°C反應(yīng)1 2小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的信號(hào)分子為與DNA特異性結(jié)合的具有氧化還原活性的化合物，優(yōu)選的是亞甲基藍(lán)(MB)或聯(lián)吡啶釕或聯(lián)吡啶鈷。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的目標(biāo)分析物為毒性已知化合物或毒性未知化合物；所述的毒性已知化合物為水溶性化合物或可溶于助溶劑的非水溶性化合物；非水溶性化合物在助溶劑的作用下溶于緩沖體系；所述的助溶劑為對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響的N，N-二甲基甲酰胺；所述的毒性未知化合物為新合成的化合物或毒性效應(yīng)未知的已合成化合物。
全文摘要
一種采用DNA為探針的電化學(xué)檢測(cè)環(huán)境污染物方法，所述的生物傳感器檢測(cè)裝置包括工作電極、輔助電極、參比電極、檢測(cè)池和電化學(xué)工作站；工作電極表面修飾核酸探針，在緩沖體系中檢測(cè)環(huán)境樣品中的基因毒性化合物。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，傳感器的信號(hào)變化明顯。與現(xiàn)有的生物傳感器相比，該方法主要優(yōu)點(diǎn)是1.靈敏度高，電活性信號(hào)分子與核酸探針結(jié)合，增大了響應(yīng)電流；2.儀器設(shè)備小型廉價(jià)，檢測(cè)通量大，樣品前處理簡(jiǎn)單，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)。此方法不但可以對(duì)已知基因毒性化合物進(jìn)行篩查檢測(cè)，而且可以評(píng)價(jià)新合成化合物的潛在毒性效應(yīng)；篩查實(shí)際樣品中是否含有基因毒性化合物。
文檔編號(hào)G01N27/49GK102375021SQ20101026208
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者盧憲波, 吳立冬, 蘇凡, 陳吉平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所