專利名稱：人骨唾液酸蛋白elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，是一種人血清中骨重吸收相 關標志物骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)的檢測試劑盒。
背景技術：
骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)是細胞外基質中的一種酸性糖蛋白，其 組織分布相對局限，主要分布在礦化組織(如骨、牙齒)和鈣化的軟骨與骨的交界區(qū)，其含 量約占骨細胞外基質中非膠原蛋白質的15%。近年研究發(fā)現(xiàn)BSP的表達水平與骨質疏松癥 和腫瘤骨轉移等疾病關系較為密切，血清BSP含量有望作為骨質疏松癥和乳腺癌、肺癌、腎 癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤骨轉移預測的標志物之一。目前，檢測血清BSP含量方法包括放射免疫分析法和ELISA法二種。其中，放射 免疫分析法不僅需要特定的儀器、操作較為復雜，而且工作人員在操作時存在受到放射性 損害的風險，環(huán)境存在受到放射性污染的可能，因此安全性較差；而現(xiàn)有技術的ELISA檢測 法需要依賴進口試劑盒，由于這種進口試劑盒結構復雜、價格昂貴，因此其應用受到一定限 制，不適宜推廣應用。

實用新型內容本實用新型目的，是為了克服現(xiàn)有技術的ELISA檢測法存在進口試劑盒結構復 雜、價格昂貴的缺點，提供一種廉價、簡便的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，并具有操 作簡單、檢測快速、準確，靈敏度高、成本低和穩(wěn)定好的特點。本實用新型的目的主要通過以下技術方案實現(xiàn)人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔酶標板、一張蓋 板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具，其結構特點在于96孔酶標板是在微孔條上預包被 鼠抗人BSP單抗(一抗)制成的檢測板；13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準 品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液(二抗)，1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液(酶標三抗)，1瓶 顯色液，1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液；所述模具包括13個下凹瓶位，其與 13瓶試劑一一對應。本實用新型的目的還可以通過以下技術方案實現(xiàn)本實用新型的一種實施方式是盒體是硬紙盒；96孔酶標板由96孔聚苯乙烯酶標 板構成、放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是透明硬塑料貼膜；6個濃度標準品溶液和高濃度標準 品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝載，兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙 烯微量離心管裝載，羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色透明聚丙烯微量離心管裝載，濃縮洗滌 液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載，樣本緩沖液用藍色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載， 顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載，終止液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載； 下凹瓶位用塑料泡沫制成。本實用新型的一種實施方式是96孔酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆裝
3式12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝式微孔條有8個反應孔，每個反應孔預包被鼠抗 人BSP單抗；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液6瓶、Iml/瓶，濃度分別為 2，8，16，32，64，128ng/ml ；高濃度標準品溶液1瓶、Iml/瓶；兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶， 200 μ 1/瓶；羊抗兔IgG-HRP濃縮液1瓶，200 μ 1/瓶；顯色液1瓶、15ml/瓶，終止液1瓶、 15ml/瓶；濃縮洗滌液1瓶、IOOml/瓶；樣本緩沖液1瓶、15ml/瓶。本實用新型的一種實施方式是盒內還設有一個自封袋、一份說明書和一份質檢 報告書。本實用新型具有的有益效果如下1、本實用新型具有結構簡單、成本低廉，以及快速、簡便、準確地檢測血清BSP含 量的特點。2、實驗表明本實用新型試劑盒具有很高的靈敏度血清的最低檢測限為1. 5ng/ ml，標準曲線的線性范圍為2-lOOng/ml，回收率為80. 5 % 士 11. 2 %，相對于放射免疫分析 法和進口的同類ELISA試劑盒，本試劑盒無放射性污染，更安全，成本低，靈敏度高。

圖1為本實用新型中模具的結構俯視圖。
具體實施例具體實施例圖1構成具體實施例的模具。本實施例公開一種人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96 孔酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具，96孔酶標板是在微孔條上預包被 鼠抗人BSP單抗(一抗)制成的檢測板；13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準 品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液(二抗)，1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液(酶標三抗)，1瓶 顯色液，1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液；所述模具包括13個下凹瓶位，其與 13瓶試劑一一對應。盒內還設有一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告書。如圖1所示，泡沫塑料模具1有13個下凹瓶位，與13瓶試劑一一對應，其對應位 置依次為50ml濃縮洗滌液位于下凹瓶位2，200 μ 1 二抗?jié)饪s液位于下凹瓶位3，200 μ 1酶 標三抗?jié)饪s液位于下凹瓶位4，15ml樣本緩沖液位于下凹瓶位5，15ml顯色液位于下凹瓶位 6，15ml終止液位于下凹瓶位7，6種濃度Iml/瓶標準品溶液及Iml高濃度標準品溶液位于 下凹瓶位8。本實施例中96孔酶標板由96孔聚苯乙烯酶標板構成、放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是透明硬塑 料貼膜；6個濃度標準品溶液和高濃度標準品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝 載，兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管裝載，羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃 色透明聚丙烯微量離心管裝載，濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載，樣本緩 沖液用藍色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載，顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載，終 止液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載；下凹瓶位用塑料泡沫制成。96孔酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆裝式12條酶標反應微孔條組成，每
4個可拆裝式微孔條有8個反應孔，每個反應孔預包被鼠抗人BSP單抗；蓋板膜大小與酶標板 橫切面大小一致；標準品溶液6瓶、Iml/瓶，濃度分別為2,8,16，32，64，128ng/ml ；高濃度 標準品溶液1瓶、Iml/瓶；兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶，200 μ 1/瓶；羊抗兔IgG-HRP濃縮 液1瓶，200 μ 1/瓶；顯色液1瓶、15ml/瓶，終止液1瓶、15ml/瓶；濃縮洗滌液1瓶、IOOml/ 瓶；樣本緩沖液1瓶、15ml/瓶。本實施例的制作方法如下采用預包被鼠抗人BSP單抗的96孔酶標反應微孔條 制成檢測板，放入真空鋁箔袋中，以塑料硬貼膜為蓋板膜，將50ml濃縮洗滌液，15ml樣本緩 沖液，Iml高濃度標準品溶液，不同濃度標準品溶液6瓶，Iml/瓶，200 μ 1兔抗人BSP多抗 濃縮液，200 μ 1羊抗兔IgG-HRP濃縮液等試劑用不同大小和顏色的塑料瓶和微量離心管盛 裝，并按照圖1所示位置分別固定于泡沫塑料模具1中，與試劑板、蓋板膜一同封裝于紙盒 內。其中，6個濃度標準品溶液和高濃度標準品溶液均用自然色透明聚丙烯微量離心管，兔 抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管，羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色透明聚 丙烯微量離心管，濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶，樣本緩沖液用藍色帽的白 色聚乙烯塑料瓶，顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶，終止液用綠色帽的白色聚乙烯 塑料瓶；每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可一次同時檢 測多個樣品，也可拆開微孔條進行多次檢測。檢測時，樣本中BSP將被酶標板上預包被的一 抗捕獲，加入二抗后，二抗被BSP捕獲，然后加入酶標三抗，被捕獲于板上的二抗與酶標三 抗結合，最后用TMB顯色。樣本吸光度值與樣本中的BSP含量呈正相關，與標準曲線比較， 再乘以稀釋倍數(shù)10，即可得出血清樣品中BSP含量，其操作簡便易行。將本實用新型試劑盒用于血清BSP含量的檢測的具體步驟如下一、樣本準備將人血清按照1 10體積比進行稀釋(1份血清+9份樣本緩沖 液)，存于-20°C待測。二、試劑準備洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按照1 20體積比進行稀釋(或按 需要量稀釋)，(1份IOX濃縮洗滌液+19份去離子水)，稀釋后將工作液存放于密封瓶中， 在2-8°C可保存1個月，用于酶標板的洗滌和抗體的稀釋。三、試劑盒的操作步驟1、從4°C冷藏環(huán)境取出所需試劑，置室溫(20-25°C )平衡30min以上。2、取出框架和所需數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放回自封袋，保存于2_8°C。3、編號將樣本和標準品對應的微孔按序編號，每個標本和標準品做2孔平行，并 記錄各孔的位置。4、加標準品/樣本加標準品/樣本100 μ 1/孔到各自的微孔中，用蓋板膜蓋板 后，避光，37°C孵育2hr?？瞻卓字患訕颖揪彌_液。5、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液，250 μ 1/孔，洗5次； 最后一次甩出孔內液體后，將微孔條反扣于吸水紙上拍干。6、二抗稀釋將二抗?jié)饪s液用洗滌工作液按1 100體積比進行稀釋(1份抗體濃 縮液+99份洗滌工作液)。7、加二抗加入二抗工作液100μ 1/孔，37°C孵育lhr，重復洗板步驟6。8、稀釋酶標三抗將酶標三抗?jié)饪s液用洗滌工作液按1 100體積比進行稀釋(1
5份抗體濃縮液+99份洗滌工作液)。9、加酶標三抗加入酶標三抗工作液100μ 1/孔，37°C孵育lhr，重復洗板步驟6。10、顯色加入底物液100μ 1/孔，用蓋板膜蓋板后，37°C避光，顯色5-15min。11、測定吸光度值加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩均勻，在酶標儀450nm處測每 孔的OD值，參考波長620nm(20min內讀完數(shù)據(jù))。12、計算結果12. 1標準曲線繪制以標準品OD值為縱坐標，以BSP標準品濃度(ng/ml)的對數(shù) 為橫坐標，繪制標準曲線。12. 2計算將樣品OD值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出對應的濃度，乘以稀 釋倍數(shù)10，即為樣品中BSP含量。注意事項1、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性、重復性不 好的現(xiàn)象，所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。2、每加一種試劑前需將其搖勻。3、反應終止液為IM硫酸，應避免接觸皮膚。4、不要使用過了有效日期的試劑盒，也不要使用過期試劑盒中的任何試劑，否則 可能引起靈敏度降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。5、儲存條件本試劑盒存于2_8°C，不可冷凍；將不用的微孔條放進自封袋重新密 封；顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露于光線下。6、顯色劑使用前應無色，有任何顏色均表明已經變質，應當棄之。7、加入底物液后，一般顯色時間為5-15min。若顏色較淺，可延長反應時間到 20min或更長，但不要超過30min.反之，則減短反應時間。8、本試劑盒中試劑含疊氮鈉作為殺菌劑，該物質有毒。酶顯色反應底物TMB也有 毒性，且有致癌性，避免接觸皮膚和粘膜。
權利要求人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的96孔酶標板、蓋板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具(1)，其特征是96孔酶標板是在微孔條上預包被鼠抗人BSP單抗制成的檢測板；13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液，1瓶羊抗兔IgG HRP濃縮液，1瓶顯色液，1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液；模具(1)包括13個下凹瓶位，其與13瓶試劑的對應關系分別是濃縮洗滌液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗?jié)饪s液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG HRP濃縮液位于下凹瓶位(4)、樣本緩沖液位于下凹瓶位(5)、顯色液位于下凹瓶位(6)、終止液位于下凹瓶位(7)、6瓶標準品溶液和1瓶高濃度標準品溶液位于下凹瓶位(8)。
2.根據(jù)權利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，其特征是盒體是硬紙 盒；96孔酶標板由96孔聚苯乙烯酶標板構成、放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是透明硬塑料貼 膜；6個濃度標準品溶液和高濃度標準品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝載， 兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管裝載，羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色 透明聚丙烯微量離心管裝載，濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載，樣本緩沖 液用藍色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載，顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載，終止 液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載；下凹瓶位用塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，其特征是96孔酶標板 由外框支撐架及放置其上的可拆裝式12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝式微孔條有8 個反應孔，每個反應孔預包被鼠抗人BSP單抗；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準 品溶液6瓶、Iml/瓶，濃度分別為2，8，16，32，64，128ng/ml ；高濃度標準品溶液1瓶、Im/瓶; 兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶，200 μ 1/瓶；羊抗兔IgG-HRP濃縮液1瓶，200 μ 1/瓶；顯色液 1瓶、15ml/瓶，終止液1瓶、15ml/瓶；濃縮洗滌液1瓶、IOOml/瓶；樣本緩沖液1瓶、15ml/ 瓶。
專利摘要本實用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒，包括盒體和96孔酶標板、蓋板膜、13瓶試劑和模具(1)，其特征是酶標板是在微孔條上預包被鼠抗人BSP單抗制成的檢測板；13瓶試劑分別為6瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液，1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液，1瓶顯色液，1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液；模具(1)包括13個下凹瓶位，對應關系分別是濃縮洗滌液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗?jié)饪s液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG-HRP濃縮液位于下凹瓶位(4)、樣本緩沖液位于下凹瓶位(5)、顯色液位于下凹瓶位(6)、終止液位于下凹瓶位(7)、標準品溶液和高濃度標準品溶液位于下凹瓶位(8)。本實用新型具有結構簡單、成本低廉，以及快速、簡便、準確地檢測血清BSP含量的特點。
文檔編號G01N33/68GK201666897SQ20092026358
公開日2010年12月8日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權日2009年11月27日
發(fā)明者夏冰, 王捷 申請人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院