專利名稱：一種改進的蓖麻毒素的膠體金檢測試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于生物檢測領域，具體涉及蓖麻毒素的檢測試紙和在檢測蓖麻毒素
中的應用。
背景技術：
蓖麻毒素存在于蓖麻籽(Ricin toxin)中，由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵連接而成。 其中，A鏈為效應鏈，具有糖苷酶活性，能使核糖體失活；B鏈為結合鏈，擁有半乳糖結合位 點。蓖麻毒素毒性很大小鼠的LD50為6. 38 ii g/kg，成年人攝入的致死劑量為5. 0 ii g/kg 7. 0 ii g/kg，性質(zhì)穩(wěn)定，且來源較廣，提取成本低廉，已多次在恐怖襲擊中使用，具有一定的 潛在軍事應用價值。 國內(nèi)已經(jīng)建立了膠體金免疫層析技術對蓖麻毒素的檢測，但并未能實現(xiàn)半定 量檢測，目前國內(nèi)的半定量檢測蓖麻毒素的方法多以酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)為主，ELISA法孵育時間長，不適合作為現(xiàn)場檢測。上述方法 已經(jīng)滿足不了當代防恐需要，迫切需要可以現(xiàn)場、快速、定量檢測蓖麻毒素的方法。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的是提供一種方便、快捷地檢測蓖麻毒素的試紙。該試紙的工作 原理是利用特異性抗原_抗體的結合，用膠體金標記抗體，與待檢抗原結合后，使與試紙上 結合的捕獲抗體顯色。 本實用新型能夠基于一份標本和一個試紙，快速方便地檢測出標本中的蓖麻毒 素，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。 本實用新型涉及一種方便、快捷地檢測蓖麻毒素的檢測試紙，它包含 (1)反應支持物； (2)吸水墊； (3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體檢測條帶和質(zhì)控 羊抗鼠IgG的質(zhì)控條帶； (4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體。 其中，所述的羊抗鼠I gG可購自鼎國生物技術有限公司。 另外，金標抗體保護膜標記的是鼠抗的重組抗體。質(zhì)控用的是羊抗鼠IgG，這是一 種很普遍的抗體，羊抗鼠IgG是本領域非常常用的一種普遍的二抗。 兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體可以來自軍科院微生物所，例如，參見郝蘭群， 郭勝清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素單克隆抗體的制備及應用[J].細胞與分子免疫學雜志， 2003,19(5) :517-518. 鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體可以購自美國Sigma公司。 本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，它還包含樣品墊，該樣品墊的材料
選自聚酯膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
3[0016] 本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中反應支持物選用PVC板。 本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。 本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中金標抗體保護膜選用聚酯膜、 玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體。 另一方面，本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，其中吸水墊、硝酸纖維 膜、金標抗體保護膜、樣品墊和反應支持物按照附圖1所示方式構成；反應支持物5位于底 層，硝酸纖維膜2位于反應支持物5上的中部，該膜的T處是兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆 抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗鼠IgG包被的質(zhì)控條帶；金標抗體保護膜3位于硝酸 纖維膜上部的一側并與之部分重疊，該膜含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆 抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標抗體保護膜3而言的另一側并與硝酸 纖維膜2部分重疊；樣品墊4位于硝酸纖維膜2上與吸水墊1相反的一側并與金標抗體保 護膜3部分重疊。 又一方面，本實用新型涉及的上述蓖麻毒素的檢測試紙，以吸水墊一側為起始端， 樣品墊一側為末端，兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體的檢測條帶位于接近末端，羊抗鼠 IgG包被的質(zhì)控條帶接近于起始端。 本實用新型檢測蓖麻毒素的試紙的制備方法，該方法包括以下步驟膠體金探針 的制備，金標抗體保護膜的制備，硝酸纖維膜的噴涂包被。 本實用新型涉及一種制備上述檢測試紙的制備方法，該方法包括(l)用隔流噴 金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗蓖麻毒素抗體和質(zhì)控抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2)制 備一種含有膠體金標記的抗重組蓖麻毒素抗體的金標抗體保護膜，將膠體金標記的抗重組 蓖麻抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，并烘干或冷凍干燥，制成金標抗體保護膜。 本實用新型所述的制備方法，該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是10-100mm/ s。所述兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體，其加入量為l-5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液 可以為5mM PBS。質(zhì)控羊抗鼠IgG的濃度為0. l-5mg/ml。該方法將膠體金標記的兔抗重組 蓖麻毒素A鏈多克隆抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，其中pH為7-9。 1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制為0. 01 %水溶液，磁力攪拌下準確加入lml 1 %的HAuCl4，同 時加入1. 5-3mll^的檸檬酸三鈉水溶液，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水補足 至100ml，4t:避光保存； (2)用K2C03調(diào)PH值為約7-9，優(yōu)選為約7. 8-8. 9，更優(yōu)選約8. 2-8. 5 ; (3)將膠體金調(diào)至pH 8. 2-8. 5，用5mM PB(pH 7. 2)稀釋抗體至0. 2mg/ml ; (4)保持膠體金穩(wěn)定。 本實用新型還披露一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗體最佳標記劑量的方法，該方法 包括 a.取10只潔凈的1. 5ml離心管，分別加入膠體金溶液lml ;b.在1-10號管內(nèi)分別力B入10ii l、20ii l、30ii 1、40ii 1、50ii 1、60ii 1、70ii 1、
80iil、90iil、100ii1的5mM PB，再依次加入稀釋好的0. 2mg/ml的待標記抗體90iU、
80 ii l、70ii l、60ii l、50ii l、40ii l、30ii l、20ii 1、10ii 1、0ii l，混勻，放置2分鐘； c.在10個管內(nèi)分別加入10% NaCl溶液100 iU，混勻后室溫靜置2小時，觀察顏色變化。 未加抗體及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅變藍的變化， 而加入抗體量達到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(l號管)相比， 顏色最接近、含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為lml膠體金所必須的抗體穩(wěn)定 劑量，在此基礎上再加20%單抗，即為抗體最佳標記劑量。本實用新型經(jīng)過反復試驗和分 析，得出的結果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為8-15ug，優(yōu)選抗體量10-12ug，更優(yōu)選 10. 5-11.5ug，最優(yōu)選為llug。 2 、金標抗體保護膜的制備 取上述pH的膠體金以lml/管分裝于1.5ml的離心管中。每支管中加入8-15ug 標記劑量，優(yōu)選抗體量10-12ug，更優(yōu)選10. 5-11. 5ug，最優(yōu)選為llug的抗體，輕搖混勻后放 置。每管中加入10X的BSA100ia，混勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000rpm、 4t:下離心30分鐘，棄上清液。每支離心管中加入lml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上 清液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， 1000rpm，離心10分 鐘；取上清液，均勻滴在lcm寬的玻璃纖維上，37t:干燥。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被兔抗重組蓖麻毒素抗體和質(zhì) 控羊抗鼠IgG兩個條帶的硝酸纖維膜； 在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是10-100mm/s，更優(yōu)選是45-55mm/s，最 優(yōu)選是50mm/s ;所述兔抗St多克隆抗體，其加入量為l_5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液 可以為PBS ;質(zhì)控兔抗羊IgG可以購自鼎國生物技術公司，其濃度為0. l-5mg/ml更優(yōu)選是 0. 5-2. 5mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml ; (2)制備含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體的金標抗體保護 膜，具體為將膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗均勻涂布在玻璃纖維膜上來 制備，其中，抗體用PB稀釋，pH為7-9，優(yōu)選7. 5-9，最適ra值為8. 5。 本實用新型所述試紙在檢測蓖麻毒素中的應用，參見附圖2。 利用本實用新型試紙檢測蓖麻毒素的方法中，先將待測標本放入裝有稀釋液的小 瓶內(nèi)，再用移液器將樣品混合液加入試紙"4"處(即末端)，樣品中的液體依靠虹吸作用上 行，一般需10-15分鐘判讀結果 如標本中含有蓖麻毒素，則它將與試紙上膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多 克隆抗體形成相應的復合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜上的兔抗重組蓖麻毒素A鏈多 克隆抗體結合，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。 無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記多克隆抗體繼續(xù)隨液體繼續(xù)上行并與該 膜上的羊抗鼠IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失 效，此線就不會出現(xiàn)，說明試紙失效。 陽性結果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。可利用金標免疫分析儀進行半定量檢測。 本實用新型的技術方案是采用純化的兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體、和羊 抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維膜上，結合膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體， 應用膜層析雙抗體夾心法的原理檢測標本中的蓖麻毒素。[0046]
圖1A本實用新型試紙的正面示意圖。 圖1B本實用新型試紙的側面示意圖。
其中，圖1A和IB :1 :吸水墊；2 :硝酸纖維膜(T :包被兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克 隆抗體檢測條帶；C :包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控條帶)；3 :含有膠體金標記鼠抗重組蓖麻毒素A 鏈多克隆抗體多克隆抗體的玻璃纖維膜；4 :樣品墊；5 :反應支持物。
圖2 :檢測結果示意圖；T、 C兩條線陽性；C 一條線陰性；無效。
具體實施方式
以下實施例用于說明本實用新型，但不用來限制本實用新型的范圍。 實施例1、檢測蓖麻毒素的膠體金試紙的制備 1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制成0. 01 %水溶液，取100ml純水加熱至沸騰。磁力攪拌下準 確加入lml 1%的HAuCl4，同時加入1. 5ml質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定 后繼續(xù)加熱煮沸15分鐘，冷卻至室溫后加純水補足至100ml，4t:避光保存。 (2) K2C03調(diào)PH值為8. 2-8. 5左右。 (3)將膠體金調(diào)至適宜的pH，優(yōu)選8. 0-8. 5，更優(yōu)選8. 2，用5mMPB (pH 7. 2)稀釋抗 體至0. 2mg/ml 。 2 、金標抗體保護膜的制備 取pH 8. 2的膠體金以lml/管的量分裝于1. 5ml的離心管中。每支管中加入最佳 標記劑量的抗體，輕搖混勻后放置5分鐘或稍長，此步為抗體與金顆粒結合。每管中加入 10%的BSA100iU，混勻放置10分鐘或稍長，此步為封閉。將上面初步制得的膠體金探針 以12000rpm，離心30分鐘，4。C，棄上清。每支離心管中加入lml重懸液懸浮沉淀后同上離 心。棄上清，留下管底暗紅色疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， 1000rpm，離心 10分鐘；取上清液，均勻的滴加在lcm寬的玻璃纖維上，37。干燥2. 5-3小時。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆 抗體(lmg/ml含有1. 5% BSA)和質(zhì)控羊抗鼠IgG(購自鼎國生物技術公司，lmg/ml)兩個條 帶的硝酸纖維膜； (2)含有膠體金標記鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體12ug的玻璃纖維膜，PB稀
釋；最適ra值為8.5 實施例2、蓖麻毒素檢測試紙 參見圖1，反應支持物為6. 2cmX0. 4cm PCV板；吸水墊為2cmX0. 4cm的濾油 紙；1. 8cmX0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗鼠IgG (購自鼎國生物技術公司，lmg/ml)， 兔抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體；含有0. 4cmX0. 4cm膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒
素A鏈多克隆抗體(標金濃度12ug PB稀釋；最適ra值為8.2)玻璃纖維膜；樣品墊為
2. 7cmX0. 4cm的玻璃纖維；即形成了蓖麻毒素檢測試紙。 實施例3、檢測方法 參見附圖2，將待測標本與樣品稀釋液混勻，再用移液器將樣品混合液加入試紙樣 品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果
6[0067] 如含有蓖麻毒素，則與試紙上膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多抗形成相應 的復合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流兔抗重組蓖麻毒素A鏈多抗結合，形成紅色線 條，即在"T"處形成紅色條帶。 無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記多抗繼續(xù)向上爬行與包被在膜上的羊抗 鼠IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就 不會出現(xiàn)，說明試紙失效。 陽性結果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。 實施例4、采用DJM-3定量金標免疫分析儀半定量檢測 1、可先用檢測法檢測蓖麻毒素試紙條20個陰性值，利用金標儀檢測試其T/C的比 值平均計算出蓖麻毒素試紙條的定閾值。 2、其次利用定閾值來用金標儀機器檢測蓖麻毒素試紙條能達到的最低濃度。 3、判讀結果時大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。 檢測蓖麻毒素標準品各個濃度下，判定值(CUT-OFF)為0. 037的T/C讀值(表1)。 每個濃度檢測兩次取平均值?？梢?，O. 925ii g/ml 14. 8ii g/ml結果為陽性；檢測靈敏度 為0. 925ii g/ml。 表l蓖麻毒素試紙條不同濃度樣品半定量檢測結果
檢測值T (V)質(zhì)控值C (V)T/C結果
樣品濃度
判讀
TtT2c2T/QT/C2T/C平00.0110.0071.11.1010.0100一
0.925 lag/ml0.1280.0130.5500.7230. 230.010.012+
1.85pg/ml0.0260.0220.670.4160.030.040.035+
3.7ng/ml0.0250扁0.5230.5220.040.050.05+
7.4ng/ml0.0320.0330.6170.5540.050.060.055+
14地/ml0.0540.0560.7290扁0.070.080.075+ 本實用新型所述的試紙可以配合小型儀器可進行半定量檢測，不需專業(yè)培訓，結 果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢 測，適合流行病學調(diào)查，并對蓖麻毒素的感染診斷起到輔助作用。
權利要求一種檢測試紙，其特征在于，它包含(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有重組蓖麻毒素A鏈抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶質(zhì)控條帶；(4)金標抗體保護膜，該膜中含有膠體金標記的重組蓖麻毒素A鏈抗體；(5)樣品墊；所述反應支持物位于底層，所述硝酸纖維膜位于反應支持物上的中部，所述金標抗體保護膜位于所述硝酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，所述吸水墊位于所述硝酸纖維膜上部的相對于所述金標抗體保護膜而言的另一側并與所述硝酸纖維膜部分重疊；所述樣品墊位于所述硝酸纖維膜上與所述吸水墊相反的一側并與所述金標抗體保護膜部分重疊。
2. 根據(jù)權利要求1所述的試紙，其特征在于，所述樣品墊的材料選自聚酯膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
3. 根據(jù)權利要求l所述的試紙，其特征在于，所述吸水墊選用濾紙；所述反應支持物選 用PVC板；所述金標抗體保護膜的材料選自聚酯膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有 膠體金標記的抗體。
4. 根據(jù)權利要求3所述的試紙，其特征在于，所述金標抗體保護膜由將膠體金標記的 鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體均勻涂布在聚酯膜、玻璃纖維膜或濾紙纖維膜上來制 成。
5. 根據(jù)權利要求l-4任一項所述的試紙，其特征在于，硝酸纖維膜的T處是兔抗重組蓖 麻毒素A鏈多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗鼠IgG包被的質(zhì)控條帶；金標抗體 保護膜含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈多克隆抗體。
6. 根據(jù)權利要求5所述的試紙，其特征在于，硝酸纖維膜所述吸水墊一側為起始端，樣 品墊一側為末端，所述檢測抗體的條帶位于接近末端，所述質(zhì)控條帶接近于起始端。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測試紙，該試紙包含(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組蓖麻毒素A鏈抗體和質(zhì)控抗體的檢測條帶質(zhì)控條帶；(4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的鼠抗重組蓖麻毒素A鏈抗體。本實用新型試紙可以配合小型儀器可進行半定量檢測，不需專業(yè)培訓，結果清晰易辨并能客觀保存數(shù)據(jù)，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的現(xiàn)場檢測，適合流行病學調(diào)查，并對蓖麻毒素的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/532GK201522493SQ200920108450
公開日2010年7月7日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權日2009年6月5日
發(fā)明者孫肖紅, 張曉龍, 楊宇, 王景林, 王靜, 聶聰, 胡孔新, 高姍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院