專利名稱：快速診斷瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試劑盒及其制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及疾病檢測領域，尤其涉及瘧疾檢測試條及其制作方法
背景技術：
瘧疾是一種嚴重危害人類健康的疾病，它通過在黃昏到拂曉間活動的按蚊叮咬人 血而傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，瘧疾是世界上10種最為普遍而又致命的疾病之一， 威脅著101個國家和地區(qū)共24億人口(占全球人口 40% )。每年發(fā)生瘧疾的臨床案例在 3 5億之間，死亡2 2. 7百萬人。我國，據(jù)2004年疫情報告，全國23省(市、區(qū))1005 縣都有瘧疾病例數(shù)報告(未包括在臺灣省、香港和澳門)。瘧疾發(fā)病38972例，平均發(fā)病率 為0. 38/萬；死亡31人。云南、海南兩省仍是我國瘧疾流行最嚴重的地區(qū)和惡性瘧病灶區(qū)。 中部安徽、湖北、河南和江蘇四省瘧疾疫情近年來一直處于不穩(wěn)定狀態(tài)，疫情回升和局部爆 發(fā)較為突出。瘧疾診斷是瘧疾防治工作中的重要環(huán)節(jié)。世界衛(wèi)生組織以光學顯微鏡檢測吉氏染 色的厚、薄血膜作為瘧疾診斷方法的“金標準”，但這種方法耗時、費力，需要較高的專業(yè)技 術經(jīng)驗，容易造成誤診與漏診。近年來，隨著診斷技術不斷創(chuàng)新，國內、外學者相繼發(fā)展了血 液棕黃定量分析法(QBC技術)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，DNA探針技術和聚合酶鏈式反應 (PCR)等方法用于診斷瘧疾。這些方法在現(xiàn)場使用時均有一定的局限性，需要較高的操作技 術和復雜的設備儀器，同時也和傳統(tǒng)方法一樣不適合大規(guī)模的現(xiàn)場應用，所以在疾控工作 中的實用價值有限。利用免疫層析技術發(fā)展起來的免疫層析試條(Immunochromatographic trips ； ICT，又簡稱Dipstick)，優(yōu)點是操作極其簡便，判斷標準明確，不依賴專門儀器設備；可用 末梢血(如手指血、耳垂血)作為樣品；費時僅須5 15分鐘，可以現(xiàn)場得到檢測結果；試 劑穩(wěn)定性好，保存條件要求低；操作人員不需要特殊的專業(yè)知識和技術培訓。因此適合在基 層的疾控工作和條件差的衛(wèi)生單位應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一組用于免疫學方法檢測瘧疾及其病原體種屬的試劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種快速檢測瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試條。本發(fā)明的另一目的是提供一種快速檢測瘧疾及其病原體種屬的試劑盒。本發(fā)明的再一目的是提供一種快速檢測瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試條的 制備方法。本發(fā)明的第一方面，提供一組用于免疫學方法檢測瘧疾及其病原體種屬的試劑， 包括一株可以特異性結合惡性瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細 胞株M8B5B7產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3105 ；和/或另一株抗原表位不同的特異性結合惡性瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞株M8G4C9產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3106 ；和/或一株特異性結合惡性瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞株 M10A3B8 產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3107。本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于快速檢測瘧疾及其病原體種屬的免疫層析測 試條，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標記抗體的金標墊、與所述金標墊 緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠離 金標墊的一端設置質控線，在質控線和金標墊之間的纖維素膜上設置兩條相互分離的檢測 線.
一入 ，其中所述的兩條檢測線由分別針對惡性瘧、間日瘧乳酸脫氫酶的特異性抗體組 成；所述的膠體金標記抗體由特異性結合惡性瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的雙結合抗體組成； 所述的質控線由特異性結合膠體金標記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白(SPG)或金黃色葡萄球 菌A蛋白(SPA)組成。在一個優(yōu)選的方案中，所述的兩條檢測線，一條檢測線由特異性結合惡性瘧乳酸 脫氫酶的單克隆抗體M10A3B8組成，另一條檢測線由特異性結合惡性瘧和間日瘧的雙結 合單克隆抗體M8B5B7組成；所述的膠體金標記抗體由另一株抗原表位不同的特異性結合 惡性瘧和間日瘧雙結合單克隆抗體M8G4C9組成；所述的質控線由特異性結合膠體金標記 抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。在一個優(yōu)選的方案中，所述檢測線的抗瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性抗體的包被量為 0. 1 4μ g/cm ；所述質控線的特異性結合膠體金標記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色 葡萄球菌A蛋白的包被量為0. 1 4 μ g/cm。所述支持檢測線和質控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素膜 或混合膜；所屬支持膠體金標記抗體的金標墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊和吸水 墊由吸水材料制備，如吸水紙。所述纖維素膜寬度為25 40mm ；所述金標墊的寬度為5 IOmm ；所述吸水墊和樣 品墊寬度為20 40mm，厚度為0. 1 0. 2mm。所述免疫層析試條背面可設置一個起支撐作用的背板，背板材料的選擇是多種多 樣的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。本發(fā)明的第三方面，提供一種快速檢測瘧疾 及其病原體種屬的試劑盒，包括本發(fā)明第三方面所述的免疫層析測試條，用于采血的采血 針和毛細滴管，用于處理血樣的溶胞液和樣品杯；所述采血針為常規(guī)采血針；所述毛細滴管為8 12cm長，孔徑1 2mm，一端封閉， 另一端開放的PE (聚乙烯)管，該毛細滴管自開放端8 12mm處有一刻度；所述溶胞液為 含有Tween20、TritonX-IOO或皂素等表面活性劑，pH值為7. 2 8. 0的硼酸緩沖液；所述 樣品杯為內徑5 10mm，高10 15mm的PP (聚丙烯)樣品杯。在一個優(yōu)選的方案中，所述樣品杯用鏈球菌G蛋白(SPG)或金黃色葡萄球菌A蛋 白(SPA)封閉。 本發(fā)明的第四方面，提供了 一種制備上述快速檢測瘧疾及其病原體種類的免疫層 析試條的方法，包括以下步驟 (1)制備檢測線抗體溶液將特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8B5B7，特
5異性結合惡性瘧抗體M1A3B8分別用IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到1. 5mg/mL ；制備膠體金標記抗體溶液向IOOmL pH8. 5 9. 0、HAuC14含量為0. 01 %的膠體 金溶液中加入終濃度為15 30 μ g/mL的特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8G4C9， 再加入終濃度為0. 05%的PEG20000，離心棄上清，沉淀復溶到15 20mL的20mM硼酸緩沖 液中；制備質控線蛋白溶液將羊抗鼠IgG或鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白 用IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到0. 5mg/mL ；(2)將兩種檢測線抗體溶液分別噴到所述纖維素膜上形成兩條分離的檢測線，將 質控線蛋白溶液噴到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素 膜的靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測 瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試條。在一個優(yōu)選的方案中，上述纖維素膜在噴有檢測線、質控線后，在37°C下干燥 0.5 2小時，再粘貼吸水墊。在一個優(yōu)選的方案中，為使膠體金標記抗體溶液與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結 合，可向膠體金標記探針溶液中添加2% 10%的蔗糖；為使金標墊更易于纖維素膜粘貼， 可將金標墊在37°C下干燥0. 5 1小時，再與纖維素膜粘貼。本發(fā)明的免疫層析試劑盒具有以下優(yōu)點敏感性、特異性高實驗室及現(xiàn)場檢測結果Pv(間日瘧)敏感性93%，Pf (惡性 瘧)敏感性90%,總體特異性96% ；檢測方法簡單快速檢測過程中標本處理簡單，結果觀察迅速直觀，整個檢測過程 只需不到10分鐘，不需要專門的儀器和專業(yè)技術人員，適合基層使用和現(xiàn)場操作；成本低，工業(yè)化生產(chǎn)方便，穩(wěn)定性好，易于保存。


圖1為快速診斷瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試條的正面示意圖。圖2為快速診斷瘧疾及其病原體種屬的免疫層析試條的縱截面示意圖。圖3為快速診斷瘧疾及其病原體種屬的試劑盒示意圖。其中1為樣品墊2為金標墊3為纖維素膜4為吸水墊5、6為檢測線7為質控線 8為背板11位免疫檢測試條12為溶胞液13為樣品杯14為毛細滴管15為采血針16 為毛細滴管的刻度
具體實施例方式瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原寄生在人體的瘧原蟲共有4種，即間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲和卵圓形 瘧原蟲。在我國以間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲流行為主，其它兩種瘧原蟲較為少見。早期研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDH)與宿主乳酸脫氫酶在電泳特性、酶動力學特性、免疫學特性方面有很大差別。抗LDH抗體對瘧原蟲有屬的特異性，某些抗LDH抗體 與來自不同種的瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原存在一定的交叉反應，而和哺乳動物的3種LDH同 工酶(A4、B4和C4)無交叉反應。因此，檢測病人血樣中是否含有瘧原蟲的乳酸脫氫酶，可 以作為病人感染瘧原蟲的指標?？汞懺x乳酸脫氫酶單克隆抗體本發(fā)明采用文獻報道的一對引物Pl 5' ATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT 3‘P2 5' TTAAGCTAATGCCTTCATTCTCT 3‘從來自云南的惡性瘧患者全血中采用PCR方法擴增到惡性瘧原蟲LDH全長編碼基 因，通過本領域技術人員已知的基因表達技術制備惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的重組抗原，該 重組抗原用于制備針對瘧原蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體。單克隆抗體可用本領域技術人員已知的各種方法制備，例如，可利用雜交瘤技術 來制備。本發(fā)明在采用惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶重組抗原免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細 胞S/P20細胞按常規(guī)方法制備雜交瘤時，篩選到三株分泌特異性抗瘧原蟲乳酸脫氫酶的單 克隆細胞株(1)M8B5B7(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單 位地址，北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo. 3105，保藏日期 為2009年5月20日)，該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型，可以與惡性瘧 和間日瘧乳酸脫氫酶特異性結合；(2)M8G4C9(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 單位地址，北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo. 3106，保藏日 期為2009年5月20日)，該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgG2型，可以與惡性 瘧和間日瘧乳酸脫氫酶特異性結合；(3)M10A3B8(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 單位地址，北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo. 3107，保藏日 期為2009年5月20日)，該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒定為IgGl型，可以與惡性 瘧乳酸脫氫酶特異性結合。固定相抗體、流動相標記抗體的設置可以將針對瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原的特異性抗體固定在纖維素膜上作為固定相 抗體(檢測線)，用以捕獲待檢血樣中的瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原。將另一株抗原表位不同的 抗瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性抗體進行標記，作為標記的流動相抗體。在適當?shù)姆磻w系中， 當瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原存在時，該抗原可以同時與固定相抗體、標記抗體結合，形成“三 明治”形式的抗原抗體復合物，使得該抗原被固定到固定相抗體(檢測線)位置。在與標記 抗體的標記物相適應的顯色底物存在的情況下，在檢測線位置出現(xiàn)色帶，以顯示待檢抗原 的存在。本發(fā)明的固定相抗體為兩株針對惡性瘧、間日瘧乳酸脫氫酶的特異性抗體。其中 一株(M8B5B7)可以與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性結合，用以捕獲惡性瘧 原蟲和間日瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原，另一株(M10A3B8)只與惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性 結合，只能捕獲惡性瘧蟲的乳酸脫氫酶抗原。用上述兩株針對瘧原蟲乳酸脫氫酶的特異性抗體包被纖維素膜，形成兩條互相分離的檢測線。本發(fā)明的流動相標記抗體為另一株可以與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲乳酸脫氫酶 特異性結合的抗體(M8G4C9)，該抗體可以用辣根過氧化物酶、膠體金或其他的標記方法進 行標記。質控線可以將與標記抗體特異性結合的二抗或其他蛋白固定在纖維素膜上作為質控線， 例如鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白。本發(fā)明的膠體金標記抗體是鼠抗瘧原蟲乳酸 脫氫酶的單克隆抗體，相應的，質控線采用羊抗鼠IgG的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄 球菌A蛋白。無論待檢樣品中是否含有瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原，本發(fā)明的快速檢測瘧疾以 及病原體種屬的免疫層析試條中質控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測過程是 否正常和免疫層析試條是否變質的標準。免疫層析試條和試劑盒如圖1、2所示，圖1為快速診斷瘧疾的免疫層析試條的正面結構圖，圖2為快速診 斷瘧疾的免疫層析試條的縱截面結構圖?？焖僭\斷瘧疾的免疫層析試條由吸水墊4、硝酸 纖維素膜(NC膜)3、金標墊2和樣品墊1四部分粘貼在PVC底板8上組成；硝酸纖維素膜3 上設有檢測線5、6和質控線7。如圖3所示，圖3為快速診斷瘧疾試劑盒示意圖，由快速診斷瘧疾膠體金免疫層析 試條11、溶胞液12、樣品杯13、毛細滴管14 (帶有刻度16)和采血針15 (購于蘇州醫(yī)療用品 廠有限公司)、說明書共同組成快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試劑盒。檢測過程與結果判斷測定時將待檢血樣10 μ L加入60 80 μ L溶胞液處理，加在樣品墊1上，隨后再加 60 100 μ L溶胞液到樣品墊1上，溶胞液帶動樣品按樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、 吸水墊4的方向移動，流經(jīng)金標墊2時使金標墊2上的膠體金標記抗體復溶，并帶動其向硝 酸纖維素膜3、吸水墊4移動。膠體金標記抗體(本發(fā)明實施例為特異性結合惡性瘧和間日 瘧雙結合抗體M8G4C9)可與樣品中的瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原結合，形成免疫復合物。此免 疫復合物流至檢測線5 (本發(fā)明實施例為特異性結合惡性瘧抗體Μ10Α3Β8)和檢測線6 (本 發(fā)明實施例為特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體Μ8Β5Β7)時，若標本中含有惡性瘧乳 酸脫氫酶抗原，即被檢測線5和檢測線6的特異性固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的 檢測線5和6位置顯出紅色檢測線條；若標本中有間日瘧乳酸脫氫酶抗原，即被檢測線6的 特異性固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的檢測線6位置顯出紅色檢測線條。此免疫 復合物流經(jīng)質控線7時，即被質控線7的固相抗體(本發(fā)明實施例為羊抗鼠抗體)所捕獲， 在硝酸纖維素膜3上的質控線7位置顯出紅色質控線條。陽性標本既顯示檢測線，又顯示質控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質控線。如 果質控帶不顯色，不論檢測線是否顯色，均判為試條失效。以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法；所述 百分含量如無特別說明均為質量/體積百分含量或體積/體積百分含量。實施例1.瘧原蟲抗原的制備(I)PCR擴增pLDH基因引物
根據(jù) BzikDJ,FoxBA,GonyerK. Expressionof Plasmodium falciparumlactatedeh ydrogenasein Escherichiacoli [J]. MolBiochemParasitol, 199359 :155_166·設計 1 對弓I 物，用于擴增惡性瘧原蟲LDH全長編碼基因。Pl 5' ATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT 3‘P2 5' TTAAGCTAATGCCTTCATTCTCT 3‘(2)模板以采自云南惡性瘧患者肝素抗凝全血，按JohnE. Protocolsinmolecularparasit ology [M], HumanapressIncLondon, 1993 205-211.方法處理作為 PCR 擴增模板取 20 μ L 全血加200 μ L裂解液[50mmol/L NaCl，0. 015%皂素，lmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]震 蕩混勻，室溫置IOmim以充分溶解紅細胞，IOOOOXg室溫離心lOmin，再用250 μ L緩沖液 [10mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，pH8. 3，50mmol/L KC1，1. 5mmol/L MgC12，0. 01% 明膠]將沉淀物洗2次，所得沉淀物即作為PCR擴增模板。PCR 高保真聚合酶PfuPCR擴 增試劑盒(購自上海申能博彩生物技術有限公司)，按50 μ L反應體積在上述沉淀物中加 49. 5 μ LPCR 反應液(含 200 μ mo 1 /LdATP/dTTP/dGTP/dCTP, 200pmol/L 引物)，加封石蠟油 50 μ L后置沸水煮沸l(wèi)Omin，立即置已熱啟動的PCR儀進行擴增。條件為94°C變性3min， 此時加 015 μ LPfu 聚合酶(5U/ μ L)，再按 94°C 30s, 60°C 45s, 72°C Imin 的條件循環(huán) 35 次， 隨后72°C再延長IOmin。反應結束后取5 μ L反應液用瓊脂糖凝膠電泳檢查。(3) PCR產(chǎn)物的克隆、測序及重組質粒的表達和重組蛋白純化擴增的PCR產(chǎn)物按DNA純化試劑盒(上海申能博彩生物技術有限公司)說明純 化后用平端方法與經(jīng)Sma I酶切的PGEX23X表達載體DNA連接，連接物轉化大腸埃希菌 DH5a感受態(tài)細胞，在選擇平板上挑取白色菌落接種LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，收集菌體，用堿裂 解法抽提質粒并進行酶切鑒定，大小符合的重組質粒進行測序。序列符合且克隆方向正確 的重組質粒再轉化大腸埃希菌BL221細胞，轉化的細胞接種于LB液體培養(yǎng)基，28°C下用終 濃度為lmmol/L的異丙基2i3 2D2硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組質粒表達。收集細菌，用 10%膠對重組蛋白進行十二烷基磺酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。取經(jīng) SDS-PAGE鑒定證明能正確表達重組蛋白的BL21細菌按上述方法進行大量培養(yǎng)并進行誘導 表達。誘導表達結束后，3000Xg離心20min，收集細菌，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次。按 沉淀物壓積體積20倍的量加入PBS重懸菌體并超聲裂解。超聲處理后加入TritonX-IOO 至終濃度1%，置冰上攪拌lh。隨后4°C，12000Xg離心30min，取上清，按試劑盒說明用 Glu2tathioneSepharose4B柱(丹麥Amersham公司)親和純化回收表達的融合蛋白，并進 行SDS-PAGE分析和蛋白含量測定。實施例2.瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的制備免疫每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100 μ g上述純化的重組融合蛋白+福氏完全 佐劑的混懸液，以后每隔1月注射ΙΟΟμ g純化的重組融合蛋白+福氏不完全佐劑的混懸液 1次，共2次，并于殺鼠取脾進行細胞融合的前3d經(jīng)尾靜脈直接注射抗原加強免疫1次。雜交瘤細胞的產(chǎn)生與篩選SP2/0瘤細胞與免疫鼠脾細胞的融合及雜交瘤細胞的 克隆按本實驗室常規(guī)方法進行。以上述純化的重組融合蛋白和谷胱甘肽2S2轉移酶(GST) 蛋白分別包板對雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行常規(guī)ELISA檢測抗體分泌以篩選雜交瘤細胞株， 對GST和重組融合蛋白均反應的克隆其分泌的抗體視為針對GST，所以只選擇保留僅對重組融合蛋白反應的克隆。單克隆抗體(McAb)免疫球蛋白亞類鑒定經(jīng)濃縮的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液與羊抗 鼠IgG、IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3在1 %生理鹽水瓊脂板上進行免疫雙擴散以 鑒定McAb免疫球蛋白亞類。腹水生產(chǎn)與腹水效價決定每只BALB/c小鼠腹腔注射5 X 106雜交瘤細胞，1周后 隨時觀察并取腹水。以純化的重組融合蛋白包被酶標板，腹水進行倍比稀釋，第1稀釋度為 1 1000，用常規(guī)ELISA法確定腹水效價。免疫印跡實驗取培養(yǎng)純化的惡性瘧原蟲和10份云南發(fā)熱病人紅細胞經(jīng)處理后進 行SDS-PAGE電泳，而后轉移至硝酸纖維薄膜上。轉移完畢后硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶 粉的PBS溶液室溫封閉lh，用PBS含0.5% TritonX-IOO(PBS-T)洗滌3次，按1 20000 稀釋度加入單克隆抗體，4°C過夜，用PBS-T洗滌3次，加入用PBS稀釋(1 5000)的辣根 過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體室溫搖2h，同法洗滌3次，再用PBS洗滌1次，用二氨基聯(lián)苯 胺(DAB)底物系統(tǒng)(DAB50mg，PBSlOOml，30% H2O2 IOyL)顯色。制備得到特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8G4C9屬于IgG2亞類，與重組抗原反應效價1 51200，用于標記；M8B5B7屬于IgGl亞類，與重組抗原反應效價1 51200，用于包被；制備得到特異性結合惡性瘧抗體M10A3B8屬于IgGl亞類，與重組抗原反應效價1 25600，用于包被。瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的純化將含瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體的小鼠腹水，先使用正辛酸-硫酸銨沉淀法抽 提，然后再用G蛋白層析柱(美國GenScript產(chǎn)品)按產(chǎn)品說明書純化單克隆抗體。實施例3.瘧原蟲特異性抗體金探針溶液的制備用以下方法制備瘧原蟲特異性抗體標記的膠體金金探針溶液和金標抗體墊用檸 檬酸還原法制備膠體金將質量百分比濃度為0. 01%的HAuCl4(滬試牌購于上海國藥集團 化學試劑有限公司)水溶液煮沸，攪拌下加入2mL質量百分比濃度為的檸檬酸三鈉水溶 液，繼續(xù)煮沸，直到液體呈深紅色，得到膠體金溶液。確定膠體金偶聯(lián)抗體飽和度用0. IM K2CO3溶液調節(jié)PH值至8. 5，準備96孔酶標 板，在孔中用0. 05M硼酸緩沖液倍比稀釋瘧原蟲特異性抗體，做一個稀釋度梯度，分別加入 相同體積膠體金混勻，再加入相同體積的10% NaCl溶液，混勻，觀察液體顏色變化，顏色沒 有變化最低的抗體量就是最適濃度。結果確定保持穩(wěn)定的抗體濃度為15yg/mL。瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體標記的免疫膠體金探針及金標抗體墊的制備用 0. IM K2CO3溶液調節(jié)pH值至8. 5，每IOOmL膠體金溶液加入終濃度為15 μ g/mL的特異性結 合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8G4C9，攪拌1小時，再加入終濃度為0. 05% PEG20000，攪拌 1小時，IOOOOrpm離心30分鐘，棄上清，用20mM硼酸緩沖液洗滌沉淀，并將其保存于20mL 含5%蔗糖的20mM硼酸緩沖液中，得到瘧原蟲特異性抗體金探針溶液。瘧原蟲特異性抗體 金探針溶液800 μ L噴涂到玻璃纖維墊上，37°C下干燥0. 5小時。得到金標抗體墊。實施例4.快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的制備 如圖1所示，圖中A為快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的正面結構圖，圖中B為 快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的縱截面結構圖?？焖僭\斷瘧疾膠體金免疫層析試條由吸水墊4、硝酸纖維素膜(NC膜)3、金標抗體墊2和樣品墊1四部分粘貼在PVC底板8上組 成；硝酸纖維素膜3上設有檢測帶5、6和質控帶7，該試紙的制備方法包括以下步驟NC膜的包被兩種區(qū)分惡性瘧和間日瘧的瘧原蟲乳酸脫氫酶單克隆抗體特異 性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8B5B7 ；特異性結合惡性瘧抗體M10A3B8分別用IOmM PH9. 0的CBS緩沖液稀釋到1. 5mg/mL，用于包被兩條檢測帶；羊抗鼠IgG(購于捷寧生物公 司)用IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到0. 5mg/mL，用于包被一條質控帶。用BIODOT公司 XZ1000點樣機分別噴涂于300mm長、25mm寬的NC膜(購于MILLIP0RE公司)上。形成互 相分離的檢測線。37°C下干燥2小時?？焖僭\斷瘧疾膠體金免疫層析試條的制備用一塊單面涂了不干膠的PVC底板， 中間粘貼上處理好的NC膜；NC膜靠近質控線的一端緊密粘貼吸水墊(購于MILLIP0RE公 司)；NC膜靠近質控線的一端緊密粘貼金標抗體墊；金標抗體墊另一端緊密粘貼樣品墊 (購于MILLIP0RE公司)；樣品墊和吸水墊的表面粘貼畫有指示標記的貼皮；按需要切割試條，寬4mm，長8mm。得到快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條，加干燥 劑后密封保存。實施例5.快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試劑盒的制備溶胞液含有0. 25% TritonX-IOO的硼酸溶液，pH7. 5 ；樣品杯樣品杯為內徑8mm，高12mm的PP樣品杯，用100 μ g/mL的鏈球菌G蛋白 (SPG)封閉；毛細滴管長10cm，孔徑2mm的PE管，一端封閉，另一端開放，開放端8mm處設一 刻度線；如圖3所示，由快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條11 (步驟3制備)、溶胞液12、 樣品杯13、毛細滴管14和采血針15(購于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、說明書共同組成快 速診斷瘧疾膠體金免疫層析試劑盒。實施例6.快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的實驗室和現(xiàn)場檢測考核檢測方法用實施例1制備的快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條按使用說明檢測血樣使用 采血針采集末梢血(現(xiàn)場)或使用已采集的靜脈血(實驗室)。用毛細滴管吸取待測血樣 標本至刻度線(10 μ L)，放入樣品杯中。加入2滴(60 80 μ L)溶胞液，反復吹吸混合溶破 血細胞和蟲體。將快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的樣品墊一端插入樣品杯中。待杯中 的溶血吸干后，再加入2 3滴(60 100 μ L)溶胞液。5分鐘后觀察結果，10分鐘觀察終 止。結果判定如果兩條檢測帶和質控帶均出現(xiàn)紅色，即判為惡性瘧；如果一條檢測帶和質 控帶出現(xiàn)紅色條帶，即判為間日瘧；如果僅有質控帶出現(xiàn)紅色，即判為陰性；如果質控帶不 顯色，不論檢測線是否顯色，均判為試條失效。實驗結果用本發(fā)明的快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條進行實驗室和現(xiàn)場檢測考核結果 如表1所示，由表1可以看出本發(fā)明的快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條對間日瘧和惡性 瘧的敏感性可達93. 7%和89. 4%，特異性可達96%。上述檢測結果表明本發(fā)明的快速診斷 瘧疾膠體金免疫層析試劑盒可以用于瘧疾的快速檢測。表1本發(fā)明快速診斷瘧疾膠體金免疫層析試條的實驗室和現(xiàn)場考核結果
權利要求
1.一組用于免疫學方法檢測瘧疾及其病原體種屬的試劑，包括以下組分一株可以特異性結合惡性瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞 株M8B5B7產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3105 ；和/或另一株抗原表位不同的特異性結合惡性 瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞株M8G4C9產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3106 ；和/或一株特異性結合惡性瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細胞株 M10A3B8 產(chǎn)生，保藏號為CGMCC No. 3107。
2.一種檢測瘧疾及其病原體種屬的免疫層析測試條，包括以下組分樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標記抗體的金標墊、與所述金標墊緊密 連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠離金標墊 的一端設置質控線，在質控線和金標墊之間的纖維素膜上設置兩條相互分離的檢測線；其中所述的兩條檢測線由分別針對惡性瘧、間日瘧乳酸脫氫酶的特異性抗體組成；所 述的膠體金標記抗體由特異性結合惡性瘧和間日瘧乳酸脫氫酶的雙結合抗體組成；所述的 質控線由特異性結合膠體金標記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。
3.根據(jù)權利要求2的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條，其特征在于，所述 的一條檢測線由特異性結合惡性瘧乳酸脫氫酶的單克隆抗體M10A3B8組成，另一條檢測線 由特異性結合惡性瘧和間日瘧的雙結合單克隆抗體M8B5B7組成；所述的膠體金標記抗體 由抗原表位不同的特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合單克隆抗體M8G4C9組成；所述的質 控線由特異性結合膠體金標記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。
4.根據(jù)權利要求2的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條，其特征在于，所述 檢測線的抗瘧原蟲乳酸脫氫酶特異性抗體的包被量為0. 1 4μ g/cm ；所述質控線的特異 性結合膠體金標記抗體的二抗、鏈球菌G蛋白、或金黃色葡萄球菌A蛋白的包被量為0. 1 4 μ g/cm。
5.根據(jù)權利要求2的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條，其特征在于，所述 支持檢測線和質控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜或混合膜；所述支持膠 體金標記抗體的金標墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊和吸水墊由吸水材料制備。
6.根據(jù)權利要求2的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條，其特征在于，所述 纖維素膜寬度為25 40mm ；所述金標墊的寬度為5 IOmm ；所述吸水墊和樣品墊寬度為 20 40mm，厚度為 0. 1 0. 2mm。
7.根據(jù)權利要求2的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條，其特征在于，所述 免疫層析試條背面可設置一個起支撐作用的背板，背板材料是聚氯乙烯塑料。
8.一種包含權利要求2-7的任一項的檢測瘧疾以及病原體種屬的免疫層析測試條的 試劑盒，其特征在于，還包括用于采血的采血針和毛細滴管，用于處理血樣的溶胞液和樣品 杯；所述采血針為常規(guī)的采血針；所述毛細滴管為8 12cm長，孔徑1 2mm，一端封閉， 另一端開放的PE管，該毛細滴管自開放端8 12mm處有一刻度線；所述溶胞液為含有 Tween20, TritonX-IOO或皂素等表面活性劑，pH值為7. 2 8. 0的硼酸緩沖液；所述樣品 杯為內徑5 10mm，高10 15mm的PP樣品杯。
9.根據(jù)權利要求8的試劑盒，其特征在于，所述樣品杯用鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球 菌A蛋白封閉。
10.一種檢測瘧疾以及病原體種類的免疫層析試條的制備方法方法，包括以下步驟(1)制備檢測線抗體溶液將特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8B5B7和特異性 結合惡性瘧抗體M10A3B8分別用IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到1. 5mg/mL ；制備膠體金標記抗體溶液向100mLpH8. 5 9. (KHAuCl4含量為0. 01%膠體金溶液中 加入終濃度為15 30 μ g/mL的特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8G4C9，再加入終 濃度為0. 05%的PEG20000，離心棄上清，沉淀復溶到15 20mL濃度為20mM硼酸緩沖液 中；制備質控線蛋白溶液將羊抗鼠IgG或鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白用 IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到0. 5mg/mL ；(2)將兩種檢測線抗體溶液分別噴到所述纖維素膜上形成兩條分離的檢測線，將質控 線蛋白溶液噴到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測瘧疾 以及病原體的免疫層析試條。
11.根據(jù)權利要求10的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備檢測線抗體溶液將特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8B5B7和特異性 結合惡性瘧抗體M10A3B8分別用IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到1. 5mg/mL ；制備膠體金標記抗體溶液向100mLpH8. 5 9. (KHAuCl4含量為0. 01%膠體金溶液中 加入終濃度為15 30 μ g/mL的特異性結合惡性瘧和間日瘧雙結合抗體M8G4C9，再加入終 濃度為0. 05%的PEG20000，離心棄上清，沉淀復溶到15 20mL、含有終濃度為2% 10% 的蔗糖的20mM硼酸緩沖液中；制備質控線蛋白溶液將羊抗鼠IgG或鏈球菌G蛋白或或金黃色葡萄球菌A蛋白用 IOmM pH9. 0的CBS緩沖液稀釋到0. 5mg/mL ；(2)將兩種檢測線抗體溶液分別噴到所述纖維素膜上形成兩條分離的檢測線，將質控 線蛋白溶液噴到所述纖維素膜的另一區(qū)域形成質控線，將噴涂有檢測線、質控線的纖維素 膜在37°C下干燥0. 5 2小時；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊，將金標墊在37°C下干 燥0. 5 1小時；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測瘧疾 以及病原體的免疫層析試條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速診斷瘧疾及其病原體的免疫層析試劑盒及其制作方法。該試劑盒包括膠體金免疫層析試條和配套溶胞液、樣品杯、采血針和使用說明書。其中膠體金免疫層析試條由樣品墊、金標墊、纖維素膜和吸水墊組成，其中金標墊上含有膠體金標記抗體，纖維素膜上設有檢測線、質控線，所述膠體金標抗記體、檢測線由特異性結合瘧原蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體組成。本發(fā)明的快速診斷瘧疾及其病原體的免疫層析試劑盒可以區(qū)分惡性瘧和間日瘧，具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優(yōu)點，適于臨床和現(xiàn)場使用。
文檔編號G01N33/577GK102103141SQ200910201449
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權日2009年12月18日
發(fā)明者包意芳, 楊玥濤, 湯林華, 汪俊云, 石鋒, 高春花 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所