專利名稱：：用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙及其制備方法。背景4支術獸藥倍他米松(Betamethasone)是一種糖皮質激素類藥物，具有很好的抗炎作用，能對抗各種原因如物理、化學、生理、免疫等所引起的炎癥，但糖皮質激素除了治療作用外，還可以提高伺料轉化率，從而增加動物體重，而且和|3興奮劑及其他類固醇類激素有協(xié)同作用。而把糖皮質激素作為促生長劑等不合理使用，或作為獸藥使用時不注意休藥期等可能會最終導致動物源性食品中糖皮質激素的殘留，構成了對人類健康的潛在危害。糖皮質激素倍他米松殘留常規(guī)分析方法主要是液相色譜法等儀器方法，這種傳統(tǒng)的分析方法不僅需要昂貴的氣相色謙儀，分析速度慢、成本高，不適合對大量的樣品進行快速篩選和在基層推廣應用。而且樣品前處理程序比較復雜，需要使用大量的有機溶劑，造成了二次污染。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的獸藥殘留分析手段難以適應要求。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的.目的在于提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單，并能用于大批量樣品快速檢測的倍他米松殘留的膠體金試紙。本發(fā)明的另一目的是提供上述膠體金試紙的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，具體為1)利用活性酯法將倍他米松與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)后制備人工免疫原，用該免疫原制備出倍他米松多克隆抗體；2)用混合酸酐法將倍他米松與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，將其復合物作為包被抗原，并將該包被抗原固定于醋酸纖維膜(NC)作為檢測線(T線)；3)將倍他米松多克隆抗體固定于步驟2)中處理后的醋酸纖維膜(NC)上，作為控制線線(C線)；4)用檸檬酸鈉改良法制備膠體金，同時用其標記步驟1)中制備的倍他米松多克隆抗體，并固定于膠體金墊上；5)將膠體金墊壓裝在步驟3)中處理好的醋酸纖維膜(NC)上，并粘好吸水材料和玻璃纖維紙，即制成膠體金試紙。進一步，所述倍他米松多克隆抗體由步驟1)中所述免疫原免疫新西蘭大白兔制成。進一步，所述步驟l)中制備出倍他米松多克隆抗體的方法，具體為將倍他米松-BSA偶聯(lián)物作為免疫原，按設定要求對大白兔進行多次免疫注射，完成后，釆血分離血清，先用飽和碌L酸銨法粗提兔抗血清，再用蛋白A-瓊脂糖親和層析法進一步純化，獲得較純的倍他米松多克隆抗體。進一步，所述步驟4)中檸檬酸鈉改良法制備膠體金，具體為采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，用新制去離子水配制0.01%濃度的氯金酸，置于錐形瓶內(nèi)，加熱至煮沸，準確吸取1%濃度的檸檬酸三鈉，迅速加入錐形瓶中，搖晃均勻后，繼續(xù)煮沸，直至其顏色變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)加熱設定時間，停止加熱，自然冷卻至室溫后用去離子水恢復至原體積，即得到膠體金。進一步，所述步驟4)中倍他米松多克隆抗體的膠體金標記，具體為調整至最適pH8.5的膠體金，加0.2mg/ml濃度的兔抗倍他米松抗體，在磁力攪拌器上避光溫和攪拌反應lh，加10%濃度的OVA，封閉30min后，4。Cxl500rpmxl5min離心，去游離的月交體金；4。Cxl2000rpmx20min離心留沉淀，去上清，用月交體金重懸液重懸，室溫反應10min;4。Cxl2000rpmx20min再離心留沉淀，去上清，用月交體金重懸液重懸；再于4°Cx1OOOrpmxlOmin離心，去沉淀，上清即為所述標記后的倍他米+>多克隆抗體。一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙，包括試紙條、海綿支架和支架，其中試紙條上吸附有包被抗原和膠體金標記的倍他米松多克隆抗體。進一步，所述試紙條包括專用的塑料板，塑料板的上表面自上而下依次粘貼吸水紙、醋酸纖維素膜、膠體金吸附玻璃纖維膜，樣品墊玻璃纖維膜。進一步，所述醋酸纖維膜(NC)上有包被倍他米松和卵清蛋白(0VA)的偶聯(lián)復合物及羊抗兔抗體；膠體金吸附玻璃纖維膜上吸附有膠體金標記的兔抗倍他米松多克隆抗體。進一步，所述支架內(nèi)包含有濃縮樣品提取液，該濃縮樣品提取液由Na2HPO,2H20、NaH2P04'2H20、吐溫-20、曱醇、蒸餾水配制而成。本發(fā)明克服了倍他米松理化分析方法操作復雜、檢測成本高、速度慢和環(huán)境二次污染等缺點，能準確靈敏地檢測水、肉制品及奶制品中倍他米松殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時快速檢測大量的樣品。圖1為試紙條主視圖2為試紙條俯視圖3為膠體金溶液的紫外可見光語；圖4為膠體金透射電鏡圖5為膠體金-倍他米松抗體結合物透射電鏡圖6為膠體金-倍他米松抗體結合物紫外可見光語；圖7為試紙條判讀示意圖8為靈敏度的測定(250~0ng/mL);圖9為交叉反應的測定；圖IO為試紙條穩(wěn)定性試驗；圖11為樣品檢測。具體實施例方式(l)試紙條的使用將盒內(nèi)樣品提取液稀釋至5ml備用。取測定樣品l.Og，加入2ml提取液研磨提取，取上清液50jil與上樣緩沖液混合后滴加至樣品墊上，室溫;改置10min后進行判讀。(2)如為陰性，則樣品中倍他米松含量<8ng/mL,否則〉8ng/mL1、倍他米松與載體蛋白偶聯(lián)采用混合酸酐法，在D環(huán)側鏈，分子的C21位上"OH，琥珀?；罨晁崮┒寺然?，與BSA或OVA分子中-NH2相連，合成倍他米+>免疫原和包被原。配制原藥濃度為50ing/mL的20。/。乙醇溶液，通過紫外掃描可知最大吸收波長。配制200pg/mL牛血清蛋白的水溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物用去離子水稀釋到約200iLig/mL，在240nm處測吸光值，以去離子水為空白，測出吸光值。將Bet，Bet-BSA，BSA的質量濃度根據(jù)其相對分子質量轉換為摩爾濃度，然后根據(jù)公式(1)算出各自的摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)￡=|(1)其中,A為吸光度，C為摩爾濃度。再根據(jù)公式(2)估算交聯(lián)率Mdex:Mbas=(￡dex-bsa-Gbas)/e藍(2)2、倍他米松多克隆抗體制備將倍他米松-BSA偶聯(lián)物作為免疫原，按體重500(xg/kg的劑量免疫注射4次，第一次用含1.5ml弗氏完全佐劑的免疫原，皮內(nèi)或皮下多點注射，此后每間隔4周用含1.5ml弗氏不完全佐劑的抗原加強免疫1次，每次加強前采血，測定抗血清效價。最后1次免疫后10d樸殺，采血分離血清，測定抗體效價，選擇效價高，特異性強的血清，先用飽和硫酸銨法粗提兔抗血清，再用蛋白A-瓊脂糖親和層析法進一步純化，獲得較純的倍他米松多克lf抗體，加等量甘油-2(TC冷藏備用。3、膠體金制備檸檬酸鈉改良法制備膠體金采用檸檬酸鈉還原法制備直徑約25nm的膠體金。用新制去離子水配制100ml0.01。/。氯金酸，置于錐形瓶內(nèi)，電爐加熱至煮沸。準確吸取1.5ml的1%檸檬酸三鈉，迅速加入錐形瓶中，搖晃均勻后，立即方欠入電爐中繼續(xù)煮沸7min左右，觀察到加入液體后顏色先變成黑，隨后慢慢變成酒紅色?？吹骄萍t色后繼續(xù)加熱3-5min后停止加熱。自然冷卻至室溫后用去離子水恢復至原體積，得到的即為直徑為25nm的膠體金，無菌密封4i:保存。在透射電鏡下觀察制備的膠體金顆粒大小是否均勻一致，有無橢圓形、三角形和多角形，并根據(jù)電鏡標尺測量膠體金顆粒。其中圖3顯示了膠體金溶液的紫外可見光語，圖4顯示了膠體金透射電^:圖。4、倍他米松抗體的膠體金標記調整至最適pH8.5的膠體金4ml置于10ml小燒中，加0.2mg/ml的兔抗倍他米松抗體50pl，磁力攪拌器上避光溫和攪拌反應lh,加10%OVA400|ul，封閉30min后，4。Cxl500rpmxl5min離心，去游離金；4。Cxl2000rpmx20min離心留沉淀，去上清，用4ml膠體金重懸液重懸，室溫反應10min;4。Cxl2000rpmx20min再離心留沉淀，去上清，用lml膠體金重懸液重懸；再于4"Cxl000rpmxl0min離心，去沉淀，上清即為膠體金探針，4。C避光保存。其中圖5顯示了膠體金-倍他米+>抗體結合物透射電鏡圖，圖6顯示了膠體金-倍他米松抗體結合物紫外可見光譜。5、膠體金試紙條組裝(1)將適量的包被抗原和羊抗兔抗體包被于NC膜(4mmx3cm)上。(2)適量的金標倍他米松抗體固定于玻璃纖維(4mmxlcm)上。(3)取制作試紙條專用的PVC板，先撕掉粘貼硝酸纖維素膜部位的紙條，裁糾目應長度的硝酸纖維素膜粘貼在PVC板上，然后取吸附好金標抗體的玻璃纖維貼于相應部位，要壓住硝酸纖維素膜，再粘好吸水材料和沒有吸附金標抗體的玻璃纖維紙。其結構如圖1、圖2所示。6、試紙條檢測靈敏度將倍他米松濃度為l昭/ml的標準溶液，用0.01mol/LPBS稀釋10個系列濃度，與樣品處理液等體積混合后，終濃度為250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.9ng/ml、0.95ng/ml、0.48ng/ml,以PBS與樣品處理液等體積混合為陰性對照，點樣后，10min內(nèi)判定出線結果。檢測與判定；如圖7、圖ll所示，將待測倍他米松樣品提取液滴加于樣品墊上，室溫放置10min后，觀察。如T線顯色則為陰性(即樣品中倍他米松含量少于控制量)，反之為陽性，即T線不顯色(樣品中倍他米松含量高于控制量)。結果由表1可知，試紙條檢測含量在8.0ng/mL以上的倍他米松標準液時，結果都為陽性，未見樣本試紙條T線，陰性可見明顯T線。因此，試紙條的檢測靈敏度確定為8.0ng/mL。如圖8所示。表l靈敏度的測定(250-0ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"+，，"-，，分別表示陽性和陰性7、特異性測試(或交叉反應物測試)將倍他米松、地塞米松、雙氟米+>和卡那霉素標準品溶液稀釋至15.6ng/ml,進行交叉反應試驗。按試紙檢測方法實驗。結果見表2、圖9。表2試紙條交叉反應試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"+""—"分別表示陽性和陰性。用試紙條分別對15.6ng/ml倍他米松、地塞米松、雙氟米松和卡那霉素標準溶液進行測試。結果表明倍他米松類似物、卡那霉素檢測均為陰性，試紙條對倍他米松檢測結果為陽性，說明該試紙條具有較高的特異性，只適用于樣本中倍他米松檢測。8、試紙條穩(wěn)定性測試將月交體金免疫層析試紙條于37。C存放，并在第3d、4d、5d、6d、7d，取出用倍他米松標準溶液(8ng/ml)檢測，每處理重復3次，并與同樣的PBS溶液做為樣品空白對照，觀察穩(wěn)定性測試結果(檢測線和質控線的有無、條帶的清晰度以及玻璃纖維釋放金標記抗體的程度)。取在37。C放置的倍他米松膠體金檢測試紙條進行檢測，第7d的檢測結果如圖10所示，從圖中可以看出倍他米松試紙條的穩(wěn)定性很好，在37°C放置7d后仍能特異性的檢出倍他米松，而且也敏感性沒有下降。本發(fā)明的優(yōu)點是能準確靈敏地檢測水、肉制品及奶制品中倍他米松殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時快速檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。試劑條的保存期至少6個月。檢測過程中，樣品中的倍他米松和金標倍他米松抗體(定量)的特異性反應，通過剩余金標倍他米松抗體于試紙條醋酸纖維膜上預包#:倍他米+>包被抗原(檢測線，T線)的特異性，并結合反應確定樣品中倍他米松含量，其顯色為陰性，即不超過控制量；反之則超過控制量。試紙條醋酸纖維膜上預包被的羊抗兔抗體作為質量控制線(C線)，其顯色為試紙條有效，反之失效。權利要求1、一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，具體為1)利用活性酯法將倍他米松與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)后制備人工免疫原，用該免疫原制備出倍他米松多克隆抗體；2)用混合酸酐法將倍他米松與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，將其復合物作為包被抗原，并將該包被抗原固定于醋酸纖維膜(NC)作為檢測線(T線)；3)將倍他米松多克隆抗體固定于步驟2)中處理后的醋酸纖維膜(NC)上，作為控制線線(C線)；4)用檸檬酸鈉改良法制備膠體金，同時用其標記步驟1)中制備的倍他米松多克隆抗體，并固定于膠體金墊上；5)將膠體金墊壓裝在步驟3)中處理好的醋酸纖維膜(NC)上，并粘好吸水材料和玻璃纖維紙，即制成膠體金試紙。2、如權利要求1所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，其特征在于，所述倍他米松多克隆抗體由步驟l)中所述免疫原免疫新西蘭大白兔制成。3、如權利要求1所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟l)中制備出倍他米松多克隆抗體的方法，具體為將倍他米松-BSA偶聯(lián)物作為免疫原，按設定要求對大白兔進行多次免疫注射，完成后，采血分離血清，先用飽和碌^酸銨法粗提兔抗血清，再用蛋白A-瓊脂糖親和層析法進一步純化，獲得較純的倍他米松多克隆抗體。4、如權利要求1所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，.其特征在于，所述步驟4)中檸檬酸鈉改良法制備膠體金，具體為采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，用新制去離子水配制0.01。/o濃度的氯金酸，置于錐形瓶內(nèi)，加熱至煮沸，準確吸取1%濃度的檸檬酸三鈉，迅速加入錐形瓶中，搖晃均勻后，繼續(xù)煮沸，直至其顏色變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)加熱設定時間，停止加熱，自然冷卻至室溫后用去離子水恢復至原體積，即得到膠體金。5、如權利要求4所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中倍他米松多克隆抗體的膠體金標記，具體為調整至最適pH8.5的膠體金，加0.2mg/ml濃度的兔抗倍他米松抗體，在磁力攪拌器上避光溫和攪拌反應lh，加10%濃度的OVA，封閉30min后，4'Cxl500rpmxl5min離心，去游離的膠體金；4。Cxl2000rpmx20min離心留沉淀，去上清，用膠體金重懸液重懸，室溫反應10min;4。Cxl2000rpmx20min再離心留沉淀，去上清，用月交體金重懸液重懸；再于4"Cxl000rpmxl0min離心，去沉淀，上清即為所述標記后的倍他米+>多克隆抗體。6、一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙，其特征在于，該試紙包括試紙條、海綿支架和支架，其中試紙條上吸附有包被抗原和膠體金標記的倍他米松多克隆抗體。7、如權利要求6所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙，其特征在于，所述試紙條包括專用的塑料板，塑料板的上表面自上而下依次粘貼吸水紙、醋酸纖維素膜、"交體金吸附玻璃纖維膜，樣品墊玻璃纖維膜。8、如權利要求7所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙，其特征在于，所述醋酸纖維膜(NC)上有包被倍他米松和卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)復合物及羊抗兔抗體;膠體金吸附玻璃纖維膜上吸附有膠體金標記的兔抗倍他米松多克隆抗體。9、如權利要求6所述的用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙，其特征在于，所述支架內(nèi)包含有濃縮樣品提取液，該濃縮樣品提取液由Na2HP04.2H20、NaH2P04'2H20、吐溫-20、曱醇、蒸餾水配制而成。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于倍他米松殘留快速檢測膠體金試紙及其制備方法，該試紙包括盒體、試紙條、海綿支架和支架，其中試紙條上吸附有包被抗原和膠體金標記的倍他米松多克隆抗體。本發(fā)明克服了倍他米松理化分析方法操作復雜、檢測成本高、速度慢和環(huán)境二次污染等缺點，能準確靈敏地檢測水、肉制品及奶制品中倍他米松殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時快速檢測大量的樣品。文檔編號G01N33/544GK101609094SQ20091015809公開日2009年12月23日申請日期2009年7月20日優(yōu)先權日2009年7月20日發(fā)明者儲曉剛,云凌,孫艷秋,曹遠銀,菡王,煒雍申請人:中國檢驗檢疫科學研究院