專(zhuān)利名稱(chēng)：用于熒光定量pcr法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑
i^r 。
背景技術(shù)：
在正常人類(lèi)腸道中存在一個(gè)豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法己經(jīng)對(duì)人 類(lèi)腸道真菌進(jìn)行了許多研究(Khatib R， Riederer KM， Ramanathan J， et aL Faecal fungal flora in healthy volunteers肌d inpatients. Mycoses, 2001， 44:151-6.)， 該 方法通過(guò)對(duì)真菌表型進(jìn)行診斷，觀(guān)察固體培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)和繁殖情況，根據(jù)菌落形狀、 大小、顏色、粘性以及其他結(jié)構(gòu)特征鑒定真菌，結(jié)合不同的生理、生化和耐熱性試驗(yàn)等進(jìn)行 形態(tài)學(xué)診斷。運(yùn)用分離培養(yǎng)法可以準(zhǔn)確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況下， 比如分離培養(yǎng)的菌落形態(tài)不典型、特殊培養(yǎng)基無(wú)法獲取、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、表型結(jié)果非特異等 等，則無(wú)法對(duì)真菌病原體進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，需要依靠非培養(yǎng)診斷技術(shù)進(jìn)行真菌鑒定。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的各個(gè)領(lǐng)域(Espy MJ， Uhl JR, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol, 2006， Rev 19(1): 165-256.)。該技術(shù)不僅能夠從本質(zhì)上增加 病原體檢測(cè)的靈敏度，結(jié)合種特異性引物和擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線(xiàn)分析可以特異的檢測(cè)和鑒定某 種病原體，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需分離培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)便、快速，極大的縮短了診斷時(shí)間；并且可以作 為病原體感染患者治療療效的監(jiān)測(cè)手段。但是，由于人類(lèi)腸道微生態(tài)群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大約 IO"個(gè)不同的微生物有機(jī)體，而真菌所占比例較低，不到1%;某些真菌菌種的生長(zhǎng)還需要復(fù) 雜的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)法只能檢測(cè)到一小部分條件適合的微生物，檢測(cè)靈敏度低且診斷周 期長(zhǎng)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是基于對(duì)病原體核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制且檢測(cè)靈 敏度高，有利于更加準(zhǔn)確、全面的了解真菌群落在腸道病理生理過(guò)程中的作用。利用實(shí)時(shí)熒 光定量PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)和鑒定真菌病原體，這對(duì)于及時(shí)治療和有效控制腸道 真菌感染都至關(guān)重要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔 念珠菌的試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑盒，該試劑盒包括-
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各O. 15 umol/L l umol/L的上游和下游引物；
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0 mmol/L 3. 5廳1/L的MgCl2;
0.05U/U1 HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備的要求系列稀釋?zhuān)?余量為無(wú)菌雙蒸水；
所述兩條引物為PCR擴(kuò)增過(guò)程中使用的特異性擴(kuò)增克柔念珠菌ITS區(qū)的引物，其中 上游引物序列為:5， - AAAAGTCTAGTACGCTCGG-3， (SEQ ID NO: 1); 下游引物序列為5' - GCATCCATGAAGAACGCAGC-3， (SEQ ID NO: 2); 所述標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版為克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA;編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核 苷酸序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
操作簡(jiǎn)便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對(duì)核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制；定 量檢測(cè)，能真實(shí)反映腸道克柔念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢 測(cè)。本發(fā)明提供的試劑盒可對(duì)腸道克柔念珠菌進(jìn)行快速定量檢測(cè)，可以替代一直沿用的分離 培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣應(yīng)用。


圖1為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的動(dòng)力曲 線(xiàn)圖，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度，圖中平行于橫坐標(biāo)的直線(xiàn)代表熒光閾 值。圖2為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)圖，橫坐標(biāo)代表熒光閾值，縱坐標(biāo)代表不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版的濃度。
圖3為具體實(shí)施例中所述熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線(xiàn)圖，橫坐標(biāo)代表融解溫度， 縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。
本發(fā)明所述的用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑盒包括引物、Taqinan PCR buffer、 dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版和無(wú)菌雙蒸 水。其中-
(1) 引物是特異性擴(kuò)增克柔念珠菌ITS區(qū)的引物； 上游引物序列為5' - AAMGTCTAGTACGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列為5， - GCATCCATGAAGAACGCAGC-3， (SEQ ID NO: 2)
(2) 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版
克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接即為標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性模版；編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；擴(kuò)增產(chǎn)物與 pGEMT-T Easy載體連接后可在大腸桿菌DH5 a中增殖。儲(chǔ)存濃度為1(T拷貝/ul，使用前進(jìn)行 系列稀釋。
該試劑盒保存于-2(TC,盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明中所述克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自生物梅里埃公司生產(chǎn)的克柔念珠菌ATCC 6258菌 株，pGEMT-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，PCR用Buffer、 MgCl2、 d證s、 HOTSTART Taq DNA聚合酶、SYBR greenl熒光染料購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司。
具體實(shí)施例1:
本實(shí)施例中的試劑盒包括
反應(yīng)總體積1/10的lOXTaqtnan PCR buffer;
各O. 15 umol/L的上游和下游引物；
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0 ,1/L的MgCl2;
0. 05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶；0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備的要求系列稀釋; 余量為無(wú)菌雙蒸水。"
具體實(shí)施例2: 試劑盒成份如下
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各1.0 umol/L的上游和下游引物；
各200ymol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 5咖ol/L的MgCl2;
0.05U/wl HOTSTART T叫DNA聚合酶;
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備的要求系列稀釋; 余量為無(wú)菌雙蒸水。
具體實(shí)施例3:
試劑盒成份如下-
反應(yīng)總體積1/10的lOXTaqman PCR buffer;
各0. 5 U mol/L的上游和下游引物；
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 0睡1/L的MgCl2;
0. 05U/iil HOTSTART Taq DNA聚合酶;
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備的要求系列稀釋; 余量為無(wú)菌雙蒸水。
本發(fā)明試劑盒的工作原理介紹
在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈 后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信 號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。反應(yīng)包括以下幾個(gè)步驟(1) PCR變性過(guò)程產(chǎn)生單鏈 DNA, SYBR熒光染料呈游離狀態(tài)，熒光信號(hào)很低；(2)引物退火過(guò)程中，雙鏈DNA部分形成，SY服熒光染料同時(shí)特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，熒光信號(hào)增加；(3)PCR延伸過(guò)程中，雙鏈 DNA逐漸形成，SYBR熒光染料不斷摻入DNA雙鏈中，熒光信號(hào)不斷增加；(4)最后延伸階段 結(jié)束后，所有DNA形成雙鏈，摻入DNA雙鏈中的熒光染料達(dá)到最大值，熒光信號(hào)也達(dá)到最大 值。
本發(fā)明所述試劑盒使用方法舉例
(1) 反應(yīng)體系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別 為200ymol/L，上游和下游引物的濃度為0. 5 y mol/L， MgCl2的濃度為3. 0咖ol/L， 0.02XSYBR green I熒光染料，2UH0TSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA2pl，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ) 足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s， 6(TC退火30s， 72。C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。
(3) 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋(如109， 108， 107， 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個(gè)濃度重復(fù) 三次進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和C(T)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=aX + b, R2。
(4) 樣品檢測(cè)取受試者新鮮尾便200mg，按照常規(guī)方法提取DNA,取2ul DNA作為模 版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。
(5) 結(jié)果計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和所得的C(T)值計(jì)算起始模版拷貝數(shù)。
本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)例介紹
取40例健康志愿者新鮮尾便，采用沙保氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和本發(fā)明所述熒光定量PCR檢 測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。 1.模版DAN的制備
(1) 試劑采用QIAamp DNA stool mini kit結(jié)合玻璃珠擊打法抽提受試者糞便標(biāo)本 DNA， QIAamp⑧DNA stool mini kit試劑盒購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，玻璃珠購(gòu)自 上海生物工程公司。
(2) 糞便標(biāo)本DNA的提取用電子天平稱(chēng)取受試者新鮮尾便200mg/份，加入ASL緩沖液 和0. 3g玻璃珠，置入Fast Pr印FP120快速核酸提取儀，6. 5 m/sX45 s進(jìn)行破壁，然后按 照QIAamp DNA stool mini kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后AE洗脫DNA。所有抽提獲得的DNA均 置于-8(TC保存?zhèn)溆谩?.熒光定量PCR反應(yīng)
(1) 反應(yīng)體系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別 為200umol/L，上游和下游引物的濃度為0.5 umol/L， MgCl2的濃度為3.0 mmol/L， 0.02XSYBR green I熒光染料，2U HOTSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2ul，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ) 足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s, 6(TC退火30s， 72。C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。
(3) 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋(如109， 108， 107， 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個(gè)濃度重復(fù) 三次進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和C(T)值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y二-0. 2867X + 10. 19， R2=0. 994 (圖l， 2)。
(4) 樣品檢測(cè)取40例健康志愿者糞便標(biāo)本DNA作為模版，按照上述反應(yīng)體系和 反應(yīng)程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。在循環(huán)結(jié)束時(shí)通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行融解溫度曲線(xiàn)分析來(lái)決 定產(chǎn)物的特異性，即從75'C至95°C，每升溫0. 5'C，持續(xù)2秒后采集反應(yīng)管中反應(yīng)液的熒光 信號(hào)。每次熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以此獲取樣本 中不同菌種基因拷貝數(shù)。各種真菌數(shù)量以每克糞便基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值表示，數(shù)據(jù)以均數(shù)
(5) ±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。
結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)克柔念珠菌所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)為0.99，最低線(xiàn)性檢
測(cè)限為102拷貝/111 (圖1， 2)。擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度為9L0'C，而且融解曲線(xiàn)顯示擴(kuò)增反應(yīng)
特異性較好(圖3)。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)陽(yáng)性率(60.0%)顯著高于分離培養(yǎng)法(5.0%) (代O.OOl) ， 40例健康志愿者腸道克柔念珠菌的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為6.521±0.318 (1ogw拷貝/g)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法比較，具有特異性好，靈
敏度高，檢測(cè)快速等特點(diǎn)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于
以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出
或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQ ID NO: 1
aaaagtctag tacgctcgg 19 SEQ ID NO: 2
gcatccatga agaacgcagc 20
SEQ ID NO: 3
a犯agtctag tacgctcggc cagcttcgct
ctttacacgt cgtccgctcc gctcccccaa
tc犯acaggc atgccccccg g肌tgccg已g
ttcacgatgg ctgcaattca cactaggtat
ccctttcagg cgagtcgcag ctccgacgct 60 ctctgcgcac gcgcaagatg gaaacgacgc 120 gggcgcaatg tgcgttcaag aactcgatga薦 cgcatttcgc tgcgttcttc atggatgc 238
權(quán)利要求
1、一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10×Taqman PCR buffer；各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl2；0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；0.02×SYBR green I熒光染料；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備的要求系列稀釋?zhuān)挥嗔繛闊o(wú)菌雙蒸水；所述兩條引物為PCR擴(kuò)增過(guò)程中使用的特異性擴(kuò)增克柔念珠菌ITS區(qū)的引物，其中上游引物序列為5’-AAAAGTCTAGTACGCTCGG-3’；下游引物序列為5’-GCATCCATGAAGAACGCAGC-3’；所述標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版為克柔念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA；編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑盒，旨在提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道克柔念珠菌的試劑盒。該試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模版和兩條PCR擴(kuò)增過(guò)程中使用的特異性擴(kuò)增克柔念珠菌ITS區(qū)的引物，其中編碼擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對(duì)核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制；定量檢測(cè)，能真實(shí)反映腸道克柔念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。本發(fā)明提供的試劑盒可對(duì)腸道克柔念珠菌進(jìn)行快速定量檢測(cè)，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101555523SQ20091009855
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者李蘭娟, 郭仁勇, 瑜 陳, 陳珍晶, 魯海峰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)