專利名稱：用于熒光定量pcr法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
在正常人類腸道中存在一個(gè)豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法己經(jīng)對(duì)
人類腸道真菌進(jìn)行了i午多硏究(Khatib R， Riederer KM, Ramanathan J, et al. Faecal fungal flora in healthy volunteers and inpatients. Mycoses, 2001， 44:151-6.)，
該方法通過對(duì)真菌表型進(jìn)行診斷，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)和繁殖情況，根據(jù)菌落形 狀、大小、顏色、粘性以及其他結(jié)構(gòu)特征鑒定真菌，結(jié)合不同的生理、生化和耐熱性試驗(yàn)等 進(jìn)行形態(tài)學(xué)診斷。運(yùn)用分離培養(yǎng)法可以準(zhǔn)確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況 下，比如分離培養(yǎng)的菌落形態(tài)不典型、特殊培養(yǎng)基無法獲取、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)、表型結(jié)果非特 異等等，則無法對(duì)真菌病原體進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，需要依靠非培養(yǎng)診斷技術(shù)進(jìn)行真菌鑒定。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的各個(gè)領(lǐng)域(Espy MJ, Uhl JR， et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol, 2006， Rev 19(1): 165-256.)。該技術(shù)不僅能夠從本質(zhì)上增加 病原體檢測(cè)的靈敏度，結(jié)合種特異性引物和擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線分析可以特異的檢測(cè)和鑒定某 種病原體，檢測(cè)過程無需分離培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)便、快速，極大的縮短了診斷時(shí)間；并且可以作 為病原體感染患者治療療效的監(jiān)測(cè)手段。但是，由于人類腸道微生態(tài)群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大約 IO"個(gè)不同的微生物有機(jī)體，而真菌所占比例較低，不到1%;某些真菌菌種的生長(zhǎng)還需要
復(fù)雜的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)法只能檢測(cè)到一小部分條件適合的微生物，檢測(cè)靈敏度低且診斷
周期長(zhǎng)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是基于對(duì)病原體核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制且檢測(cè) 靈敏度高，有利于更加準(zhǔn)確、全面的了解真菌群落在腸道病理生理過程中的作用。利用實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)和鑒定真菌病原體，這對(duì)于及時(shí)治療和有效控制腸 道真菌感染都至關(guān)重要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑 念珠菌的試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒，該試劑盒包括
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer; 各O. 15 umol/L l umol/L的上游和下游引物; 各200ymol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP; 2, 0 ,1/L 3. 5咖ol/L的MgCl2; 0. 05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶; 0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水；
所述兩條引物為PCR擴(kuò)增過程中使用的特異性擴(kuò)增光滑念珠菌ITS區(qū)的引物 上游引物序列為5， - CCCACATACTGATATGGCATACAA-3' (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列為5， — TTATCACACCACTCGACACT -3， (SEQ ID NO: 2) 所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模版為光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T
Easy載體連接后獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA;編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的
核苷酸序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
操作簡(jiǎn)便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對(duì)核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制定 量檢測(cè)，能真實(shí)反映腸道光滑念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢 測(cè)。本發(fā)明提供的試劑盒可對(duì)腸道光滑念珠菌進(jìn)行快速定量檢測(cè)，可以替代一直沿用的分離 培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣應(yīng)用。


圖1為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性模版梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的動(dòng)力 曲線圖，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度，圖中平行于橫坐標(biāo)的直線代表熒光 閾值。
圖2為將本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性模版梯度稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增所得的標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖，橫坐標(biāo)代表熒光閾值，縱坐標(biāo)代表不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)陽性模版的濃度。圖3為具體實(shí)施例中所述熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線圖，橫坐標(biāo)代表融解溫 度，縱坐標(biāo)代表相對(duì)熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。
本發(fā)明所述的用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒包括引物、Taqman PCR buffer、 dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料、標(biāo)準(zhǔn)陽性模版和無菌雙 蒸水。其中
(1) 引物是特異性擴(kuò)增光滑念珠菌ITS區(qū)的引物；
上游引物序列為5， - CCCACATACTGATATGGCATACAA-3， (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列為5， — TTATCACACCACTCGACACT -3， (SEQ ID NO: 2)
(2) 標(biāo)準(zhǔn)陽性模版
光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接即為標(biāo)
準(zhǔn)陽性模版；編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；擴(kuò)增產(chǎn)物與
pGEMT-T Easy載體連接后可在大腸桿菌DH5 a中增殖。儲(chǔ)存濃度為10"拷貝/ul，使用前進(jìn) 行系列稀釋。
該試劑盒保存于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明中所述光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自生物梅里埃公司生產(chǎn)的光滑念珠菌ATCC 2001菌 株，pGEMT-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，PCR用Buffer、 MgCl2、 dNTPs、 HOTSTART Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司。
具體實(shí)施例1:
本實(shí)施例中的試劑盒包括
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各0. 15 u mol/L的上游和下游引物；
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0畫1/L的MgCl2;
0.05U/iil HOTSTART Taq DNA聚合酶;
0. 02 X SYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋; 余量為無菌雙蒸水。具體實(shí)施例2: 試劑盒成份如下-
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各1.0 umol/L的上游和下游引物
各200u mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 5咖ol/L的MgCl2;
0. 05U/H 1 HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋； 佘量為無菌雙蒸水。
具體實(shí)施例3: 試劑盒成份如下
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各0.25 umol/L的上游和下游引物；
各200 ii mol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 5畫1/L的MgCl2;
0.05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02 X SYBR green I熒光染料；
標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋；
余量為無菌雙蒸水。
本發(fā)明試劑盒的工作原理介紹
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SY服熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈 后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光 信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。反應(yīng)包括以下幾個(gè)步驟(1) PCR變性過程產(chǎn)生 單鏈DNA， SYBR熒光染料呈游離狀態(tài)，熒光信號(hào)很低；(2)引物退火過程中，雙鏈DNA部 分形成，SYBR熒光染料同時(shí)特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，熒光信號(hào)增加；(3) PCR延伸過程 中，雙鏈DNA逐漸形成，SYBR熒光染料不斷摻入DNA雙鏈中，熒光信號(hào)不斷增加；(4)最 后延伸階段結(jié)束后，所有DNA形成雙鏈，摻入DNA雙鏈中的熒光染料達(dá)到最大值，熒光信號(hào) 也達(dá)到最大值。
本發(fā)明所述試劑盒使用方法舉例(1) 反應(yīng)體系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分 別為200umol/L，上游和下游引物的濃度為0.25nmol/L， MgCl2的濃度為2.5咖ol/L， 0.02XSYBR green I熒光染料，2UH0TSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2ul，無菌雙蒸水 補(bǔ)足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s， 57。C退火30s， 72。C延伸 45s，循環(huán)35次，最后72。C延伸5min。
(3) 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將標(biāo)準(zhǔn)陽性模版進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋(如103， 108， 107, 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個(gè)濃度重復(fù) 三次進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和C(T)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX + b,R2。
(4) 樣品檢測(cè)取受試者新鮮尾便200mg，按照常規(guī)方法提取DNA，取2ul DNA作為模 版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。
(5) 結(jié)果計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和所得的C(T)值計(jì)算起始模版拷貝數(shù)。
本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)例介紹-
取40例健康志愿者新鮮尾便，采用沙保氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和本發(fā)明所述熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
1. 模版DAN的制備
(1) 試劑采用QIAamp DNA stool mini kit結(jié)合玻璃珠擊打法抽提受試者糞便標(biāo)本 DNA， QIAamp DNA stool mini kit試劑盒購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，玻璃珠購(gòu) 自上海生物工程公司。
(2) 糞便標(biāo)本DNA的提取用電子天平稱取受試者新鮮尾便200mg/份，加入ASL緩沖 液和0.3g玻璃珠，置入Fast Pr印FP120快速核酸提取儀，6.5 m/sX45 s進(jìn)行破壁，然 后按照QIAamp DNA stool mini kit說明書進(jìn)行操作，最后AE洗脫DNA。所有抽提獲得的 DNA均置于-8(TC保存?zhèn)溆谩?br> 2. 熒光定量PCR反應(yīng)
(1) 反應(yīng)體系lOXTaqman PCR buffer 4yl, dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分 別為200umol/L，上游和下游引物的濃度為0.25 umol/L, MgCl2的濃度為2.5 mmol/L， 0. 02XSYBR greenl熒光染料，2UH0TSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2ul，無菌雙蒸水 補(bǔ)足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s， 57。C退火30s， 72。C延伸 45s，循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。(3) 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備將標(biāo)準(zhǔn)陽性模版進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋(如109， 108， 107， 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個(gè)濃度重復(fù) 三次進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和C(T)值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-0. 2865X + 10. 21, R2=0. 997 (圖l， 2)。
(4) 樣品檢測(cè)取40例健康志愿者糞便標(biāo)本DNA作為模版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng) 程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。在循環(huán)結(jié)束時(shí)通過對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行融解溫度曲線分析來決定產(chǎn) 物的特異性，即從75'C至95'C，每升溫0.5'C，持續(xù)2秒后采集反應(yīng)管中反應(yīng)液的熒光信 號(hào)。每次熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性模版構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此獲取樣本中 不同菌種基因拷貝數(shù)。各種真菌數(shù)量以每克糞便基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值表示，數(shù)據(jù)以均數(shù)
(S) ±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。
結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)光滑念珠菌所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99,最低線性 檢測(cè)限為102拷貝/ul (圖1， 2)。擴(kuò)增產(chǎn)物的融解溫度為S5.5'C，而且融解曲線顯示擴(kuò)增 反應(yīng)特異性較好(圖3)。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)陽性率(32.5%)顯著高于分離培養(yǎng)法 (2.5%)(代O.OOl) ， 40例健康志愿者腸道光滑念珠菌的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為 5.536±0.258 (1ogw拷貝/g)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法比較，具有 特異性好，靈敏度高，檢測(cè)快速等特點(diǎn)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于 以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出 或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQ ID NO:1
cccacatactgatatggcat￡Lcsa 24
SEQ ID NO:2
ttatcacaccactcgacact20
SEQ ID NO:3
cccacatEictgatatggcatacaatttcaa
accaaacacaatgtgtttgag犯ggMELtg
c聊gggcgcaatgtgcgttC3犯geittcg
cgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcga
ttttgaagttgttttctactaaaageL犯tc
tttgtttgtgtttgcatccactgggag獄
3tagtagt犯3gt￡L￡L￡LCtCC
ggtgtgataa430
序列表
gttaactcaaaaacgagagtatcactcact60
SLCgctc犯acaggcatgccccccggaatac120
atgattcacggaattctgcaattcacatta180
tgcgeigaaccaagagatccattgttgaagLg240
ttgtgttgactgaattagtt300
tccccccccg3aag卿gcgttcccccaac360
actgtgtgtagtaattag犯agtgtcgsgt420
權(quán)利要求
1、一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10×Taqman PCR buffer；各0.15μmol/L～1μmol/L的上游和下游引物；各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl2；0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；0.02×SYBR green I熒光染料；標(biāo)準(zhǔn)陽性模版，其濃度按定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的要求系列稀釋；余量為無菌雙蒸水；所述兩條引物為PCR擴(kuò)增過程中使用的特異性擴(kuò)增光滑念珠菌ITS區(qū)的引物，其中上游引物序列為5’-CCCACATACTGATATGGCATACAA-3’；下游引物序列為5’-TTATCACACCACTCGACACT-3’；所述標(biāo)準(zhǔn)陽性模版為光滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)前述引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA；編碼所述擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑盒，旨在提供一種用于熒光定量PCR法檢測(cè)腸道光滑念珠菌的試劑盒。該試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模版和兩條PCR擴(kuò)增過程中使用的特異性擴(kuò)增光滑念珠菌ITS區(qū)的引物，其中編碼擴(kuò)增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對(duì)核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制；定量檢測(cè)，能真實(shí)反映腸道光滑念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。本發(fā)明提供的試劑盒可對(duì)腸道光滑念珠菌進(jìn)行快速定量檢測(cè)，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101555524SQ20091009855
公開日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者李蘭娟, 郭仁勇, 瑜 陳, 陳珍晶, 魯海峰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)