專利名稱：一種全氟辛酸的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全氟辛酸類物質(zhì)殘留檢測(cè)方法，更具體的說(shuō)是對(duì)全氟辛酸 的一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
全氟辛酸及其鹽(PFOA)是一種常用的氟表面活性劑，具有很強(qiáng)的疏水性 和疏油性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)較其它表面活性劑穩(wěn)定。由于它優(yōu)異的耐熱、耐低溫、 自潤(rùn)滑性及化學(xué)穩(wěn)定性等，被應(yīng)用在航天、電子、化學(xué)和消防領(lǐng)域，并被用在生 活部門如不粘鍋具、防水透氣材料(如防水衣物)、皮革、汽車部件及微波爐爆 玉米花袋等。PFOA難以降解，在環(huán)境中具有積累性和持久性，但其對(duì)人及環(huán)境 的影響至今還沒(méi)得出明確的結(jié)論。PFOA可通過(guò)攝取、吸入、皮膚接觸而被吸 收，從而誘發(fā)癌癥、肝腫大等疾病。 一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,PFOA能夠擾亂脂肪酸 的新陳代謝，影響生殖系統(tǒng)，可能與乳腺、睪丸、胰和肝腫瘤有關(guān)。PFOA的生 物毒性作用還包括對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，干擾線粒體代謝，導(dǎo)致肝細(xì)胞損 傷，疾病感染致死等。由于其疏水疏油的特點(diǎn)，PFOA全氟有機(jī)物被生物攝取后 一般不在脂肪組織中積累，其大部分與血漿蛋白結(jié)合存在于血液中，其余一部 分則蓄積在動(dòng)物的肝臟組織和肌肉組織中。由于它的這種分布特點(diǎn)以及沒(méi)有很 好的檢測(cè)方法，使得PFOA的污染問(wèn)題很長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有受到科學(xué)家的重視。全氟表 面活性劑的研究在國(guó)際上已然成為環(huán)境科學(xué)和毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)研究還 尚屬起步階段?，F(xiàn)有的儀器檢測(cè)法樣品前處理復(fù)雜，所需的儀器昂貴，成本高， 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)PFOA進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，有必要研究針對(duì)PFOA 的快速、便攜的免疫檢測(cè)技術(shù)。這就需要合成能產(chǎn)生簇特異性抗體的免疫原。 目前為止，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有針對(duì)全氟辛酸PFOA的免疫檢測(cè)方法的報(bào)道，為了彌補(bǔ) 這一空白，設(shè)計(jì)合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoicacid)為半抗原的用 于全氟有機(jī)物檢測(cè)的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)全氟辛酸殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法，并 且有較高的靈敏度和特異性。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種全氟辛酸的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，利用合成的全氟 辛酸免疫原(胥傳來(lái)、李灼坤、彭池方等 一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原
的合成方法，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810021105.X)免疫得到多克隆抗體，以全氟辛 酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以全氟辛酸半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立全氟辛酸的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法；步驟如下-.
(1) 以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原1:5000 1:8000，加入酶 標(biāo)板中，每孔10(VL， 4"C孵育過(guò)夜，然后用含0.1。/。明膠的上述碳酸鹽緩沖液 作為封閉液，封閉2h;
(2) 用PBS將全氟辛酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL 系列濃度，及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，力P 5(VL/孔；將多 克隆抗體以抗體稀釋液梯度稀釋，然后每孔加入5(HiL稀釋好的多克隆抗體， 于37'C溫育lh，然后以PBST洗滌液洗滌3 5次；
(3) 將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔GAR-HRP用抗體稀釋液以 l:3000 l:5O0O進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100pL， 37。C作用lh后以PBST洗滌 液洗滌3~5次；
(4) 每孔加入顯色液100|iL， 37。C顯色15min;加入終止液2M硫酸溶 液，每孔lOOpL;酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)45o，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待 測(cè)樣品的全氟辛酸含量。
配置顯色液
A液0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 |^30%^1202用超純水 定容至100 mL;
B: 60mg3，3^，5C四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；
使用前將A液與B液以5:1體積比混合。
更詳細(xì)的步驟為
主要溶液配制
1) 配制磷酸鹽0.01M(PBS)緩沖液 Na2HP04.12H20 3.62 g KH2P04 0.2 g NaCl 0.2g KC1 8.0g 加超純水稀釋至1000 mL;
2) 配制碳酸鹽(CBS)緩沖溶液(0.05M) pH9.6 Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g 加超純水稀釋至1000 mL;
3) 配制PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。
4) 配制封閉液含0.1%明膠的碳酸鹽緩沖液
5) 配制抗體稀釋液含0.in/。明膠的PBST溶液。
6) 顯色液A液0.933 g擰檬酸，3.68gNa2HP04-12H20, 18 pL 30%H2O2用超純水 定容至100 mL;
B液60 mg 3,3^5，5^四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；
使用前將A液與B液以5:1體積比混合。
7)終止液2M的H2SCU。
間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)方法的步驟如下
預(yù)先將全氟辛酸的標(biāo)準(zhǔn)品配制成100|ig/mL的甲醇溶液作為工作母液，在4 。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4， 0.15mol/LNaCl, 0.5%Tween-20)， 以此為基礎(chǔ)配制系列反應(yīng)液，用以稀釋競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)液和多克隆抗體。
a、 包被用設(shè)定濃度的包被原包被酶標(biāo)板，100pL/孔，4。C過(guò)夜。
b、 洗滌:用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min, 200pL /孔，然后甩干酶標(biāo)板。
c、 封閉含O.P/。明膠的碳酸鹽緩沖液，20(HiL/孔，37"封閉2h。
d、 洗漆同b。
e、 競(jìng)爭(zhēng)用PBST將全氟辛酸稀釋成O.Ol， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20ng/mL 系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBST空白對(duì)照，5(HiL/孔。然后每孔加入5(HiL稀釋8100 倍的抗血清，于37。C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標(biāo)二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000)， 10(HiL/孔，37 C反應(yīng)lh。
h、 洗滌同b。
i、 顯色加顯色液100|iL/孔，顯色15min。 j、終止加終止液IOOiiL/孔。
k、測(cè)定用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的吸光值。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了全氟辛酸的間接ELISA方法，為全氟辛 酸殘留檢測(cè)提供了一種快速高效的檢測(cè)手段，由于采用的是多克隆抗體，費(fèi)用 較低且穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。靈敏度為0.1ng/mL，線性范圍為0-100ng/mL，半 數(shù)抑制量(ICs())為10.3ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性和高親和性使ELISA具有極 高的選擇性和靈敏性，樣本前處理過(guò)程簡(jiǎn)單。


圖l全氟辛酸的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。 具體實(shí)施方案
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
一、儀器
TGL - 40B臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠； KFLOW純水機(jī)，凱佛隆公司； ZD-9556水平搖床，太倉(cāng)科教器材廠；Costar96孔8xl2可拆酶標(biāo)板，上海吉泰生物科技有限公司； MuLtiska Mks酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems公司； 可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司；
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
二、 試劑
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(GAR-HRP)，康成生物工程公司； 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，華美生物工程公司； 其他試劑均為分析純?cè)噭?br> 三、 步驟
1. 免疫原和包被原的合成
合成免疫原(全氟辛酸半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)物)和包被原(全氟 辛酸半抗原和卵清蛋白OVA偶聯(lián)物)，用碳二亞胺法偶聯(lián)，具體步驟如下
① 稱取2mg (0.00483mmo1)全氟辛酸、8mg(0.000121mmol)牛血清蛋白 BSA (或5.5mg卵清蛋白)溶于lmLO.l mol/L的PBS緩沖液，逐滴加入現(xiàn)配的 水溶性碳二亞胺EDC的甲醇溶液，室溫輕柔攪拌3小時(shí)，即得到人工抗原混合 液。
② 將人工抗原混合液移入透析袋中，用6XlL的去離子水透析4-6天。最 后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原全氟辛酸-牛血清 蛋白(或包被原全氟辛酸-卵清蛋白)。
2、 ELISA反應(yīng)過(guò)程 抗體效價(jià)測(cè)定步驟-
1) 將包被原用碳酸鹽緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標(biāo)板，100 pL/孔，于4 °C 冰箱過(guò)夜。次日取出酶標(biāo)板回至室溫，每孔注入200nLPBST溶液，搖床上振 蕩3min,用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續(xù)洗滌2次。以下洗滌方 法相同。
2) 充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標(biāo)板，200 (iL/孔，于37 "C溫育箱 內(nèi)溫育2h后取出烘干待用。
3) 將陽(yáng)性血清系列稀釋對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板的前7行列，第8行加入陰性血清， 100 pL/孔，37'C孵育1 h后洗滌、拍干。
4) 每孔加入lOO(iL， 1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG, 37。C孵育lh后 洗滌、拍干。
5) 每孔加入100pL顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37。C反應(yīng)15min， 取出后每孔加入100pL終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值 50。
抗體特異性測(cè)定步驟-
a、包被用設(shè)定濃度的包被原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，100pL/孔，fC過(guò)夜。b、 洗滌用PBST洗滌酶標(biāo)板三次，每次3min， 200ixL/孔，然后甩干酶標(biāo)板。
c、 封閉含0.1%明膠的碳酸鹽緩沖液，200]liL/孔，37。C封閉2h。
d、 洗滌同b。
e、 競(jìng)爭(zhēng)用PBST將全氟辛酸母液稀釋成0.01 ，0.05， 0.1， 1,5， 10， 50ng/mL 系列濃度，另設(shè)一個(gè)PBST空白對(duì)照，50pL/孔。然后每孔加入50pL稀釋4000 倍的多克隆抗體，于37"C溫育lh。
f、 洗滌同b。
g、 加酶標(biāo)二抗(羊抗兔GAR-HRP ， 1:4000), 100pL/孔，37 C反應(yīng)lh。
h、 洗滌同b。
i、 顯色加顯色液100|iL/ L顯色15min。 j、終止加終止液100nL/孔。
k、測(cè)定用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的吸光值。 試驗(yàn)結(jié)果如下
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線本實(shí)驗(yàn)所獲得的抗體檢測(cè)的線性范圍是為0 100ng/mL。
2、 靈敏度靈敏度是所得90%最大吸光值所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，即IC90
為0. lng/mL。
權(quán)利要求
1、一種全氟辛酸的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于利用合成的全氟辛酸免疫原免疫得到多克隆抗體，以全氟辛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以全氟辛酸半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立全氟辛酸的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法；步驟如下(1)以0. 05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原1∶5000～1∶8000，加入酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃孵育過(guò)夜，然后用含0.1％明膠的上述碳酸鹽緩沖液作為封閉液，封閉2h；(2)用PBS將全氟辛酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列濃度，及處理好的樣品，分別加入到各自的酶標(biāo)孔中，加50μL/孔；將多克隆抗體以抗體稀釋液梯度稀釋，然后每孔加入50μL稀釋好的多克隆抗體，于37℃溫育1h，然后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔GAR-HRP用抗體稀釋液以1∶3000～1∶5000進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)每孔加入顯色液100μL，37℃顯色15min；加入終止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶標(biāo)儀450nm測(cè)吸光值A(chǔ)450，與所作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比算出待測(cè)樣品的全氟辛酸含量。
全文摘要
一種全氟辛酸的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用合成的全氟辛酸-BSA偶聯(lián)物免疫原免疫得到多克隆抗體，以全氟辛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以全氟辛酸半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了全氟辛酸的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法。本發(fā)明建立了全氟辛酸的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，為全氟辛酸的殘留檢測(cè)提供了一種快速高效的檢測(cè)方法，由于采用的是多克隆抗體，費(fèi)用較低且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，靈敏度為0.1ng/ml，線性范圍為0～100ng/ml，免疫反應(yīng)的高特異性和親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101413944SQ200810234848
公開(kāi)日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來(lái), 偉 馬 申請(qǐng)人:江南大學(xué)