專利名稱：：免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫層析試驗(yàn)用具、用免疫層析試驗(yàn)用具檢測待測物的方法及免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法。
背景技術(shù)：
：免疫層析試驗(yàn)用具作為用能與試樣中待測物特異性結(jié)合的物質(zhì)檢測待測物的實(shí)驗(yàn)器具已為人所知。將疑為含待測物的試樣添加到此實(shí)驗(yàn)器具的一部分(加樣區(qū))，則試樣由于毛細(xì)管現(xiàn)象在加樣區(qū)內(nèi)移動，達(dá)到固定有可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物的標(biāo)記物固定墊。如果有待測物，則待測物與標(biāo)記物結(jié)合，形成待測物一標(biāo)記物復(fù)合物。試樣再因毛細(xì)管現(xiàn)象散開，此復(fù)合物在免疫層析膜移動，到達(dá)固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物的判斷區(qū)，于是，該復(fù)合物結(jié)合到該結(jié)合物。如此，在判斷區(qū)形成標(biāo)記物一待測物一結(jié)合物夾心式復(fù)合物。當(dāng)標(biāo)記物含有色載體粒子(染色的乳膠粒子和膠體金屬粒子等)時(shí)，標(biāo)記物會被判斷區(qū)捕捉，則判斷區(qū)顯色。通過觀察此判斷區(qū)的顯色，即可進(jìn)行試樣中待測物的檢測。在使用這種免疫層析試驗(yàn)用具的實(shí)驗(yàn)中，試樣中所含影響免疫層析反應(yīng)的物質(zhì)可能造成假陽性反應(yīng)。比如，有時(shí)采自人的生物試樣中會含有人抗鼠抗體(HAMA)，此時(shí)，HAMA在免疫層析試驗(yàn)用具中會與作為結(jié)合物使用的來源于鼠的抗體起反應(yīng)。因此，即使不含待測物的試樣中也可能出現(xiàn)疑似存在待測物的假陽性結(jié)果。美國專利申請第2007/0059682號記述有一種免疫層析試驗(yàn)用具，其中層析膜有固定了捕捉HAMA的物質(zhì)的HAMA捕捉器。此免疫層析試驗(yàn)用具通過用HAMA捕捉器捕捉存在于試樣中的HAMA提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，專利文獻(xiàn)1記述的免疫層析試驗(yàn)用具有時(shí)不能徹底捕捉HAMA。其結(jié)果，受未捕捉的HAMA的影響，可能給出錯誤的判斷結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)
發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。本發(fā)明的目的是提供一種免疫層析試驗(yàn)用具，它可以降低可能存在于試樣中的人抗鼠抗體(HAMA)對免疫層析反應(yīng)產(chǎn)生的影響，從而得出比以往的免疫層析試驗(yàn)用具更準(zhǔn)確的判斷結(jié)果。本發(fā)明的另一目的是提供一種用上述免疫層析試驗(yàn)用具檢測待測物的檢測方法以及一種上述免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法。即本發(fā)明提供一種檢測試樣中待測物的免疫層析試驗(yàn)用具，包括層析膜，有固定了可以與待測物結(jié)合的結(jié)合物的判斷區(qū)；試樣展開墊，有加樣區(qū)配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的位置，用于添加試樣；及6標(biāo)記物附著墊，配置于比加樣區(qū)靠近試樣展開方向下游、比層析膜靠近試樣展開方向上游的位置，用于附著可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物。在此，可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中。所述免疫層析試驗(yàn)用具，其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在標(biāo)記物附著墊。其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在試樣展開墊。其中標(biāo)記物附著墊配置在與試樣展開墊和層析膜有接觸的位置。其中標(biāo)記物附著墊配置在與層析膜有一定間隔的位置。其中試樣展開墊配置在與層析膜有接觸的位置。其中試樣展開墊配置在與層析膜有一定間隔的位置。所述免疫層析試驗(yàn)用具，還包括配置在比層析膜靠試樣展開方向下游位置的吸收墊。其中吸收墊配置在與層析膜有接觸的位置。其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)為可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體或可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體片段。其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體是選自保藏于日本國家技術(shù)評估研究所專利微生物寄存中心(NPMD)的保藏日為2007年9月25日的保藏號為NITEBP—420和保藏號NITEBP—421之中的至少一種雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。所述免疫層析試驗(yàn)用具，其中標(biāo)記物附著墊還附著質(zhì)控用標(biāo)記物，層析膜還有固定可與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)的質(zhì)控區(qū)。7所述免疫層析試驗(yàn)用具，還包括第二試樣展開墊，其配置在比加樣區(qū)靠近試樣展開方向下游且比層析膜靠近試樣展開方向上游的位置。其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在第二試樣展開墊。其中可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在墊中，以便與試樣一起展開。本發(fā)明還提供一種用免疫層析試驗(yàn)用具檢測試樣中待測物的方法，該免疫層析試驗(yàn)用具所含層析膜有一判斷區(qū)，其中固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物。該方法包括以下步驟向免疫層析試驗(yàn)用具添加試樣；使可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)和可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物與試樣在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中接觸；以及讓可與固定在判斷區(qū)的待測物結(jié)合的結(jié)合物與試樣接觸；檢測出通過待測物結(jié)合到判斷區(qū)的標(biāo)記物質(zhì)。本發(fā)明再提供一種免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法，其中該免疫層析試驗(yàn)用具所含層析膜有一用于檢測試樣中所含待測物的判斷區(qū)，該判斷區(qū)中固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物。該制造方法包括讓可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在配置于比層析膜靠近試樣展幵方向上游的墊中。使用本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具，即使試樣中含有人抗鼠抗體(HAMA)，也可以徹底降低HAMA對免疫層析反應(yīng)的影響。因此，可以準(zhǔn)確地檢測出試樣中的待測物。比如當(dāng)檢査病毒和細(xì)菌等病原體感染時(shí)，可以降低產(chǎn)生假陽性結(jié)果的可能性。因此可以得出更正確的檢查結(jié)果。8圖l為本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具形態(tài)的例示圖。圖2為比較例的層析膜平面圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具用于檢測試樣中由抗原或抗體組成的待測物。上述試樣含從人體采集的生物樣本和對該生物樣本進(jìn)行前期處理所得的產(chǎn)物。作為采自人體的生物樣本有血液、血清、糞便、尿液、唾液、鼻腔抽取液、拭液、汗液、淚液等。作為上述前期處理比如有將生物樣本溶解到適當(dāng)?shù)那捌谔幚碓噭┲?，用過濾器過濾溶解所得溶液等。待測物只要是能夠獲得待測物相應(yīng)抗體的物質(zhì)即可，無特別限定。比如可以是細(xì)菌、原生生物和真菌等細(xì)胞、病毒、蛋白質(zhì)、多糖類等。具體而言，作為待測物有流感病毒(如A型、B型等)、副流感病毒、RS病毒、輪狀病毒、杯狀病毒(calicivirus)、冠狀病毒、腺病毒、腸道病毒、皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、重癥急性呼吸器癥候群病原病毒(冠狀病毒)等病毒；支原體肺炎、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、三日瘧原蟲等細(xì)胞；其他消化器官疾病、中樞神經(jīng)疾病、出血熱等各種疾病的病原體、這些病原體的代謝物；癌胚抗原和CyFRA等腫瘤標(biāo)記物、激素等。這些待測物在生物樣本中也可以含一種以上。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具尤其適用于檢測從流感病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和腺病毒中選擇的一種以上的病毒。9本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具將可與人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)的物質(zhì)(HAMA反應(yīng)物)附著在比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中。HAMA反應(yīng)物只要是配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊，既可以僅附著在一個墊中，也可以附著在二個以上墊中。HAMA反應(yīng)物最好不固定在墊中。即HAMA反應(yīng)物最好能夠與試樣一起展開。HAMA是一種人類所具有的能夠特異性認(rèn)識鼠的免疫球蛋白(鼠抗體)的抗體。在多數(shù)情況下，被暴露于鼠抗體的人和接受使用鼠單克隆抗體的藥物治療的人具有HAMA。在本說明書中，對HAMA無特別限定，只要是能與鼠抗體反應(yīng)的人所具有的抗體即可。比如，也可以是兔抗體和狗抗體等能與其他哺乳動物抗體交叉反應(yīng)的來源于人的抗體。上述HAMA反應(yīng)物只要能與HAMA反應(yīng)無特別限定。比如可以是與HAMA反應(yīng)的鼠抗體及其片段(如Fc片段、F(ab，)2片段、Fab片段、Fab，片段等)。更具體地說，作為HAMA反應(yīng)物有由保藏號NITEBP—420(微生物識別碼HB2—2350)的雜交瘤或保藏號NITEBP—421(微生物識別碼HB3—354)的雜交瘤(均于2007年9月25日由國家技術(shù)評估研究所專利微生物寄存中心保藏)產(chǎn)生的來源于鼠的單克隆抗體或"單克隆用非特異去除劑"(BioLink公司生產(chǎn))。HAMA反應(yīng)物可以一種單獨(dú)使用，也可以二種以上混合使用。特別是混合了上述由保藏號NITEBP—420的雜交瘤和保藏號NITEBP—421的雜交瘤產(chǎn)生的來源于鼠的單克隆抗體的HAMA反應(yīng)物最好。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具，上述HAMA反應(yīng)物附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游位置的墊中。作為配置于比上述層析膜靠近試樣展開方向上游的墊，可舉出試樣展開墊和標(biāo)記物附著墊。也可以是與試樣展開墊和標(biāo)記物附著墊不同的第二試樣展開墊。如本發(fā)明這樣讓HAMA反應(yīng)物附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游位置的墊中，可以比將HAMA反應(yīng)物固定在層析膜上更多地附著HAMA反應(yīng)物。還可以比將HAMA反應(yīng)物固定在層析膜上延長試樣中所含HAMA與HAMA反應(yīng)物的反應(yīng)時(shí)間。因此，可以減少HAMA對免疫層析反應(yīng)的影響。在本說明書中，所謂"試樣展開方向上游"和"試樣展開方向下游"指在免疫層析試驗(yàn)用具的縱長方向的相對方向，添加試樣的一頭為上游，試樣展開下去(流下去)的一頭為下游。在本說明書中，所謂比如"在比層析膜靠近試樣展開方向上游位置放在襯底上的試樣展開墊"指包括層析膜的試樣展開方向上游開頭部分在內(nèi)，試樣展開方向上游的某一處至少有試樣展開墊的一部分。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的試樣展開墊有添加試樣的加樣區(qū)，在比層析膜靠近試樣展開方向上游位置放在襯底上。試樣展開墊可以使用人造纖維、玻璃纖維、纖維素纖維等材質(zhì)的東西。加樣區(qū)為添加試樣的部分，最好位于試樣展開墊的試樣展開方向上游位置。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的標(biāo)記物附著墊附著可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物。標(biāo)記物附著墊在比加樣區(qū)靠近試樣展開方向下游ii且比層析膜靠近試樣展開方向上游位置放在襯底上。標(biāo)記物附著墊可以使用玻璃纖維、纖維素纖維、塑料(如聚酯、聚丙烯、聚乙烯等)纖維等材質(zhì)的東西。標(biāo)記物附著墊最好與試樣展開墊接觸配置。可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物最好為被標(biāo)記的可與待測物結(jié)合的抗體或抗原。作為標(biāo)記此抗原或抗體的標(biāo)記成份如有瓊脂、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)海藻酸、交聯(lián)瓜爾膠、硝酸纖維素和羧基纖維素等纖維素酯類、凝膠、交聯(lián)凝膠、乳膠、橡膠、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯樹脂、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等天然或合成樹脂及其衍生物、用色素粒、熒光分子或磁粒子等標(biāo)記的玻璃(比如活性化玻璃)、硅膠、高嶺土、云母、硅鋁、氧化鋁、硫酸鋇等無機(jī)材料組成的粒子所得粒子；紅細(xì)胞；及金等金屬膠體。其中尤以含色素分子、熒光分子或磁性粒子的乳膠粒子和金膠體為佳?？膳c待測物結(jié)合的標(biāo)記物也可根據(jù)待測物種類為二種以上。標(biāo)記物附著墊最好還附著有用于確認(rèn)試樣是否適當(dāng)展開的質(zhì)控用標(biāo)記物。質(zhì)控用標(biāo)記物最好對試樣中的成份實(shí)際上不起反應(yīng)。該質(zhì)控用標(biāo)記物可以與下述能與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)組合使用。即，質(zhì)控用標(biāo)記物和能結(jié)合到質(zhì)控用標(biāo)記物的物質(zhì)是二個能特異性結(jié)合的物質(zhì)的組合。其中，以任何一者為質(zhì)控用標(biāo)記物使用均可。作為這種能特異性結(jié)合的二個物質(zhì)的組合可以列舉出半抗原和能與之結(jié)合的蛋白質(zhì)，如鏈霉親和素或親和素與生物12素、2，4一二硝基酚或異羥洋地黃毒苷與蛋白質(zhì)(如清蛋白、酪蛋白、纖維蛋白原等)等。作為質(zhì)控用標(biāo)記物的標(biāo)記可以使用與上述標(biāo)記物同樣的標(biāo)記。質(zhì)控用標(biāo)記物可以與標(biāo)記物同一標(biāo)記成份標(biāo)記，也可以不同豐示i己j^1"分豐示i己。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的襯底只要可以作為普通免疫層析試驗(yàn)用具的襯底使用即可，無特別限定。比如可以使用塑料、紙張、玻璃等。襯底為了配置層析膜、試樣展開墊和標(biāo)記物附著墊等，最好表面具有粘性。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的層析膜具有固定了可與待測物結(jié)合的結(jié)合物的判斷區(qū)。作為層析膜的材質(zhì)可以使用靠靜電作用和疏水相互作用等物理作用能與蛋白質(zhì)結(jié)合且通過毛細(xì)管現(xiàn)象能使試樣展開的材質(zhì)。比如，硝化纖維、尼龍(如也可以羧基和烷基作為置換基的導(dǎo)入了氨基的修飾尼龍)、聚偏氟乙烯(PVDF)、醋酸纖維素等。固定在層析膜判斷區(qū)的結(jié)合物只要是能與待測物結(jié)合的物質(zhì)即可。尤以能與待測物特異性結(jié)合的抗體或抗原為宜。結(jié)合物最好能在與上述標(biāo)記物與待測物結(jié)合的位點(diǎn)不同的位點(diǎn)與待測物結(jié)合°層析膜根據(jù)待測物的種類可以僅有一個判斷區(qū)，也可以有二個以上。當(dāng)有二個以上時(shí)，各判斷區(qū)固定不同種類的能與待測物結(jié)合的結(jié)合物。層析膜最好有固定有可與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)的質(zhì)控區(qū)，用于確認(rèn)試樣是否適當(dāng)展開。判斷區(qū)和質(zhì)控區(qū)可以是線形、圓形和方形等。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具除上述層析膜、試樣展開墊和標(biāo)記物附著墊外，還可以有吸收墊。吸收墊可以用纖維素、玻璃纖維等材質(zhì)的東西。吸收墊最好配置在比層析膜靠近試樣展開方向下游的位置，并與層析膜接觸。在這種位置上配置吸收墊可以加快試樣的展開速度。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具可以使用已為人知的免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法，只要使HAMA反應(yīng)物附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中即可。比如，在以往的制作方法中，附著標(biāo)記物的標(biāo)記物附著墊用含標(biāo)記物的緩沖液制作。具體而言，通過將標(biāo)記物附著墊浸泡在該緩沖液、或在標(biāo)記附著墊中添加緩沖液使標(biāo)記物附著墊含有該緩沖液。然后干燥含有該緩沖液的標(biāo)記物附著墊，即可制作出附著有標(biāo)記物的標(biāo)記物附著墊。此時(shí)，再在上述緩沖液中添加HAMA反應(yīng)物，即可使標(biāo)記物附著墊除標(biāo)記物之外又附著HAMA反應(yīng)物。在上述緩沖液中添加質(zhì)控用標(biāo)記物，即可使標(biāo)記物附著墊還附著質(zhì)控用標(biāo)記物。用含有HAMA反應(yīng)物的緩沖液還可以制作附著有HAMA反應(yīng)物的試樣展開墊。即，通過將試樣展開墊浸泡在該緩沖液、或在試樣展開墊中添加該緩沖液后干燥，制作附著有HAMA反應(yīng)物的試樣展開墊。附著有HAMA反應(yīng)物的第二試樣展開墊也同樣可以用含有HAMA反應(yīng)物的緩沖液制作。可以將如上制作的標(biāo)記物附著墊、試樣展開墊或第二試樣展開墊與用眾所周知的方法制作的其他組成部分、如襯底、層析14膜、標(biāo)記物附著墊或試樣展開墊、任意的第二試樣展開墊和任意吸收墊組裝在一起，進(jìn)行裁剪，制作本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的形式如圖1(a)(d)所例示。(a)、(b)和(c)所示免疫層析試驗(yàn)用具有試樣展開墊1、標(biāo)記物附著墊2、層析膜3、吸收墊4和襯底5。(d)所示免疫層析試驗(yàn)用具有試樣展開墊1、標(biāo)記物附著墊2、層析膜3、吸收墊4、襯底5和第二試樣展開墊6。加樣區(qū)10位于試樣展開墊1的試樣展開方向上游。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的理想狀態(tài)為，標(biāo)記物附著墊2與試樣展開墊1和層析膜3接觸配置。作為這種狀態(tài)的例示如(a)和(c)。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的另一理想狀態(tài)為，標(biāo)記物附著墊2與層析膜3隔一定間隔配置。作為這種狀態(tài)的例示如(b)和(d)。上述間隔可根據(jù)免疫層析試驗(yàn)用具的大小和所檢測的待測物種類等適當(dāng)選擇。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具的其他理想狀態(tài)為，試樣展開墊l與層析膜3接觸配置。作為這種狀態(tài)的例示如(b)和(c)。本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具最好在比加樣區(qū)10靠近試樣展開方向下游、且比層析膜3靠近試樣展開方向上游的位置還有放在襯底上的第二試樣展開墊6。該第二試樣展開墊6可以配置于比標(biāo)記物附著墊2靠近試樣展開方向上游的位置，也可以配置于下游位置。第二試樣展開墊6還可以有二個以上。15當(dāng)本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具有第二試樣展開墊6時(shí)，選自試樣展開墊1、第二試樣展開墊6和標(biāo)記物附著墊2中的至少一個附著HAMA反應(yīng)物即可。第二試樣展開墊6可以使用與上述試樣展開墊1同樣材質(zhì)的東西。舉例實(shí)施例1在市場銷售的檢測流感病毒用免疫層析試驗(yàn)用具(pochtem流感A/B，希森美康(Sysmex)株式會社)的標(biāo)記附著墊中作為HAMA反應(yīng)物附著以保藏號NITEBP—420和保藏號NITEBP—421保藏在國家技術(shù)評估研究所專利微生物寄存中心的雜交瘤產(chǎn)生的來源于鼠的單克隆抗體，制備本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具。艮P，如下制備pochtem流感A型/B型的標(biāo)記物附著墊。將1050pg引發(fā)抗A型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)的藍(lán)色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.3pm)懸浮于3950|iL分散用緩沖液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩沖液(pH7.0))中，制備抗A型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)粒子。將1050pg引發(fā)抗B型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)的藍(lán)色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.3pm)懸浮于3950)iL分散用緩沖液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩沖液(pH7.0))中，制備抗B型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)粒子。將U5(Hig引發(fā)鏈霉親和素變態(tài)反應(yīng)的紅色聚苯乙烯乳膠粒子(粒徑0.19)am)懸浮于385(HiL分散用緩沖液(含有BSA和蔗糖的磷酸緩沖液(pH7.0))中，制備鏈霉親和素變態(tài)反應(yīng)乳膠粒子。16將上述二種雜交瘤產(chǎn)生的來源于鼠的單克隆抗體溶解于lmLHAMA反應(yīng)物緩沖液(磷酸緩沖液(pH7.0))中，使其分別達(dá)到1.75mg/mL，制備HAMA反應(yīng)物溶液。混合如上調(diào)制的抗A型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)粒子3600pL、抗B型流感單克隆抗體變態(tài)反應(yīng)粒子3600)iL、鏈霉親和素變態(tài)反應(yīng)乳膠粒子200pL和HAMA反應(yīng)物溶液800jiL，獲得含有HAMA反應(yīng)物的混合乳膠粒子8200|iL。將所得含有HAMA反應(yīng)物的混合乳膠粒子832pL放入玻璃纖維制薄墊(300mmx5mmx0.28mm)上，在真空干燥機(jī)上烘干，制備標(biāo)記物附著墊。將如此制備的標(biāo)記物附著墊與pochtem流感A/B的襯底、層析膜和試樣展開墊組裝在一起裁剪，獲得本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具。此免疫層析試驗(yàn)用具附著有平均一個測試條10pg的HAMA反應(yīng)物。pochtem流感A/B是具有圖1(a)所示結(jié)構(gòu)的試驗(yàn)用具，針對A型流感的鼠單克隆抗體和針對B型流感的鼠單克隆抗體及生物素BSA作為能與待測物結(jié)合的結(jié)合物和能與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)分別固定在層析膜載體上的判斷區(qū)和質(zhì)控區(qū)。比較例1使用pochtem流感A/B作為比較例1。比較例2作為比較例2，使用的是將與實(shí)施例1中所用相伺的HAMA17反應(yīng)物固定在pochtem流感A/B的層析膜第一判斷區(qū)7A(參照圖2)的用具。下面用圖2說明比較例2的層析膜的制備方法。圖2為層析膜的平面圖。如圖2所示，由硝化纖維膜構(gòu)成的層析膜7有第一判斷區(qū)7A、第二判斷區(qū)7B和質(zhì)控區(qū)7C。比較例2的層析膜用抗體涂覆機(jī)將以下溶液涂覆在第一判斷區(qū)7A、第二判斷區(qū)7B和質(zhì)控區(qū)7C。第一判斷區(qū)7A:上述HAMA反應(yīng)物所含兩種來源于鼠的單克隆抗體在磷酸緩沖液(pH7.0)分別稀釋為1.75mg/ml濃度的溶液。第二判斷區(qū)7B:用磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋到濃度1.5mg/ml的抗B型流感單克隆抗體溶液。質(zhì)控區(qū)7C:用磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋到濃度2.0mg/ml的生物素BSA溶液。在實(shí)施例1和比較例1的層析膜中，均在第一判斷區(qū)7A涂覆了用磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋到濃度2.0mg/ml的抗A型流感單克隆抗體溶液。將分別涂覆了各溶液的層析膜在5(TC干燥30分鐘。將干燥后的層析膜7浸泡于封閉液(含有BSA的磷酸緩沖液(pH7.0))中，進(jìn)行封閉。封閉后，用清洗液(含有SDS的磷酸緩沖液(pH7.0))沖洗，40。C干燥120分鐘，制備比較例2的層析膜。將所得比較例2的層析膜與pochtem流感A/B的襯底、標(biāo)記物附著墊和試樣展開墊組裝在一起裁剪，獲得比較例2的免疫層析試驗(yàn)用具。所得比較例2的免疫層析試驗(yàn)用具有平均每測試條4.1pg的HAMA反應(yīng)物固定在層析膜載體上。得知，若要固定多于此量的HAMA反應(yīng)物，則層析膜載體表面會有HAMA反應(yīng)物析出。因此，層析膜載體上可固定的HAMA反應(yīng)物量，從試驗(yàn)用具的質(zhì)量考慮，比固定在實(shí)施例1的免疫層析試驗(yàn)用具上的HAMA反應(yīng)物數(shù)量要少得多。實(shí)驗(yàn)例1將抗鼠IgG(MBL303G抗鼠IgG(山羊)、標(biāo)簽號No.130)用以下所示稀釋用緩沖液稀釋到表1所示濃度。以此為試樣，在實(shí)施例1、比較例1和2的免疫層析試驗(yàn)用具的加樣區(qū)添加試樣200pL。15分鐘后，目測判斷區(qū)的顯色強(qiáng)度。先制作目測判斷樣本，比如BioDot公司的TSR3000薄膜分析儀(membranestripreader)測定的判斷區(qū)的檢測線強(qiáng)度在0.015以上0.03以下設(shè)為l+，0.03以上且小于0.08設(shè)為2+，0.08以上設(shè)為3+，此目測判斷即通過將試驗(yàn)用具上出現(xiàn)的檢測線強(qiáng)度與該目測判斷樣本比較而進(jìn)行。判斷顯色比1+目測判斷樣本弱的檢測線為+w。作為陰性質(zhì)控品(NC)使用了不含抗鼠IgG的稀釋用緩沖液。19稀釋用緩沖液成份如下〈稀釋用緩沖液〉磷酸鈉'2H2078g氯化鈉45g疊氮化鈉2.5g牛血清白蛋白50g4N氫氧化鈉87.5mL超純水5L*用1N氫氧化鈉和1N鹽酸調(diào)整為pH7.0。結(jié)果如表l所示。在此，"A"欄表示固定有抗A型流感單克隆抗體的第一判斷區(qū)的判斷結(jié)果。而"B"欄表示固定有抗B型流感單克隆抗體的第二判斷區(qū)的判斷結(jié)果。"一"表示目測無法確認(rèn)判斷區(qū)顏色。比較例2如上所述在第一判斷區(qū)固定了HAMA反應(yīng)物。因此，比較例2僅在第二判斷區(qū)判斷結(jié)果的"B"欄有記載。表中雖然沒有表示，但在所有實(shí)驗(yàn)中均確認(rèn)了質(zhì)控區(qū)的顏色。即，確認(rèn)試樣已適當(dāng)展開。[表1]抗鼠IgG的濃度比較例1實(shí)施例1比較例2ABABB168//g/mL3+3+1+1+3+16.8/ig/mL2+2+——2+1.68/ig/mL+w+w一—+wNC---一20從表1的結(jié)果得知，pochtem流感A/B(比較例1)的判斷區(qū)(第一和第二判斷區(qū))盡管試樣中未含有流感病毒，但由于抗鼠IgG的存在，顯示出假陽性結(jié)果。即使使用在層析膜上固定了HAMA反應(yīng)物的比較例2的免疫層析試驗(yàn)用具也未能避免這一假陽性結(jié)果。與此相反，用本發(fā)明的實(shí)施例1的免疫層析試驗(yàn)用具，當(dāng)抗鼠IgG濃度為168pg/mL時(shí)，雖然可見極少的假陽性結(jié)果，但比起比較例1和2的試驗(yàn)用具來，可以提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。實(shí)施例2將與實(shí)施例1所用相同HAMA反應(yīng)物附著在取代實(shí)施例1的pochtem流感A/B的pochtemS流感(希森美康株式會社)的標(biāo)記物附著墊中，制備本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具。pochtemS流感與pochtem流感A/B同樣，在層析膜上的各判斷區(qū)和質(zhì)控區(qū)固定有作為能與待測物結(jié)合的結(jié)合物對A型流感病毒的鼠單克隆抗體和對B型流感病毒的鼠單克隆抗體以及作為能與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)生物素BSA，具有圖1(b)所示結(jié)構(gòu)。比較例3比較例3使用了pochtemS流感。實(shí)驗(yàn)例2用實(shí)施例1和2及比較例1和3的免疫層析試驗(yàn)用具對采自患者的試樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試樣按照pochtem流感A/B或pochtemS流感的附屬說明書，通過用附屬的標(biāo)本抽取試劑對從患者采集的生物樣本(鼻腔抽取21液、鼻腔拭液或咽喉拭液)進(jìn)行處理而制備。將所得試樣約200pL添加到實(shí)施例1和2及比較例1和3的免疫層析試驗(yàn)用具加樣區(qū)，與實(shí)驗(yàn)例l同樣，進(jìn)行判斷區(qū)的檢測線強(qiáng)度判斷。檢測線強(qiáng)度+w以上者判斷為流感病毒陽性。作為質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，對同樣生物試樣用RT—PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng))檢測流感病毒抗原。免疫層析試驗(yàn)用具或RT—PCR判斷為陽性的試樣數(shù)如表2的"A"(A型流感病毒為陽性)、"B"(B型流感病毒為陽性)或"A/B"(A型和B型流感病毒均為陽性)欄所示。表2的"一"欄表示判斷為陰性的試樣數(shù)。[表2]22(A)比較例1的免疫層析實(shí)驗(yàn)用具<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從表2的結(jié)果得知，有的試樣(表2(A)(C)畫網(wǎng)格的欄)用RT—PCR法判斷為沒有流感病毒，但用傳統(tǒng)的免疫層析試驗(yàn)用具時(shí)判斷為陽性，但用本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具即使這種試樣也與RT—PCR的結(jié)果一致，能判斷為陰性。S卩，使用本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具降低了假陽性的發(fā)生率。實(shí)施例3作為HAMA反應(yīng)物，使用市場銷售的非特異吸收抗體(Biolink公司，單克隆用非特異去除劑，標(biāo)簽號061002)取代實(shí)施例2用的HAMA反應(yīng)物，制備本發(fā)明的免疫層析試驗(yàn)用具。平均每測試條附著的HAMA反應(yīng)物數(shù)量為7.2pg。實(shí)驗(yàn)例3用實(shí)施例3和比較例3的免疫層析試驗(yàn)用具，以HAMA血清(含人抗鼠抗體的血清)為試樣進(jìn)行檢測線強(qiáng)度判斷。HAMA血清使用以下幾種HAMA血清1:BioReclamation(國際生物公司制)BRH22942HAMA血清2:BioReclamation(國際生物公司帝DBRH40929HAMA血清3:BioReclamation(國際生物公司制)BRH40930HAMA血清4:BioReclamation(國際生物公司制)BRH40932將上述HAMA血清150|uL與附屬于pochtemS流感的標(biāo)本抽取試劑800]iL混合，制備試樣。將20(HiL試樣添加到各免疫層析試驗(yàn)用具的加樣區(qū)，10分鐘后與實(shí)驗(yàn)例1同樣進(jìn)行檢測線強(qiáng)度判斷。作為陰性質(zhì)控品(NC)使用了200pL標(biāo)本抽取試劑。結(jié)果如表3所示。其中"一"表示目測未能確認(rèn)判斷區(qū)顯色。另，表中雖無表示，但在整個實(shí)驗(yàn)中，確認(rèn)質(zhì)控區(qū)顯色。即確認(rèn)試樣適當(dāng)展開。[表3]24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>從表3的結(jié)果得知，使用市場銷售的非特異性吸收抗體作為HAMA反應(yīng)物的本發(fā)明免疫層析試驗(yàn)用具比以往的免疫層析試驗(yàn)用具能夠降低假陽性的發(fā)生率。前述的詳細(xì)說明及附圖是通過文字解釋和圖示來進(jìn)行的，其目的不在于限定權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本說明書中的具體實(shí)施方式的各個變種對于普通技術(shù)人員來說顯而易見，并處于權(quán)利要求及其等同技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于檢測試樣中所含待測物的免疫層析試驗(yàn)用具，包括層析膜，具有固定了可以與待測物結(jié)合的結(jié)合物的判斷區(qū)；試樣展開墊，具有加樣區(qū)配置在比層析膜靠近試樣展開方向上游位置，用于添加試樣；及標(biāo)記物附著墊，配置于比加樣區(qū)靠近試樣展開方向下游且比層析膜靠近試樣展開方向上游的位置，用于附著可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物；其中，可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中。2.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在標(biāo)記物附著墊。3.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在試樣展開墊。4.權(quán)利要求1~3中任一所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于標(biāo)記物附著墊配置在與試樣展開墊和層析膜有接觸的位置。5.權(quán)利要求13中任一所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于標(biāo)記物附著墊與層析膜有一定間隔。6.權(quán)利要求1~3中任一所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于試樣展開墊與層析膜接觸配置。7.權(quán)利要求1~3中任一所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于試樣展開墊與層析膜有一定間隔。8.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，還包括配置在比層析膜靠近試樣展開方向下游位置的吸收墊。9.權(quán)利要求8所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于吸收墊與層析膜有接觸。10.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)為可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體或可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體片段。11.權(quán)利要求IO所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的抗體是選自保藏于日本國家技術(shù)評估研究所專利微生物寄存中心，保藏日期為2007年9月25日，國際保藏號為NITEBP—420和國際保藏號為NITEBP—421之中的至少一種雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。12.權(quán)利要求1~3中任一所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于標(biāo)記物附著墊還附著質(zhì)控用標(biāo)記物；層析膜還有固定可與質(zhì)控用標(biāo)記物結(jié)合的物質(zhì)的質(zhì)控區(qū)。13.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，還包括第二試樣展開墊，其配置在比加樣區(qū)靠近試樣展開方向下游且比層析膜靠近試樣展開方向上游的位置。14.權(quán)利要求13所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在第二試樣展開墊。15.權(quán)利要求1所述免疫層析試驗(yàn)用具，其特征在于可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在墊中，以便與試樣一起展開。16.—種用免疫層析試驗(yàn)用具檢測試樣中所含待測物的方法，該免疫層析試驗(yàn)用具所含層析膜有一判斷區(qū)，其中固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物。該方法包括以下步驟向免疫層析試驗(yàn)用具添加試樣；使可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)和可與待測物結(jié)合的標(biāo)記物與試樣在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中接觸；以及讓可與固定在判斷區(qū)的待測物結(jié)合的結(jié)合物與試樣接觸；檢測出通過待測物結(jié)合到判斷區(qū)的標(biāo)記物質(zhì)。17.—種用于檢測試樣中待測物的免疫層析試驗(yàn)用具的制造方法，所述免疫層析試驗(yàn)用具所含層析膜有一個用于檢測試樣中所含待測物的判斷區(qū)，所述判斷區(qū)中固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物，其特征在于包括讓可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中的步驟。全文摘要本發(fā)明提供一種免疫層析試驗(yàn)用具、用該免疫層析試驗(yàn)用具檢測待測物的方法以及該免疫層析試驗(yàn)用具的制作方法。該免疫層析試驗(yàn)用具包含層析膜，層析膜有判斷區(qū)，該區(qū)域固定有可與待測物結(jié)合的結(jié)合物，可與人抗鼠抗體反應(yīng)的物質(zhì)附著在配置于比層析膜靠近試樣展開方向上游的墊中。文檔編號G01N33/577GK101435819SQ20081014885公開日2009年5月20日申請日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者一口毅,村上真澄,長谷川武宏申請人:希森美康株式會社