專利名稱：固相免疫層析試驗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的固相免疫層析試驗。這類試驗采用的多孔固相載體中，樣品和試劑通過毛細管擴散作用遷移。裝置中特別為人所知的是該固相載體為一種“浸漬棒”形式。這類試驗使用的固相層析載體包含一檢測區(qū)域，該區(qū)中固定有對于分析物具特異性的捕獲試劑。使該固相載體首先與含待測樣品的溶液相接觸，與分析物的特異性標記的結(jié)合試劑。所述溶液在固相載體中通過毛細管擴散作用遷移至含固定有捕獲試劑的區(qū)帶。在夾心試驗中，標記的連結(jié)合劑與分析物結(jié)合，通過捕獲試劑將分析物固定在固相載體上。檢測該標記試劑即可測定樣品中是否存在分析物。
背景技術(shù)：
歐洲專利EP 0 284 232描述的固相免疫層析試驗方法中，固相載體直接帶有冷凍干燥或脫水形式的偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑。偶聯(lián)顆粒標記物的試劑呈冷凍干燥形式下不能移動，但在濕潤狀態(tài)下可在固相載體中移動。因此，當固相載體接觸液體樣品時，液體在載體內(nèi)通過毛細管擴散作用而遷移，并帶動偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑。在這些試驗中，不需要事先混合偶聯(lián)試劑和樣品，而是將試驗試驗所需的所有試劑加到固相載體中。此外，用顆粒性標記物標記的分析物特異性結(jié)合試劑用可直接用肉眼觀測，不需要多余操作來讀取試驗結(jié)果。因此這些試驗只需要少量操作，并且使用方便迅捷。
歐洲專利EP 0291194，EP 0560411和EP 0560410描述的測試裝置中，也使用固相載體承載偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑。此外這類裝置中固相載體裝在一種盒子中，該盒子具有存放樣品的孔和供讀取結(jié)果用的供讀結(jié)果用的觀測窗口。盒子便于夾持該裝置，同時保護固相載體。此外，這些專利還描述一種裝置，該裝置中載體一端從盒體凸出、便于存放液體樣品。例如，固相載體的這種凸起端可以直接接觸尿液流。
WO 00/00288描述的改進后裝置包括一盒體和固相載體。該固相載體含有移動性促集組分，從而更好地收集樣品。
EP-A1-0458231涉及固相免疫層析試驗用于檢測液體樣品中的分析物。這些試驗使用的固相載體，一般為膜，膜上固定有能捕獲分析物的試劑。加入樣品后，固定于固相載體上的分析物可用偶聯(lián)尿素酶的結(jié)合試劑測得。在該文件描述的方法中，樣品和其后標記的結(jié)合試劑沉積在固相載體上。
然而，這些固相免疫層析試驗時常顯現(xiàn)靈敏度和重復性上的不足。這些問題常常在如下特定情況下出現(xiàn)被檢測分析物的濃度低時，或是被測分析物樣品是例如全血那樣的復合物形式時。此外由于此類缺陷，此種試驗適合檢測樣品中分析物的存在與否，因此只能夠獲得定性結(jié)果難于進行定量測定。除此之外，常見相當大的背景干擾以及區(qū)帶效應(又稱“胡克效應”，Hook effect)，從而防礙了結(jié)果的可讀性。在免疫試驗中，胡克效應是一種眾所周知的不利影響。它通常出現(xiàn)在樣品中分析物濃度很高的情況下。該效應可產(chǎn)生一種陰性結(jié)果，導致樣品中不含分析物的偏離性結(jié)論。
為了彌補這類缺陷，本發(fā)明提出一種固相免疫層析試驗方法，可獲得更高的靈敏度和可重復性，同時限制背景干擾和胡克效應。本發(fā)明的方法特別適用于諸如血液的復合物型樣品。鑒于可減少背景干擾、同時增加靈敏度和可重復性，本發(fā)明方法的優(yōu)點是能在同一載體上同時檢測幾種不同的分析物。此外，由于本發(fā)明方法的性能水平，可以測定液體樣品中的分析物并加以定量。
按照本發(fā)明的方法，偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑以液體形式用前即時加入。于是依照本發(fā)明的方法，樣品和各類試劑加入的次序?qū)υ摍z測試驗的效果相當重要。

發(fā)明內(nèi)容
第一個實施例中，本發(fā)明檢測液體樣品中分析物的方法包含以下步驟a)提供一種具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的多空固相載體，檢測區(qū)固定有捕獲試劑；b)將以下物質(zhì)分別依次加入到多孔固相載體的收集區(qū)中i)偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，ii)液體樣品，c)提供充足時間，讓偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和液體樣品通過毛細管擴散作用從多孔固相載體上的收集區(qū)遷移至檢測區(qū)，
d)觀測檢測區(qū)中偶聯(lián)顆粒標記物的試劑結(jié)合的程度。
有利的是在b步驟中，遷移方向從多孔固相載體收集區(qū)至檢測區(qū)，液體樣品加在偶聯(lián)顆粒標記物結(jié)合試劑的上游。
本發(fā)明還涉及檢測液體樣品中分析物的方法，它包括以下幾個步驟a)提供一種具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的多孔固相載體，檢測區(qū)固定有一捕獲試劑；b)以下物質(zhì)分別依次加入到多孔固相載體的收集區(qū)中i)一種偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，該結(jié)合試劑為液體形式，ii)液體樣品，iii)液體形式的稀釋液，c)提供充足時間，讓多孔固相載體的偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑、液體樣品以及稀釋液通過毛細管擴散作用從收集區(qū)遷移至檢測區(qū)，d)觀測檢測區(qū)偶聯(lián)顆粒標記物的試劑結(jié)合的程度。
本發(fā)明的主題也是一種檢測液體樣品中分析物的方法，包含以下步驟a)提供一種具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的多孔固相載體，檢測區(qū)固定有一捕獲試劑；b)將以下物質(zhì)分別依次加入到多孔固相載體的收集區(qū)中i)液體樣品，ii)偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，該結(jié)合試劑為液體形式，iii)液體形式的稀釋液，c)提供充足時間，讓偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑、液體樣品以及稀釋液通過毛細管擴散作用從多孔固相載體上的收集區(qū)遷移至檢測區(qū)，d)觀測檢測區(qū)偶聯(lián)顆粒標記物的試劑結(jié)合的程度。
有利的是在b步驟中，遷移方向從相對多孔固相載體收集區(qū)至檢測區(qū)，液態(tài)稀釋液加入到偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑上游中。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和固定在檢測區(qū)中的捕獲試劑使得能用夾心試驗檢測分析物。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，和固定在檢測區(qū)中的捕獲試劑，使得能夠通過競爭試驗檢測分析物。
多孔固相載體優(yōu)選層析條帶或窄條帶形式的多孔固相載體。
優(yōu)選將多孔固相載體整裝到可持握載體中，該載體至少有一個窗口可觀察多孔固相載體檢測區(qū)中偶聯(lián)顆粒標記的程度。
在本發(fā)明的具體實施例中，所述可持握載體具有至少一個以上的加樣孔，分別用于加入液體樣品、偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑以及(在合適地方開孔)稀釋液至多孔固相載體的收集區(qū)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，將多孔固相載體整裝到可持握載體中，該載體至少有一個以上的觀測窗口，可以觀察多孔固相載體檢測區(qū)中偶聯(lián)顆粒標記物的反應劑結(jié)合的程度；多孔固相載體也收集區(qū)中具有用于加入偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑的第一開口、和位于第一開口上游的第二開口，用于加入液體樣品。
在另一優(yōu)選實施例中，將多孔固相載體整裝在可持握載體中，該載體具有一個觀測窗口可觀察檢測區(qū)中偶聯(lián)顆粒標記物的反應劑結(jié)合的程度；多孔固相載體收集區(qū)中也具有用于加入偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和樣品的第一開口，和位于第一開口上游的第二開口，用于加入液體稀釋液樣品。
所述可持握載體優(yōu)選裝載盒子中。
本發(fā)明的另一個主題是用于檢測液體樣品中分析物的試劑盒，該試劑盒包含(a)具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的多空固相載體，檢測區(qū)中固定有捕獲試劑；(b)液體形式的偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑。
本發(fā)明的用于檢測液體樣品中分析物的試劑盒優(yōu)選含有稀釋液。
優(yōu)選將多孔固相載體整裝到可持握載體中。
多孔固相載體整裝到的可持握載體優(yōu)選具有至少一個觀測窗口，用以觀察該多孔固相載體的檢測區(qū)。
在一個優(yōu)選實施例中多孔固相載體整裝到可持握載體中，在該多孔固相載體的收集區(qū)中具有至少一個開口用以加入液體樣品和/或偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和/或稀釋液。
優(yōu)選將多孔固相載體整裝在盒子形式的可持握載體中。
“分析物”一詞指樣品中需要檢測的任何化學、生化、生物性實體。本發(fā)明方法可檢測的分析物中，特別要提到的是傳染因子或是腫瘤產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、肽、抗體、激素、類固醇和抗原。傳染因子如有細菌、病毒或其他寄生生物、核酸(DNA或RNA)，治療性分子，藥劑或抗生素。
“檢測”一詞指檢測樣品中分析物存在與否，但也包括檢測和定量樣品中的分析物。這是因為本發(fā)明的方法性能水平高可以實現(xiàn)定量或半定量的檢測。
在本發(fā)明的一個特定實施例中，所述分析物是hCG(人絨毛膜促性腺素)或是PSA(前列腺特異抗原)。
在本發(fā)明的另一個特定實施例中，所述分析物是核酸。此例中，宜依照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)(PCR等)事先擴大樣品中的核酸。這種擴增步驟優(yōu)選同時能標記擴增的核酸，例如利用生物素?；囊锘蛲ㄟ^摻入生物素標記的核苷酸等?；蛘撸绮捎眠m當?shù)哪┒宿D(zhuǎn)移酶用生物素標記核酸的3端。加樣前，樣品用熱震蕩、或是0.2N NaOH和0.05M EDTA溶液環(huán)境下、或是其他任何適當方法進行變性。該變性步驟可獲得單鏈核酸。
“液體樣品”一詞指分析物樣品的以溶液或懸液。液體樣品具體可以是任何生物液或體液，也可以直接或間接獲自生物液或體液這種樣品，也可以是某固體樣品的提取液。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述液體樣品為尿液、全血、血漿或血清。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于本發(fā)明方法的各種試劑。
偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑以及捕獲試劑對于樣品中待測的分析物應具有特異性。
在本發(fā)明的一個特定實施例中，采用偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和固定在固相載體中檢測區(qū)中的捕獲試劑，從而能夠通過夾心試驗檢測分析物。
在本發(fā)明另一個特定實施例中，利用固定在固相載體中檢測區(qū)的偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑以及分析物特異性捕獲試劑，能競爭試驗檢測分析物。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知，夾心試驗和競爭試驗是己知的。夾心試驗中，要預先測定分析物特異性捕獲試劑和標記的結(jié)合試劑是否能分別地、特異地結(jié)合分析物，例如結(jié)合該分析物的兩個相同或不同的表位。競爭試驗中，標記的結(jié)合試劑應與分析物相同或近似，從而能與分析物競爭同捕獲試劑結(jié)合。
“捕獲試劑”一詞指能夠特異性結(jié)合分析物的任何化學、生化、生物性實體。
就競爭試驗而言，捕獲試劑同樣能結(jié)合結(jié)合試劑。分析物和捕獲試劑一般形成配體-抗配體，抗原-抗體，DNA-RNA，或是DNA-DNA配對。因此，如果分析物是抗原或半抗原，捕獲試劑就是該分析物的特異性抗體。如果分析物是抗體，捕獲試劑是該抗體所識別的抗原或是能特異識別該分析物的抗體。如果分析物是一種核酸，捕獲試劑則是其互補的DNA探針。
被固定的捕獲試劑優(yōu)選對分析物具有高度親和力的多克隆或單克隆抗體；更優(yōu)選單克隆抗體。
可將分析物特異性的捕獲試劑依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)固定在固相載體上。以此方式固定的捕獲試劑在濕環(huán)境下不應移動。進行這種固定例如可通過吸附或共價偶聯(lián)。當俘獲試劑是核酸時，可以用紫外線處理或其它本領(lǐng)域技術(shù)使之結(jié)合于硝化纖維素載體上。
“結(jié)合試劑”一詞指任何能特異性結(jié)合分析物或與分析物競爭結(jié)合捕獲試劑的化學、生化、生物性實體。
“連接”一詞，指任何強力結(jié)合，如共價結(jié)合；或弱結(jié)合，如抗原-抗體或親和素-鏈霉親和素鍵類型結(jié)合。
結(jié)合試劑可以是一種抗體、抗原或核酸。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他結(jié)合試劑，例如一種(或多種)抗生物素單克隆抗體、親和素、鏈霉親和素或多聚鏈霉親和素。這些試劑可以是天然的或重組的。
在競爭試驗中，所述結(jié)合試劑是分析物自身或分析物的合適同類物?！胺治鑫锏暮线m同類物”一詞指能結(jié)合該分析物特異性捕獲試劑的同類物。因此，標記的結(jié)合試劑是偶聯(lián)顆粒性標記物的該分析物，或該分析物的偶聯(lián)顆粒性標記物的同類物。
在夾心試驗中，結(jié)合試劑特異性連接到分析物上。標記結(jié)合試劑可以是一種共價顆粒標記物上的、具分析物特異性的抗體。當分析物是生物素標記的核酸時，結(jié)合試劑一般是一種偶合至諸如膠體金顆粒標記物的抗生物素抗體。
結(jié)合試劑共價至顆粒標記，得以直接觀測得測試結(jié)果。當顆粒標記在固相載體檢測區(qū)濃集時可直接用肉眼觀測到。使用肉眼或測量儀器可直接度量該微粒。該度量度通過直接觀測，并不需要任何附加操作。顆粒標記一般由水溶性細小微粒組成，形成懸浮液，即的固體微粒分散在液體中。
顆粒標記對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，其中最為熟悉的是有色或熒光的顆粒標記。特別要例舉膠體金、照色膠乳微粒、熒光膠乳微粒以及與親和素或鏈霉親和素偶聯(lián)的微粒。
用于肉眼直接觀測的標記中，還要特別提及右旋糖酐類型的標記(HansenT.M.，IVD Technology 4，35-40，2003)。結(jié)合試劑可與至具熒光團的右旋糖酐鏈(多糖衍生物)相偶聯(lián)。
結(jié)合試劑依照現(xiàn)有技術(shù)與顆粒標記偶聯(lián)。
在本發(fā)明的方法中，與顆粒標記偶聯(lián)的結(jié)合試劑呈液體形式。
“液體形式的試劑”一詞指結(jié)合試劑的溶液或懸液。液體形式的偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑可按文獻所述的技術(shù)來制備實現(xiàn)。通常將偶聯(lián)的結(jié)合試劑用緩沖鹽溶液配成溶液或懸液。該溶液也可以含穩(wěn)定劑和其它化合物，例如抗菌素或抗真菌劑。穩(wěn)定劑中，特別提到的有BSA(牛血清蛋白)和酪蛋白。
在本發(fā)明的某些方法中，當液體樣品是例如血漿、血清或全血的液體樣品須使用稀釋液。稀釋液可在固相載體中夾帶樣品和標記的結(jié)合試劑一起移動。一般這種稀釋液包括緩沖鹽溶液；也可含洗滌劑或其他反應所需組份。
在檢測核苷酸的方法中，稀釋液可包括雜交緩沖液。該類雜交緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明免疫層析法中所使用的多孔固相載體是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(EP 0284232)。該載體的多孔性使液體或潮潤狀態(tài)樣品和試劑通過毛細管作用而擴散。
例如，多孔固相載體可以包含多種層析載體，如纖維素、尼龍、硝酸纖維、聚乙烯和玻璃纖維等各種有層析性能的載體。
固相載體可具有一種或多種不同部分，各部分可由不同材料組成。當該固相載體包含各不同部位或不同材料時，這些元件的排列應使固相載體中的毛細液流能夠連續(xù)流動。
優(yōu)選層析條帶或窄條帶形式的多孔固相載體。
固相載體可以是含有多個疊加窄帶或重疊窄帶的層析帶。
通常，該多孔固相載體包括一個收集樣品的區(qū)域和一個承載捕獲試劑的檢測區(qū)。這些區(qū)域的排列，以利于收集區(qū)流至檢測區(qū)毛細液流的延續(xù)性。收集區(qū)和檢測區(qū)是固相載體中兩個相異并分開的區(qū)域。樣品和標記的結(jié)合試劑，需要時還有稀釋液，加入收集區(qū)并通過多孔固相載體遷移至檢測區(qū)。比如層析帶，多空固相載體部分一端構(gòu)成收集區(qū)，而檢測區(qū)緊靠條帶的另一端。
這些區(qū)域在一種材料組成的條帶上處于同一平面。優(yōu)選該固相載體的兩個區(qū)域各選擇使用一種特定的材料。例如樣品收集區(qū)可以使用一種多孔吸收性材料于，該固相載體的樣品收集區(qū)為吸收性材料制成的收集組件，可使該收集組件可直接同尿液流柱等接觸。該固相載體也可包括如專利WO 00/0028所述的可移動性收集組件。
該多孔固相載體的檢測區(qū)也可含有第二捕獲試劑，固定在此多孔載體第一捕獲試劑的下游。該固定的第二捕獲試劑通過核實偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑于固相載體中的遷移，從而核對試驗進程是否無誤。第二捕獲試劑可以是結(jié)合試劑的一個特異性抗體。
在本發(fā)明的方法中，標記的結(jié)合試劑及樣品，需要時還有稀釋液，分別依次以液體形式加到固相載體的收集區(qū)中。應在加入樣品之前和/或在加稀釋液前即時加入液體形式的標記的結(jié)合試劑，從而使得樣品與標記的結(jié)合試劑之間立即完全接觸而盡可能減小背景干擾或胡克效應并提高靈敏度。液體形式的標記結(jié)合試劑加入劑量如果精確，可大大提高本發(fā)明方法的重復性。
此外，本發(fā)明方法中在加入樣品前、和/或加稀釋液前即時加入液體形式的標記結(jié)合試劑可能獲得洗滌效應從而減少背景干和胡克效應。該方法對血液等復合物樣品中分析物的檢測特別有有益。
優(yōu)選將樣品或稀釋液加入到標記的結(jié)合試劑上游的收集區(qū)中。
為了控制標記的結(jié)合試劑加入到收集區(qū)的量，優(yōu)選使用移液管、滴管或滴瓶加入。
液體樣品也可以通過移液管、滴管或滴瓶加入。在另一實施例中，樣品加入通過將收集區(qū)浸潤于液體樣品來實現(xiàn)。當液體樣品為尿液時，收集區(qū)也可直接接觸尿液注。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，多孔固相載體整裝入可持握載體。后者可部分或全部包含被多孔固相載體。通常，該可持握載體是盒體形式。
在EP 029194，EP 056411，EP 0560410和WO 00/00288中具體描述了該類可持握載體或盒體。
這種可持握載體利于多孔固相載體的操作，特別是保護其不受水汽影響。
這種可持握載體可由各種材料，例如紙板、增塑紙板或(更優(yōu)選)塑料組成。優(yōu)選的載體包含一類硬質(zhì)防滲材料。
一般，可持握載體具有至少一個觀測窗口，用來觀測多孔固相載體的檢測區(qū)。
在本發(fā)明的一個實施例中，多孔固相載體可具有一個凸出可持握載體的收集區(qū)，用于加入液體樣品并/或標記的結(jié)合試劑并/或稀釋液。
在本發(fā)明另一項實施例中，可持握載體或盒體具有至少一個開口用以于收集區(qū)加入液體樣品和/或標記的結(jié)合試劑和/或稀釋液。
現(xiàn)通過以下附圖和實施例更清楚地說明本發(fā)明


圖1本發(fā)明的免疫層析方法的原理陰影區(qū)域代表由吸收材料組成的固相載體部分。
圖2免疫層析試驗裝置圖2顯示含多孔固相載體的盒體的裝置。盒體具有用以沉積液體的開口(O)；以及觀測窗口(F)。圖2a顯示通過盒體開口將液體樣品加入固相載體。
圖2b顯示通過觀測窗口(F)所見的陰性結(jié)果。圖2c顯示通過觀測窗口(F)觀察到的夾心試驗的陽性結(jié)果。
T＝測試線，C＝控制線，O＝開口，F(xiàn)＝觀測窗口。
圖3雙孔免疫層析試驗裝置圖3顯示含有多孔固相載體的盒體。該盒體具有2個獨立開口(O1和O2)用于加入液體，還具有一個觀測窗口。箭頭指向毛細管擴散作用的遷移方向。
O1＝1號開口，O2＝2號開口，T＝測試線，C＝控制線。
圖4用稀釋液的對比例子R＝標記的結(jié)合試劑，E＝樣品，D＝稀釋液，T＝測試線，C＝控制線。
圖5未用稀釋液的對比例子R＝標記的結(jié)合試劑，E＝樣品，T＝測試線，C＝控制線。
具體實施例方式
實施例1 使用稀釋液的免疫層析法裝置使用圖2、3中的裝置實施此方法。
分析物和樣品分析物為血清中的PSA(前列腺特異性抗原)。試驗可用全血或血漿同法實施。
試劑和稀釋液標記的結(jié)合試劑是偶聯(lián)膠體金的抗PSA單克隆或多克隆抗體，用穩(wěn)定劑1％BSA(牛血清蛋白)的緩沖液(0.1M PBS，pH8)配制。
第一捕獲試劑固定于檢測區(qū)測試線，是抗PSA單克隆或多克隆抗體。
第二捕獲試劑固定于檢測區(qū)控制線，是針對所述標記的結(jié)合試劑抗體的單克隆或多克隆抗體(抗抗體)。
稀釋液為含0.05％吐溫20洗滌劑的PBS緩沖液(0.1M，pH8)。
操作方法圖4中比較了各種方法。方法A，B和C同本發(fā)明一致。在所有情況下，無論實施方法如何，為了不使結(jié)果失真，每次測試的樣品量和偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑用量都相同。
樣品量＝25微升(A、B、C、D、E法)。
稀釋液量＝100微升(A、B、C、D法)；150微升(E法)。
標記的結(jié)合試劑用量＝35微升(A、B、C、D法)；同量，但為脫水形式(E法)。
這些方法的實施如下A法1)標記的結(jié)合試劑2)液體樣品3)稀釋液B法1)加樣品于開口22)加標記的結(jié)合試劑于開口23)加稀釋液于開口1(開口2的上游)C法1)樣品2)標記的結(jié)合試劑3)稀釋液D法1)樣品和標記的結(jié)合試劑事先混合2)稀釋液E法1)樣品
2)稀釋液最后一種方法中，固相載體直接帶有標記的結(jié)合試劑。
結(jié)果使用反射儀測量和定量各方法的性能水平。使用分析物高濃度的樣品評價胡克效應。

分1到5級(有效性1最差5最好)。
實施例2 不使用稀釋液的免疫層析法裝置使用圖2、3中的裝置實施各種方法。
分析物和樣品分析物為尿液中的hCG(人絨毛膜促性腺素)。試驗也可用全血或血漿同法實施。
試劑和稀釋液標記的結(jié)合試劑為一種共價膠體金的抗hCG單克隆或多克隆抗體，其環(huán)境為所含穩(wěn)定劑為1％BSA(牛血清蛋白)的緩沖溶液(0.1M PBS，pH8)配制。
第一捕獲試劑固定于檢測區(qū)測試線，是抗hCG單克隆或多克隆抗體。
第二捕獲試劑固定于檢測區(qū)控制線，是針對所述標記的結(jié)合試劑抗體的單克隆或多克隆抗體。
操作方法圖5中比較了各種方法。
方法A，B和C同本發(fā)明一致。在所有情況下，無論實施方法如何，為了不使結(jié)果失真，每次測試的樣品量和偶聯(lián)顆粒標記的結(jié)合試劑用量都相同。
樣品量＝100微升(A、B、D法)；100微升+35微升(E法)。
標記的結(jié)合試劑量＝35微升(A、B、D法)；同量，但為脫水形式(E法)。
這些方法的實施如下A法1)標記的結(jié)合試劑2)樣品B法1)加標記的結(jié)合試劑于開口22)加樣品于開口1D法1)樣品和標記的結(jié)合試劑事先混合E法1)樣品最后一種方法中，固相載體直接帶有標記的結(jié)合試劑。
結(jié)果使用反射儀測量和定量各方法的性能水平。使用分析物高濃度的樣品來評價胡克效應。

分1到5級(有效性1最差5最好)。
實施例3裝置使用圖2中的裝置實施此方法。
分析物和樣品分析物為尿液中的嗎啡。
試劑標記的結(jié)合試劑為偶聯(lián)膠體金顆粒的嗎啡半抗原-BSA，懸浮于含穩(wěn)定劑1％BSA(牛血清白蛋白)的緩沖溶液(0.1M PBS，pH8)中。
第一捕獲試劑固定于檢測區(qū)測試線，是抗抗嗎啡單克隆抗體。
方法在該盒體的同一開口中加入35微升偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，然后加入150微升尿液。5分鐘后讀取結(jié)果。
結(jié)果與采用攜帶脫水形式偶聯(lián)結(jié)合試劑的固相載體的試驗相比，背景干擾降低，重復性提高。
實施例4裝置使用圖2中的裝置實施此法。
該裝置含硝酸纖維素窄條帶，通過紫外線法或任何其他技術(shù)使大腸桿菌或衣原體核酸的特異探針附著其上。窄條帶埋在具有一加試劑開口和一觀測窗口的塑料盒體中。
分析物和樣品樣品中待測的分析物為大腸桿菌或衣原體的DNA或RNA。核酸事先用常規(guī)技術(shù)擴增，例如用PCR技術(shù)。DNA用生物素的引物或摻入了生物素標記的核苷酸進行標記?；蛘?，也可用末端轉(zhuǎn)化酶將核酸的3端用生物素標記。
試劑標記的結(jié)合試劑是用膠體金標記的兔抗生物素多克隆抗體。
雜交緩沖是PBS緩沖液，含0.1％Tween20。也可使用其它雜交緩沖液。
方法將擴增的生物素標記核酸(樣品)用熱激休克或用1.2N NaOH、0.05M EDTA進行變性。
將25微升變性樣品置于加樣孔(開口)中。
然后將40微升標記的結(jié)合試劑(抗生物素偶聯(lián)物)加入加樣孔中。以上兩個步驟可倒置。
將150-200微升雜交緩沖液加入加樣孔中。
結(jié)果當待測核酸存在于樣品中時，它通過擴散從收集區(qū)遷移至檢測區(qū)，并在那里固定在載體上的探針相結(jié)合。檢測區(qū)出現(xiàn)紅條帶(加樣后10-20分鐘讀數(shù))?？刂凭€也顯現(xiàn)于檢測區(qū)，顯示試劑的功能正常。
權(quán)利要求
1.一種檢測一個液體樣品中分析物的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a)提供一種多孔固相載體，該固相載體具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)，檢測區(qū)中固定有一種捕獲試劑；b)在該多孔固相載體的收集區(qū)中分別、依次加入以下物質(zhì)i)偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，該試劑為液體形式，ii)液體樣品，c)提供充足時間讓偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和液體樣品，通過毛細管擴散作用從收集區(qū)遷移到檢測區(qū)。d)觀測檢測區(qū)中偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑的結(jié)合程度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b中，液體樣品加到偶聯(lián)顆粒標記的結(jié)合試劑的上游，遷移方向從多孔固相載體由收集區(qū)到檢測區(qū)。
3.一種檢測液體樣品中分析物的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a)提供具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的固相載體，檢測區(qū)中固定有捕獲試劑b)將以下物質(zhì)分別、依次加入該多孔固相載體的收集區(qū)中i)偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，該試劑為液體形式，ii)液體樣品，iii)液體形式的稀釋液，c)提供充足時間讓供偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑、液體樣品以及稀釋液，通過毛細管擴散作用從收集區(qū)遷移到檢測區(qū)。d)偶聯(lián)顆粒標記物觀測檢測區(qū)中結(jié)合試劑的結(jié)合程度。
4.一種檢測液體樣品中分析物的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a)提供具有一個收集區(qū)和一個檢測區(qū)的固相載體，檢測區(qū)中固定有捕獲試劑b)將以下物質(zhì)分別、依次加入多孔固相載體的收集區(qū)中i)液體樣品，ii)偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，該試劑為液體形式，iii)液體形式的稀釋液，c)以充足時間讓偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑、液體樣品以及稀釋液，通過毛細管擴散作用進行從收集區(qū)遷移到檢測區(qū)。d)觀測檢測區(qū)中結(jié)合試劑偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑的結(jié)合程度。
5.如權(quán)利要求3或4所述，其步驟b中，液體形式的稀釋液加在偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑的上游和液體樣品的上游，遷移方向相從多孔固相載體的收集區(qū)到檢測區(qū)。
6.如權(quán)利要求1至5任何一項所述的方法中，其中所述偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑以及固定于檢測區(qū)的捕獲試劑，使得能夠用夾心試驗能檢測分析物。
7.如權(quán)利要求1至5任何一項所述的方法，其中所述偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和固定于檢測區(qū)的捕獲試劑，使得能夠用競爭試驗檢測分析物。
8.如權(quán)利要求1至7中任何一項所述的方法，其中多孔固相載體是一種層析條帶或窄條帶形式的多孔固相載體。
9.如權(quán)利要求1至8任何一項所述的方法，其中多孔固相載體整裝一個可持握載體中，該載體具有一個觀察窗，用以觀測偶聯(lián)顆粒標記物的試劑在檢測區(qū)中結(jié)合的程度。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述可持握載體具有至少一個開口，用以將樣品、偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑，需要時還有稀釋液加入到多孔固相載體的收集區(qū)中。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其中多孔固相載體整裝在一可持握載體中，該載體具有至少一個觀測窗口，用以觀測偶聯(lián)顆粒標記物的試劑在檢測區(qū)中結(jié)合的程度；該多孔固相載體還具有一個第一開口用于將偶聯(lián)顆粒標記物的試劑加入到多孔固相載體的收集區(qū)，一個第一開口上游的第二開口用于將液體樣品加入到多孔固相載體的收集區(qū)中。
12.如權(quán)利要求5所述的方法，其中多孔固相載體整裝在一可持握載體，該載體具有至少一個觀測窗口，用以觀測偶聯(lián)顆粒標記物的試劑在檢測區(qū)的程度；該可持握載體具有一個第一開口用于將偶聯(lián)顆粒標記物的結(jié)合試劑和液體樣品加入到往多孔固相載體的收集區(qū)中，一個位于第一開口上游的第二開口用于將液體形式的稀釋液加入到多孔固相載體的收集區(qū)中。
13.如權(quán)利要求9至12任何一項所述的方法，其中所述可持握載體包括一個盒體。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測液相樣品中分析物的固相層析方法。在本發(fā)明的方法中，偶聯(lián)顆粒性標記物的結(jié)合試劑以液體形式使用前即時加入。
文檔編號G01N33/543GK1764839SQ200480008160
公開日2006年4月26日 申請日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者R·多納蒂, P·比戈 申請人:維達實驗室