專(zhuān)利名稱(chēng)：：夾心免疫檢測(cè)法及用該法檢測(cè)抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能夠靈敏地檢測(cè)出標(biāo)本試樣中所含微量抗原的夾心免疫檢測(cè)法及用該法檢測(cè)抗原的方法。
背景技術(shù)：
：作為檢測(cè)試樣中所含物質(zhì)(抗原)的方法，夾心法已為人所知。夾心法是在能識(shí)別抗原不同表位的二個(gè)抗體之間夾入抗原，檢測(cè)抗原。通常夾心法首先讓抗原與已結(jié)合于固相上的一次抗體結(jié)合。以此在固相上形成抗原和一次抗體的復(fù)合物。然后讓經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的二次抗體與固相上的抗原結(jié)合，檢測(cè)抗原。比如，專(zhuān)利公開(kāi)昭和57-074663號(hào)公開(kāi)了一種TSH的測(cè)定方法，該法是運(yùn)用酶聯(lián)免疫夾心檢測(cè)法，使含有TSH的標(biāo)本作用于有抗體結(jié)合的固相上后，再讓酶標(biāo)記抗體作用。S卩，專(zhuān)利公開(kāi)昭和57-074663號(hào)上公開(kāi)了一種傳統(tǒng)的夾心法，在用結(jié)合在固相上的抗體將抗原固定在固相上后，讓酶標(biāo)記抗體發(fā)揮作用，檢測(cè)該抗原。然而，傳統(tǒng)的夾心法存在當(dāng)用于測(cè)定的抗體對(duì)抗原的親和性不太高時(shí)以及標(biāo)本中抗原極少時(shí)，難以進(jìn)行高靈敏度測(cè)定的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書(shū)所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)
發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。5本發(fā)明的目的是提供一種能夠高靈敏度地檢測(cè)抗原的夾心免疫檢測(cè)法及其在檢測(cè)抗原中的應(yīng)用。艮口，本發(fā)明提供一種夾心免疫檢測(cè)法，包括以下步驟(a)讓抗原與識(shí)別上述抗原并由可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體接觸，形成抗原和第一抗體的復(fù)合物；及(b)用識(shí)別上述抗原并可結(jié)合到固相上的第二抗體將上述(a)步驟中形成的復(fù)合物固定到固相。其中所述抗原是甲狀腺刺激激素。所述(b)步驟實(shí)現(xiàn)在(a)步驟形成的復(fù)合物與第2抗體與固相三者接觸。所述(b)步驟在使(a)步驟形成的復(fù)合物與固相接觸后，在該復(fù)合物和固相存在的情況下，加入第二抗體。所述(b)步驟在使(a)步驟形成的復(fù)合物與第二抗體接觸后，在該復(fù)合物和第二抗體存在的情況下，加固相。所述(b)步驟在使第二抗體與固相接觸后，在該第二抗體與固相存在的情況下，加入(a)步驟形成的復(fù)合物。所述方法中所述標(biāo)記物為酶。所述第二抗體和固相的結(jié)合是親和素一生物素的結(jié)合或鏈霉親和素一生物素的結(jié)合。所述固相為磁性粒子。所述方法中(b)步驟之后還有測(cè)定固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物的步驟。本發(fā)明另提供一種檢測(cè)標(biāo)本試樣中抗原的方法，包括以下步驟(A)混合標(biāo)本試樣和識(shí)別上述抗原并經(jīng)可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體；6(B)在(A)步驟所得混合物中添加認(rèn)識(shí)固相和上述抗原、并能結(jié)合到固相上的第二抗體；及(C)檢測(cè)通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物。其中所述抗原為甲狀腺刺激激素。(B)步驟可向(A)步驟所得混合物同時(shí)添加固相和第二抗體。(B)步驟可向(A)步驟所得混合物添加固相之后，再添加第二抗體。(B)步驟可向(A)步驟所得混合物添加第二抗體之后，再添加固相。(B)步驟可在固相和第二抗體混合后，再向(A)步驟所得混合物添加固相和第二抗體的混合物。所述標(biāo)記物為酶。所述第二抗體和固相通過(guò)親和素一生物素結(jié)合或鏈霉親和素一生物素結(jié)合而結(jié)合。所述固相為磁性粒子。所述方法，還包含清洗(B)步驟所得混合物的步驟，以除去未起反應(yīng)的第一抗體，在此，(C)步驟檢測(cè)經(jīng)清洗的混合物中通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物。具體實(shí)施例方式在本說(shuō)明書(shū)中，所謂"夾心免疫檢測(cè)法"指通過(guò)固相上的抗體和標(biāo)記物標(biāo)記的抗體兩種抗體檢測(cè)抗原的方法。本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法包含(a)步驟讓抗原與認(rèn)識(shí)該抗原、并經(jīng)可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體接觸，形成抗原一第一抗體復(fù)合物。7上述抗原只要是以檢測(cè)為目的的物質(zhì)即可，無(wú)特別限定，但最好是甲狀腺刺激激素(TSH)。諸如Graves病這種甲狀腺疾病通過(guò)檢測(cè)血樣中的TSH量是否降低來(lái)進(jìn)行診斷。然而，TSH在健康人血液中也只有很少量。而甲狀腺疾病的診斷必須檢測(cè)出TSH量下降。用本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法，就可以高靈敏度地測(cè)定TSH。上述抗原也可以是標(biāo)本試樣中所含抗原。標(biāo)本試樣只要不是妨礙夾心免疫檢測(cè)法的試樣均可，無(wú)特別限定。比如作為含有抗原TSH的標(biāo)本試樣有血液。作為血液，有全血、血漿和血清。認(rèn)識(shí)上述抗原的第一抗體可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體。尤以單克隆抗體為好。第一抗體的類(lèi)型可以是在該
技術(shù)領(lǐng)域：
常用類(lèi)型的抗體，比如IgG、IgM等。第一抗體只要能認(rèn)識(shí)抗原，也包含抗體片段及其衍生物。作為抗體片段如有Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段和sFv片段等。比如，當(dāng)抗原是TSH時(shí)，作為第一抗體可以是抗TSH單克隆抗體抗-TSH5409(MedixBiochemica公司制)?？?TSH5409具有優(yōu)秀的特異性和保存穩(wěn)定性，但對(duì)TSH的親和性不太高。因此，用抗-TSH5409進(jìn)行夾心免疫檢測(cè)時(shí)，難以高靈敏度地檢測(cè)TSH。不過(guò)，用本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法則可以高靈敏度地檢測(cè)出TSH。上述第一抗體可以通過(guò)該
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法獲得。比如已知有一種方法是用檢出的抗原對(duì)馬、牛、羊、兔、山羊、大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫，從免疫的動(dòng)物身上采集血清，提煉抗體。還有一種方法是使從免疫的小鼠身上采集的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與鼠的腫瘤細(xì)胞融合，獲得雜交瘤，從雜交瘤獲得抗體。8上述第一抗體用可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記，標(biāo)記物可以是普通免疫測(cè)定法使用的標(biāo)記物，無(wú)特別限定，比如可以是酶、熒光物質(zhì)和放射性同位素等。作為酶如有堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。作為熒光物質(zhì)如有異硫氰酸熒光素(FITC)、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、螢光素等。作為放射性同位素如有1251、"C、32P等。標(biāo)記物標(biāo)記抗體的方法用該領(lǐng)域常用的方法即可，如眾所周知的用抗體中的硫醇(一SH基)使標(biāo)記物與抗體結(jié)合的方法。具體而言，使導(dǎo)入了可與硫醇基反應(yīng)的官能基的標(biāo)記物與抗體反應(yīng)，即可用標(biāo)記物標(biāo)記抗體。作為官能基如有馬來(lái)酰亞胺基。本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法除上述(a)步驟外，還包括(b)步驟用識(shí)別上述抗原、可與固相結(jié)合的第二抗體將(a)步驟形成的復(fù)合物固定到固相。g卩，抗原比第二抗體先與第一抗體反應(yīng)，形成抗原一第一抗體復(fù)合物。以這種順序進(jìn)行反應(yīng)，即使是標(biāo)本中僅有的微量抗原，也能夠靈敏地檢測(cè)出來(lái)。還可以延長(zhǎng)第一抗體與抗原的反應(yīng)時(shí)間。因此，盡管第一抗體與抗原的親和性低，也能夠使第一抗體與抗原充分結(jié)合。其結(jié)果，能夠在較短的測(cè)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高靈敏度的測(cè)定。識(shí)別上述抗原并能與固相結(jié)合的第二抗體可以在不同于第一抗體的位點(diǎn)(表位)識(shí)別抗原。第二抗體與第一抗體一樣，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，最好是單克隆抗體。第二抗體的類(lèi)型可以用該
技術(shù)領(lǐng)域：
常用的類(lèi)型，如IgG、IgM等。且第二抗體只要能識(shí)別抗原，也可含有抗體的片段及其衍生物。作為抗體的片段如有Fab片段、F(ab)2片段、Fab'片段及sFv片段等。獲得第二抗體的方法也與以上關(guān)于第一抗體的敘述一樣。當(dāng)抗原是TSH時(shí)，作為第二抗體最好是以NITEBP—399托管的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。該雜交瘤于2007年8月21日以保藏號(hào)NITEBP—399由日本國(guó)家技術(shù)評(píng)估研究所專(zhuān)利微生物寄存中心(NPMD)保存，系由用TSH免疫的BALB/C鼠脾臟細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞(P3-X63-Ag8-653)融合而得。上述第二抗體可與固相結(jié)合。第二抗體與固相之間的結(jié)合是通過(guò)附加在該第二抗體的固相結(jié)合物與結(jié)合在固相上的結(jié)合物之間的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于上述固相結(jié)合物與結(jié)合物無(wú)特別限定，只要是在上述夾心免疫檢測(cè)法實(shí)施的條件下能特異性結(jié)合的物質(zhì)組合即可。作為這些組合，如有生物素與親和素或鏈霉親和素、半抗原和抗半抗原抗體、鎳和組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽和谷胱甘肽一S—轉(zhuǎn)移酶等。作為半抗原和抗半抗原抗體如有二硝基酚鈉(DNP)和抗DNP抗體。i',上述第二抗體與固相之間最好通過(guò)生物素與親和素或鏈霉親和素結(jié)合而結(jié)合。因此，固相結(jié)合物與結(jié)合物的組合最好是生物素與親和素或鏈霉親和素的組合。用于上述固相結(jié)合物與結(jié)合物組合的各種物質(zhì)哪一個(gè)附加到第二抗體均可。最好是固相結(jié)合物含生物素，結(jié)合物為親和素或鏈霉親和素。將固相結(jié)合物附加到第二抗體的方法是該領(lǐng)域中眾所周知的。比如，可以將含有對(duì)抗體中的一級(jí)氨基(一NH2基)和硫醇基等有反應(yīng)性的基的固相結(jié)合物附加到抗體上。作為與一級(jí)氨基有反應(yīng)性的基如有琥珀酰亞胺基(NHS基)等，作為與硫醇基有反應(yīng)的基如有馬來(lái)酰胺基等。上述固相材料是免疫測(cè)定用的普通固相材料即可，無(wú)特別限定。比如可以是膠乳、橡膠、聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯樹(shù)脂、苯乙烯一丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯一甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、丙烯醛一乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物、聚偏氟乙烯(PVDF)、硅等聚合物材料；瓊脂糖；明膠；紅細(xì)胞；硅膠、玻璃、無(wú)活性礬土、磁體等無(wú)機(jī)材料等。也可以將其中的一種或二種以上組合起來(lái)使用。固相的形狀只要是用于免疫測(cè)定的普通固相形狀，無(wú)特別限定，可以是微量滴定板、試管、微球、粒子、納米粒子等。作為粒子如有磁性粒子、象苯乙烯樹(shù)脂膠乳那樣的疏水性粒子、粒子表面有氨基、羧基等親水基的共聚膠乳粒子、紅細(xì)胞、明膠粒子等。上述固相最好是磁性粒子。該磁性粒子是以有磁性的材料為基材的粒子。這種磁性粒子在該
技術(shù)領(lǐng)域：
已周知，作為基材已知使用Fe203及/或Fe304、鈷、鎳、鐵酸鹽、磁鐵礦等。為了使蛋白質(zhì)等結(jié)合到磁性粒子表面，最好使用用聚合物等包被基材表面的磁性粒子。讓上述結(jié)合物結(jié)合在固相上的方法為在該
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的方法。該固定可采用物理吸附法、共有結(jié)合法、離子結(jié)合法和這些方法的組合等。如當(dāng)結(jié)合物為親和素或鏈霉親和素時(shí)，用生物素結(jié)合的固相即可將親和素或鏈霉親和素固定在固相上。上述(b)步驟最好以下述四種方式之一進(jìn)行。(bl)讓(a)步驟中形成的復(fù)合物與上述第二抗體和固相接觸；(b2)讓(a)步驟中形成的復(fù)合物與固相接觸后，再在該復(fù)合物和固相都存在的情況下添加第二抗體；(b3)讓(a)步驟中形成的復(fù)合物與上述第二抗體接觸后，在該復(fù)合物和第二抗體都存在的情況下添加固相；(b4)讓上述第二抗體與固相接觸后，再在該第二抗體和固相都存在的情況下添加(a)步驟中形成的復(fù)合物。上述各種情況下可能出現(xiàn)的反應(yīng)如下(bl)讓(a)步驟中形成的復(fù)合物與上述第二抗體和固相接角蟲(chóng)讓(a)步驟中形成的復(fù)合物同時(shí)與上述第二抗體和上述固相接觸。以此，第二抗體與抗原一第一抗體的復(fù)合物結(jié)合形成第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物后與固相結(jié)合，從而得以在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。第二抗體也可以與固相結(jié)合后，與抗原-第一抗體的復(fù)合物結(jié)合，形成第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物。(b2)使(a)步驟中形成的復(fù)合物與固相接觸后，在該復(fù)合物和固相都存在的情況下添加第二抗體使(a)步驟中形成的抗原—第一抗體復(fù)合物與固相接觸。此時(shí)，抗原-第一抗體復(fù)合物沒(méi)有與固相的結(jié)合位點(diǎn)。因此，抗原-第一抗體復(fù)合物與固相之間不發(fā)生反應(yīng)。接著提供第二抗體。于是，第二抗體與抗原-第一抗體復(fù)合物結(jié)合后，與固相結(jié)合，從而在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。第二抗體也可以與固相結(jié)合后，再與抗原-第一抗體復(fù)合物結(jié)合，從而在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。(b3)使(a)步驟中形成的復(fù)合物與上述第二抗體接觸后，再在該復(fù)合物和第二抗體都存在的情況下添加固相通過(guò)使(a)步驟中形成的抗原一第一抗體復(fù)合物與第二抗體接觸，形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。然后，提供固相，即可將第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物固定在固相上。(b4)讓第二抗體與固相接觸后，再在該第二抗體和固相都存在的情況下添加(a)步驟中形成的復(fù)合物由于第二抗體與固相接觸，第二抗體的全部或部分結(jié)合到固相上。再添加(a)步驟中形成的復(fù)合物，由此，結(jié)合在固相上的第二抗體與復(fù)合物結(jié)合，得以在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。未結(jié)合到固相的第二抗體與抗原-第一抗體復(fù)合物結(jié)合，形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物后，此復(fù)合物通過(guò)第二抗體結(jié)合到固相，從而也能夠在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體的復(fù)合物。本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法最好在固相上形成第一抗體-抗原-第二抗體復(fù)合物后，還有(c)步驟，即測(cè)定通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體的標(biāo)記物。第一抗體標(biāo)記物的測(cè)定方法可根據(jù)標(biāo)記物的種類(lèi)適當(dāng)選擇。比如，當(dāng)標(biāo)記物為放射性同位素時(shí)，可以用測(cè)定放射能的方法，該方法應(yīng)用閃爍計(jì)數(shù)器等眾所周知的儀器。當(dāng)標(biāo)記物為熒光物質(zhì)時(shí)，可以使用用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀等眾所周知的儀器測(cè)定熒光的方法。當(dāng)標(biāo)記物為酶時(shí)，可以用催化與該酶相應(yīng)的底物反應(yīng)、測(cè)定其所發(fā)出的光或色的方法。作為該酶的相應(yīng)底物，可以使用眾所周知的發(fā)光底物、顯色底物等。當(dāng)上述酶為堿性磷酸酶時(shí)，比如發(fā)光底物有CDP-star(注冊(cè)商標(biāo))(4-氯-3-(甲氧基螺(l，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2，-(5，-氯)三環(huán)[3.3丄13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉)、CSPD(注冊(cè)商標(biāo))(3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2-(5，-氯)三環(huán)[3.3丄13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉)等；顯色底物有P-硝基苯基磷酸鹽、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)、硝基藍(lán)四氮唑(NBT)、碘硝基四唑(INT)等。這些發(fā)光底物或顯色底物可以用分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀等眾所周知的儀器檢測(cè)。上述(b)步驟之后，可以含清洗步驟。通過(guò)清洗可以除去未起反應(yīng)的第一抗體。如固相是磁性粒子時(shí)，在(a)步驟和(b)步驟中所得含磁性粒子的試樣中加入清洗劑攪拌。然后，在用磁力吸住磁性粒子的狀態(tài)下，去除清洗劑，即可除去未起反應(yīng)的第一抗體。清洗劑可以使用在該
技術(shù)領(lǐng)域：
周知的清洗劑。比如，可以使用2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液(MES)、磷酸鹽緩沖液(PBS)等緩沖液。作為緩沖液的pH最好是pH6.010.0。清洗劑可以含有Tween20等表面活性劑。加入100700pL清洗劑攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗處理進(jìn)行四次。上述夾心免疫檢測(cè)法可以在普通免疫測(cè)定的條件下進(jìn)行。所謂普通免疫測(cè)定的條件下指pH6.010.0，溫度3045°C。上述pH可以用比如磷酸鹽緩沖液(PBS)、三乙醇胺鹽酸鹽緩沖液(TEA)、三羥甲基氨基甲垸(Tris)鹽酸緩沖液(Tris-HCl)調(diào)節(jié)。該緩沖液也可含有表面活性劑、保存劑、血清蛋白質(zhì)等普通免疫測(cè)定中使用的成份。在上述各步驟中讓各成份接觸的時(shí)間可以依所測(cè)抗原、所用抗體、固相等的種類(lèi)適當(dāng)設(shè)定。所用第一抗體、第二抗體和固相的量也可依所測(cè)抗原、所用抗體、固相等的種類(lèi)適當(dāng)設(shè)定。本發(fā)明的抗原檢測(cè)方法是一種從標(biāo)本試樣中檢測(cè)抗原的方法。本發(fā)明的抗原檢測(cè)方法包括以下步驟(A)步驟混合標(biāo)本試樣和識(shí)別上述抗原并經(jīng)可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體；(B)步驟在(A)步驟所得混合物中添加識(shí)別固相和上述抗原并可與固相結(jié)合的第二抗體；及(C)步驟檢測(cè)固定在固相上的第一抗體的標(biāo)記物。(A)步驟相當(dāng)于上述夾心免疫檢測(cè)法的(a)步驟。g卩，當(dāng)標(biāo)本試樣中存在待測(cè)抗原時(shí)，標(biāo)本試樣與第一抗體接觸。以此形成抗原與第一抗體的復(fù)合物。(B)步驟相當(dāng)于上述夾心免疫檢測(cè)法的(b)步驟。g卩，當(dāng)在(A)步驟形成抗原與第一抗體的復(fù)合物時(shí)，抗原和第一抗體復(fù)合物通過(guò)第二抗體固定在固相上。(B)步驟最好采取以下四種方法其中的一種(Bl)在(A)步驟中形成的復(fù)合物中同時(shí)添加固相和第二抗體；(B2)在(A)步驟形成的復(fù)合物中添加固相后，再添加第二抗體；(B3)在(A)步驟中形成的復(fù)合物添加第二抗體后，再添加固相；(B4)混合第二抗體與固相后，在(A)步驟形成的復(fù)合物中添加固相和第二抗體的混合物。(Bl)~(B4)的反應(yīng)與上述(bl)~(b4)的反應(yīng)相同。即，(Bl)的反應(yīng)相當(dāng)于(bl)的反應(yīng)。(B2)的反應(yīng)相當(dāng)于(b2)的反應(yīng)。(B3)的反應(yīng)相當(dāng)于(b3)的反應(yīng)。(B4)的反應(yīng)相當(dāng)于(b4)的反應(yīng)。(C)步驟相當(dāng)于上述夾心免疫檢測(cè)法的(c)步驟。當(dāng)標(biāo)本試樣中存在待測(cè)抗原時(shí)，第一抗體一抗原一第二抗體復(fù)合物固定在固相上。因此，檢測(cè)通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物即可檢測(cè)標(biāo)本試樣中的抗原。在(B)步驟之后最好還有清洗固相的步驟。通過(guò)清洗可以從(B)步驟獲得的混合物中除去未起反應(yīng)的第一抗體。清洗步驟中使用的清洗劑與上述清洗劑相同。如此即可在(C)步驟中從除去未反應(yīng)的第一抗體的混合物中檢測(cè)出通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體的標(biāo)記物。舉例下面用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不受以下實(shí)施例限制。(生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體的制備)用作生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體的單克隆抗體用以下方法制作。將10100嗎TSH溶于0.5mlPBS，添力口0.5mlFCA(DIFCO公司制)作為佐劑，制備油包水型基礎(chǔ)免疫用抗原。給BALB/C小鼠腹腔接種基礎(chǔ)免疫用抗原。腹腔接種每2~4周進(jìn)行數(shù)次。使用的是IOO嗎TSH溶解于lmlPBS中的加強(qiáng)用抗原。以10:1的比例混合免疫BALB/C小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(P3-X63-Ag8-653)。然后注入50%聚乙二醇液lml，室溫?cái)嚢?分鐘。再邊繼續(xù)攪拌，邊用2~5分鐘逐漸加入MEM培養(yǎng)基510ml。清洗后，使融合的細(xì)胞以3.5xl()S個(gè)/ml浮游于HAT培養(yǎng)基，以平均每孔lOOpl分注到96孔微量培養(yǎng)板。觀(guān)察雜交瘤的增殖，適當(dāng)增加HAT培養(yǎng)基，培養(yǎng)二周左右。將培養(yǎng)上清加入感作TSH—p鏈的抗原感作板，用ELISA(酶聯(lián)免疫測(cè)定法)選擇產(chǎn)生識(shí)別TSH—p鏈的抗TSH單克隆抗體的雜交瘤?？寺∷x雜交瘤，建立細(xì)胞株T2-194(NITEBP-399)。培養(yǎng)T2-194，用蛋白質(zhì)A純化培養(yǎng)上清，以此獲得單克隆抗體。將所得單克隆抗體按常法與生物素一馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)，獲得生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體。實(shí)施例1用本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法，按以下步驟測(cè)定甲狀腺剌激激素(TSH)。按以下順序用抗體緩沖液(0.1MMES(2-氮氧六環(huán)乙磺酸)(pH6.0)、1%牛血清白蛋白、0.15MNaCl、0.1%疊氮鈉)稀釋抗體。1)在反應(yīng)容器中加入堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗TSH單克隆抗體(0.4U/mL、MedixBiochemica公司制)30pL作為標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體，加入TSH抗原溶液(濃度0或2jilU/mL、Fitzgerald公司制)30nL作為試樣，42'C反應(yīng)2分鐘。2)添加鏈酶親和素磁性粒子(平均粒子2|um、在20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中10mg/mL)30pL，42。C反應(yīng)2.5分鐘。3)作為能與固相結(jié)合的第二抗體添加上述生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體(10pg/mL)30pL，42°C反應(yīng)2.5分鐘后，進(jìn)行磁分離。4)加入清洗劑(0.01MMES(pH6.5)、0.1%疊氮鈉)10070(VL攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。5)加入分散液(0.01MMES(pH6.5)、0.1%疊氮鈉)50pL，分散鏈酶親和素磁性粒子。6)加入發(fā)光底物液(CDP-Star，AppliedBiosystems公司)10(HiL，攪拌，42E反應(yīng)5分鐘，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。比較例1按以下順序用傳統(tǒng)的夾心法測(cè)定TSH。1)在反應(yīng)容器中加入生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體(IO嗎/mL)30pL作為在上述制作生物素標(biāo)記抗TSH單克隆抗體步驟中獲得的能與固相結(jié)合的抗體，并作為試樣加入TSH抗原溶液(濃度0或2pIU/mL)30pL，42。C反應(yīng)2分鐘。2)添加鏈酶親和素磁性粒子(平均粒子2pm、20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中10mg/mL)30pL，42。C反應(yīng)2.5分鐘。3)加入堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記抗TSH單克隆抗體(0.4U/mL、MedixBiochemica公司制)，42°C反應(yīng)2.5分鐘后，進(jìn)行磁分離。4)加入清洗劑10070(HiL攪拌，進(jìn)行磁分離。此清洗操作共進(jìn)行4次。5)加入5(HiL分散液攪拌，分散鏈酶親和素磁性粒子。6)加入發(fā)光底物液(CDP-Star，AppliedBiosystems公司)100pL，攪拌，42"C反應(yīng)5分鐘，用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。用含TSH的試樣測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度及用含TSH的試樣測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度與用不含TSH的試樣測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度之比〈信/噪比；S/N比)如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從表l可以看出，用本發(fā)明的夾心免疫檢測(cè)法，用含TSH的試樣測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度增高，S/N比也增高。前述的詳細(xì)說(shuō)明及附圖是通過(guò)文字解釋和圖示來(lái)進(jìn)行的，其目的不在于限定權(quán)利要求的保護(hù)范圍。本說(shuō)明書(shū)中的具體實(shí)施方式的各個(gè)變種對(duì)于普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)，并處于權(quán)利要求及其等同技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種夾心免疫檢測(cè)法，包括以下步驟(a)讓抗原與可識(shí)別所述抗原的并由可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體接觸，形成抗原和第一抗體的復(fù)合物；及(b)用可識(shí)別所述抗原的并可結(jié)合到固相上的第二抗體將所述(a)步驟中形成的復(fù)合物固定到固相。2.權(quán)利要求l所述方法，其特征在于所述抗原為甲狀腺刺激激素。3.權(quán)利要求l所述方法，其特征在于實(shí)施所述(b)步驟使得在(a)步驟形成的復(fù)合物、抗體與固相三者接觸。4.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于實(shí)施所述(b)步驟使得在使(a)步驟形成的復(fù)合物與固相接觸后并在所述復(fù)合物和固相存在的情況下，加入第二抗體。5.權(quán)利要求l所述方法，其特征在于實(shí)施所述(b)步驟使得在使(a)步驟形成的復(fù)合物與第二抗體接觸后并在所述復(fù)合物和第二抗體存在的情況下，加固相。6.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于實(shí)施所述(b)步驟使得在使第二抗體與固相接觸后并在該第二抗體與固相存在的情況下，加入(a)步驟形成的復(fù)合物。7.權(quán)利要求16中任一所述方法，其特征在于所述標(biāo)記物為酶。8.權(quán)利要求1~6中任一所述方法，其特征在于所述第二抗體和固相的結(jié)合是親和素一生物素的結(jié)合或鏈霉親和素一生物素的結(jié)合。9.權(quán)利要求1~6中任一所述方法，其特征在于所述固相是磁性粒子。10.權(quán)利要求16中任一所述方法，其特征在于(b)步驟之后還有測(cè)定固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物的步驟。11.一種檢測(cè)標(biāo)本試樣中的抗原的方法，包括以下步驟(A)混合標(biāo)本試樣和可識(shí)別所述抗原的并由可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體；(B)添加固相和可識(shí)別所述抗原的并能結(jié)合到固相上的第二抗體到在(A)步驟所得混合物中；及(c)檢測(cè)通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物。12.權(quán)利要求ll所述方法，其特征在于所述抗原為甲狀腺刺激激素。13.權(quán)利要求ll所述方法，其特征在于實(shí)施(B)步驟使得向(A)步驟所得混合物中同時(shí)添加固相和第二抗體。14.權(quán)利要求ll所述方法，其特征在于實(shí)施(B)步驟使得向(A)步驟所得混合物中添加固相之后，再添加第二抗體。15.權(quán)利要求ll所述方法，其特征在于實(shí)施(B)步驟使得向(A)步驟所得混合物添加第二抗體之后，再添加固相。16.權(quán)利要求11所述方法，其特征在于實(shí)施(B)步驟使得在混合固相和第二抗體后，向(A)步驟所得混合物添加固相和第二抗體的混合物。17.權(quán)利要求1116中任一所述方法，其特征在于所述標(biāo)記物為酶。18.權(quán)利要求1116中任一所述方法，其特征在于所述第二抗體和固相通過(guò)親和素一生物素結(jié)合或鏈霉親和素一生物素結(jié)合而結(jié)合。19.權(quán)利要求1116中任一所述方法，其特征在于所述固相為磁性粒子。20.權(quán)利要求11~16中任一所述方法，其特征在于還包含清洗在(B)步驟所得混合物的步驟，以除去未起反應(yīng)的第一抗體，其中在(c)步驟檢測(cè)已清洗的混合物中的通過(guò)第二抗體和抗原固定在固相上的第一抗體標(biāo)記物。全文摘要本發(fā)明提供一種夾心免疫檢測(cè)法及用該法檢測(cè)抗原的方法。夾心免疫檢測(cè)法包括以下步驟(a)讓抗原與識(shí)別上述抗原并由可測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記的第一抗體接觸，形成抗原和第一抗體的復(fù)合物；及(b)用識(shí)別上述抗原并可結(jié)合到固相上的第二抗體將上述(a)步驟中形成的復(fù)合物固定到固相。文檔編號(hào)G01N33/53GK101435825SQ20081014885公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者松江美幸,藤本裕之申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社