專利名稱：：一種水滑石納米片修飾的dna敏感電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種水滑石納米片修飾的DNA敏感電極及其制備方法。技術(shù)背景電化學(xué)生物傳感器具有性能穩(wěn)定、價格低廉、操作簡便、易微型化等特點(diǎn)，已在臨床診斷、工業(yè)控制、食品檢測、藥物分析、環(huán)境分析、生物芯片和軍事領(lǐng)域等諸多方面得到廣泛應(yīng)用。其中電化學(xué)DNA傳感器在近幾年備受關(guān)注，已不局限于基因序列的測試，更在藥物分析、污染物測試等發(fā)面得到較大的發(fā)展，是當(dāng)前電化學(xué)生物傳感器研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。如在文獻(xiàn)(l)BiosensorsandBioelectronics，2006，21:1777-1783中，KavitaArora等人利用電沉積方法將聚吡咯-聚乙烯磺酸鹽復(fù)合物在氧化銦錫導(dǎo)電玻璃上成膜，然后將小牛胸腺雙鏈DNA(簡記為ds-DNA)通過物理吸附方法固定在膜上構(gòu)成DNA敏感電極。該DNA敏感電極可用于鄰氯苯酚的檢領(lǐng)U，其線性范圍為0.1-30ppm，說明DNA敏感電極可用于有機(jī)小分子的定量檢測。但電化學(xué)DNA傳感器存在DNA固定量小、易泄露且抗干擾性較差等問題。為了解決上述問題，人們將納米材料引入電化學(xué)DNA生物傳感器體系，利用納米材料的比表面積大、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)異性質(zhì)，提高DNA敏感電極的穩(wěn)定性、靈敏度等性能指標(biāo)。到目前為止，已有多種納米材料應(yīng)用于DNA敏感電極的制備，如納米Au、納米Si、納米Ce02等。在文獻(xiàn)(2)Talanta，2006，70:561-565中，Ke-JunFeng等人將納米Ce02與殼聚糖復(fù)合物在玻碳電極表面成膜，繼而在膜上固定單鏈DNA(簡記為ss-DNA)，制備出檢測直腸癌DNA片段的DNA敏感電極。研究結(jié)果表明納米Ce02的引入增強(qiáng)了膜的導(dǎo)電性和ss-DNA的固定效果，提高了DNA敏感電極的靈敏度和識別錯配能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供種水滑石納米片修飾的DNA敏感電極及其制備方法，將水滑石納米片引入DNA敏感電極中。水滑石納米片比表面積大，帶有高密度正電荷，可與DNA帶有負(fù)電荷的磷酸骨架形成較強(qiáng)的靜電作用，有利于DNA的吸附固定；鈷鋁水滑石納米片具有良好導(dǎo)電性，有利于提高DNA敏感電極的靈敏度；水滑石納米片表面富含羥基，可以通過氫鍵與DNA發(fā)生相互作用，因此水滑石納米片作為固定材料具有良好的生物相容性。本發(fā)明提供的水滑石納米片修飾的DNA敏感電極，是以玻碳電極為基底電極，由雙鏈DNA(簡記為ds-DNA)和鈷鋁水滑石納米片構(gòu)成敏感膜修飾在基底電極表面，其中ds-DNA的含量為2.1~4.2ng/mm2，鈷鋁水滑石納米片的含量為1.4~5.6(ag/mm2;所述ds-DNA為鯡魚精子DNA或鮭魚精子DNA中的一種。本發(fā)明制備水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的具體步驟如下(1)水滑石納米片溶膠的制備按照Co/Al摩爾比為2:14:1的比例稱取Co(N03)2.6H20和A1(N03)3.9H20，溶解于去離子水中配成金屬離子(Co+Al)總濃度為1.5~1.8mol/L的鹽溶液；稱取NaOH溶解于去離子水中配成濃度為2.83.5mol/L的堿溶液；將上述鹽溶液和堿溶液同時加入轉(zhuǎn)數(shù)為300-1000轉(zhuǎn)/分鐘的膠體磨中返混1~2分鐘，得到粉紅色懸浮液；將懸浮液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于90-100°<:晶化6~8小時，抽濾，洗滌至濾液pH值為6-7，然后將濾餅放入烘箱中于50-80°C干燥12-48小時，研磨即得鈷鋁水滑石粉末。按照水滑石質(zhì)量/甲酰胺體積為0.5~2g/L的比例將上述鈷鋁水滑石粉體加入到甲酰胺中，于70~90。C恒溫攪拌0.5-3小時，可獲得澄清溶液，即為水滑石納米片溶膠。(2)水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的制備按1.4~5.6)ag/mn^的用量取上述水滑石納米片溶膠滴涂于潔凈玻碳電極表面，在2035°<:干燥后用二次蒸餾水沖洗、晾干；將鯡魚精子或鮭魚精子ds-DNA用二次蒸餾水配制成濃度為0.5-1g/L的溶液，再按2.1~4.2ng/mm2的用量取該DNA溶液滴涂在水滑石納米片層上，2035°(3干燥并用二次蒸餾水沖洗、晾干，即得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。本發(fā)明所述的二次蒸餾水為經(jīng)過兩次蒸餾的蒸餾水。本發(fā)明的效果可以從用本發(fā)明方法制備的水滑石納米片修飾的DNA敏感電極測試苯酚看出。將水滑石納米片修飾的DNA敏感電極作為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，組成電化學(xué)DNA傳感器。將該電化學(xué)DNA傳感器的三電極體系置于以亞甲基藍(lán)為指示劑的Tris-HCl緩沖溶液中，采用上海辰華儀器公司的CHI660B電化學(xué)工作站對其進(jìn)行電化學(xué)性能的表征。玻碳電極、水滑石納米片修飾玻碳電極、固定了DNA的玻碳電極及固定了DNA的水滑石納米片修飾玻碳電極等四種工作電極的循環(huán)伏安曲線如圖1所示，水滑石納米片的引入，有效地增強(qiáng)了DNA敏感電極在含有亞甲基藍(lán)指示劑的Tris-HCl緩沖溶液中的電流響應(yīng)，表明水滑石納米片對提高DNA敏感電極的靈敏度具有重要作用。水滑石納米片修飾的DNA敏感電極可以對苯酚進(jìn)行檢測，對幾種在煉油污水和化工污水中常見的干擾苯酚測試的物質(zhì)有良好的抗干擾能力，干擾誤差均小于5%(如表1所示)。水滑石納米片修飾的DNA敏感電極測試苯酚的線性響應(yīng)范圍為4xl0—6~2xl0—5mol/L(見圖2)，對苯酚的最低檢出限為2xl(^mol/L。水滑石納米片修飾的DNA敏感電極具有廣泛的適應(yīng)性，在pH值511的范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)對苯酚的定量測定(見圖3)，特別是較適宜在偏堿性環(huán)境下使用。水滑石納米片修飾的DNA敏感電極在測試苯酚的過程不破壞已固定的DNA，可以反復(fù)使用，連續(xù)測試相同濃度苯酚20次以上，所得數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%，表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性。表1.水滑石納米片修飾的DNA敏感電極測試苯酚時的抗干擾性<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的特點(diǎn)是采用本發(fā)明方法制備的水滑石納米片修飾的DNA敏感電極可以對煉油污水及化工污水中的苯酚進(jìn)行定量檢測，并具有較強(qiáng)的抗干擾性、較寬的線性響應(yīng)范圍、較高的檢測靈敏度、較寬的pH值適用范圍、良好的操作穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性(見實(shí)施例)。此外采用本發(fā)明方法制備水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的工藝簡單，生產(chǎn)成本較低。圖1為玻碳電極、水滑石納米片修飾玻碳電極、固定了DNA的玻碳電極及固定了DNA的水滑石納米片修飾玻碳電極等四種工作電極的循環(huán)伏安曲線。其中，橫坐標(biāo)一電壓，單位伏特，參比電極為Ag/AgCl電極；縱坐標(biāo)一電流密度，單位微安/平方厘米。圖la—玻碳電極的循環(huán)伏安曲線；圖lb—水滑石納米片修飾的玻碳電極的循環(huán)伏安曲線；圖lc一固定了DNA的玻碳電極的循環(huán)伏安曲線；圖Id—固定了DNA的水滑石納米片修飾的玻碳電極的循環(huán)伏安曲線。圖2為水滑石納米片修飾的DNA敏感電極在以20(amol/L的亞甲基藍(lán)為指示劑的50mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液中的循環(huán)伏安測試的電流響應(yīng)與苯酚濃度的關(guān)系圖。其中，橫坐標(biāo)一苯酚濃度，單位微摩爾/升；縱坐標(biāo)一電流密度，單位微安/平方厘米。圖3為水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的循環(huán)伏安電流響應(yīng)與pH值的關(guān)系圖。其中，橫坐標(biāo)一pH值；縱坐標(biāo)一電流密度，單位微安/平方厘米。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1)水滑石納米片溶膠的制備稱取0.12mol的Co(N03)2.6H20和0.06mol的A1(N03)3.9H20溶于100mL去離子水中配成鹽溶液；稱取0.35mol的NaOH溶于100mL去離子水中配成堿溶液。將堿溶液和鹽溶液同時加入轉(zhuǎn)數(shù)為400轉(zhuǎn)/分鐘的膠體磨中返混2分鐘，得到粉紅色懸浮液；將懸浮液迅速轉(zhuǎn)移至四口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于10(TC晶化6小時，抽濾，洗滌至濾液pH值為6，然后將濾餅放入烘箱中于50。C干燥48小時，研磨即得Co/Al摩爾比為2:1的鈷鋁水滑石粉末。取該鈷鋁水滑石0.025g，加入到50mL甲酰胺中，在磁力攪拌器上，90。C恒溫攪拌0.5小時即可得到濃度為0.5g/L的水滑石納米片溶膠。(2)水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的制備將濃度為0.5g/L的水滑石納米片溶膠20pL滴涂在直徑為3mm的潔凈的玻碳電極表面，在2(TC下干燥后用二次蒸餾水沖洗、晾干；將鯡魚精子ds-DNA用二次蒸餾水配制濃度為0.5g/L的溶液，然后將該DNA溶液30)iL滴涂在水滑石納米片修飾的玻碳電極表面，20°C下干燥并用二次蒸餾水沖洗、晾干，即制得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。以水滑石納米片修飾的DNA敏感電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為25±3°C，測試體系為pl^7.5的20jamol/LMB~50mmol/LTris-HCl緩沖溶液。循環(huán)伏安測試表明，水滑石納米片的引入，有效地增強(qiáng)了DNA敏感電極在含有亞甲基藍(lán)指示劑的Tris-HCl緩沖溶液中的電流響應(yīng)(如圖l所示)；采用循環(huán)伏安法檢測水滑石納米片修飾的DNA敏感電極對苯酚的響應(yīng)，苯酚濃度與電流響應(yīng)的關(guān)系曲線如圖2所示，其線性范圍為4xl(T6~2xl(r5mol/L，檢出限為2xl0—6mol/L;將該DNA敏感電極對濃度為lx10—5mol/L的苯酚溶液連續(xù)進(jìn)行20次測試，所得數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為i.2%，操作穩(wěn)定性優(yōu)良；當(dāng)鄰苯三酚、間苯二酚、e-蒽酚、苯胺及硫化鈉與苯酚濃度比為1:1時，干擾誤差均小于5%(見表1所示)。該電極保存10個月后電流響應(yīng)為初始值的59%。實(shí)施例2(1)水滑石納米片溶膠的制備稱取0.12mol的Co(N03)2.6H20和0.04mol的A1(N03)3.9H20溶于100mL去離子水中配成鹽溶液；稱取0.31mol的NaOH溶于100mL去離子水中配成堿溶液。將堿溶液和鹽溶液同時加入轉(zhuǎn)數(shù)為700轉(zhuǎn)/分鐘的膠體磨中返混1.5分鐘，得到粉紅色懸浮液；將懸浮液迅速轉(zhuǎn)移至四口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于90。C晶化7小時，抽濾，洗滌至濾液pH值為6.5，然后將濾餅放入烘箱中于70°C干燥24小時，研磨即得Co/Al摩爾比為3:1的鈷鋁水滑石粉末。取該鈷鋁水滑石0.05g,加入到50mL甲酰胺中，在磁力攪拌器上，80°C恒溫攪拌2小時即可得到濃度為1g/L的水滑石納米片溶膠。(2)水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的制備將濃度為1g/L的水滑石納米片溶膠20滴涂在直徑為3mm的潔凈的玻碳電極表面，在25T下干燥后用二次蒸餾水沖洗、晾干；將鯡魚精子ds-DNA用二次蒸餾水配制濃度為0.8g/L的溶液，然后將該DNA溶液20^tL滴涂在水滑石納米片修飾的玻碳電極表面，25。C下千燥并用二次蒸餾水沖洗、晾干，即制得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為25±3°C，實(shí)驗(yàn)體系為20)amol/LMB~50mmol/LTris-HCl緩沖溶液。循環(huán)伏安曲線電流響應(yīng)值與pH變化的關(guān)系說明，水滑石納米片修飾的DNA敏感電極具有廣泛的適應(yīng)性，在pH值511的范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)對苯酚的定量測定(見圖3);該電極保存6個月后響應(yīng)為初始值的65%。實(shí)施例3(1)水滑石納米片溶膠的制備稱取0.12mol的Co(N03)2-6H20和0.03mol的A1(N03)3'9H20溶于100mL去離子水中配成鹽溶液；稱取0.29mol的NaOH溶于100mL去離子水中配成堿溶液。將堿溶液和鹽溶液同時加入轉(zhuǎn)數(shù)為1000轉(zhuǎn)/分鐘的膠體磨中返混1分鐘，得到粉紅色懸浮液；將懸浮液迅速轉(zhuǎn)移至四口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于95°(:晶化8小時，抽濾，洗滌至濾液pH值為7，然后將濾餅放入烘箱中于80T干燥12小時，研磨即得Co/Al摩爾比為4:1的鈷鋁水滑石粉末。取該鈷鋁水滑石O.lg，加入到50mL甲酰胺中，在磁力攪拌器上，70°C恒溫攪拌3小時即可得到濃度為2g/L的水滑石納米片溶膠。(2)水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的制備將濃度為2g/L的水滑石納米片溶膠20pL滴涂在直徑為3mm的潔凈的玻碳電極表面，在35。C下干燥后用二次蒸餾水沖洗、晾干；將鮭魚精子ds-DNA用二次蒸餾水配制濃度為1g/L的溶液，然后將該DNA溶液30)aL滴涂在水滑石納米片修飾的玻碳電極表面，35。C下干燥并用二次蒸餾水沖洗、晾干，即制得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。以修飾玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極，實(shí)驗(yàn)溫度為25±3。C，測試體系為pH=8.5的20pmol/LMB-50mmol/LTris-HCl緩沖溶液。循環(huán)伏安法檢測水滑石納米片修飾的DNA敏感電極對苯酚的響應(yīng)，其線性范圍為4x10—6~2x1(T5mol/L,檢出限為2x1(T6mol/L;將該DNA敏感電極對濃度為1x1(T5mol/L的苯酚溶液連續(xù)進(jìn)行20次測試，所得數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%，操作穩(wěn)定性優(yōu)良；當(dāng)鄰苯三酚、間苯二酚、P-蒽酚、苯胺及硫化鈉與苯酚比為1:1時，干擾誤差均小于5%。該電極保存5個月后響應(yīng)為初始值的66%。權(quán)利要求1.一種水滑石納米片修飾的DNA敏感電極，其特征在于，以玻碳電極為基底電極，由雙鏈DNA和鈷鋁水滑石納米片構(gòu)成敏感膜修飾在基底電極表面，其中雙鏈DNA的含量為2.1～4.2μg/mm2，鈷鋁水滑石納米片的含量為1.4～5.6μg/mm2；所述雙鏈DNA為鯡魚精子DNA或鮭魚精子DNA中的一種。2、一種制備權(quán)利要求1所述的DNA敏感電極的方法，其特征在于，工藝步驟為(1)水滑石納米片溶膠的制備按照Co/Al摩爾比為2:14:1的比例稱取Co(N03)2.6H20和A1(N03)3.9H20，溶解于去離子水中配成金屬離子(Co+Al)總濃度為1.51.8mol/L的鹽溶液；稱取NaOH溶解于去離子水中配成濃度為2.8~3.5mol/L的堿溶液；將上述鹽溶液和堿溶液同時加入轉(zhuǎn)數(shù)為300~1000轉(zhuǎn)/分鐘的膠體磨中返混1~2分鐘，得到粉紅色懸浮液；將懸浮液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于90~100eC晶化6~8小時，抽濾，洗滌至濾液pH值為6~7，然后將濾餅放入烘箱中于50-80°C干燥12~48小時，研磨得鈷鋁水滑石粉末；按照水滑石質(zhì)量/甲酰胺體積為0.5~2g/L的比例將上述鈷鋁水滑石粉末加入到甲酰胺中，于70-90。C恒溫攪拌0.5-3小時，獲得澄清溶液，為水滑石納米片溶膠；(2)水滑石納米片修飾的DNA敏感電極的制備按1.4~5.6ng/mn^的用量取上述水滑石納米片溶膠滴涂于潔凈玻碳電極表面，在2035。C下干燥后用二次蒸餾水沖洗、晾干；將雙鏈DNA用二次蒸餾水配制成濃度為0.5-1g/L的溶液，再按2.1~4.2(ag/mm2的用量取雙鏈DNA溶液滴涂在水滑石納米片層上，2035°C干燥并用二次蒸餾水沖洗、晾干，得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。3、按照權(quán)利要求2所述的DNA敏感電極的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的雙鏈DNA為鯡魚精子DNA或鮭魚精子DNA中的一種。4、按照權(quán)利要求2所述的DNA敏感電極的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的二次蒸餾水為經(jīng)過兩次蒸餾的蒸餾水。全文摘要一種水滑石納米片修飾的DNA敏感電極及其制備方法，屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。該敏感電極以玻碳電極為基底電極，由雙鏈DNA和鈷鋁水滑石納米片構(gòu)成敏感膜修飾在基底電極表面。該敏感電極的制備方法是將鈷鋁水滑石納米片溶膠滴涂于潔凈玻碳電極表面，在室溫下干燥后用二次蒸餾水沖洗晾干，再將雙鏈DNA溶液滴涂于水滑石納米片層表面，室溫下干燥并用二次蒸餾水沖洗晾干，即制得水滑石納米片修飾的DNA敏感電極。該敏感電極的優(yōu)點(diǎn)在于利用水滑石納米片比表面積大、帶有高密度正電荷、表面富含羥基及具有良好的導(dǎo)電性等特性，可實(shí)現(xiàn)大量DNA的穩(wěn)定固定，該電極可用于苯酚的定量測定并具有良好的抗干擾性。文檔編號G01N27/327GK101281158SQ200810112018公開日2008年10月8日申請日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者李立群,楊文勝,毅王申請人:北京化工大學(xué)