專利名稱：：一種檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法。
背景技術(shù)：
：禽流感(avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒(AIV)引起的一種家禽和野禽的感染或疾病綜合征，雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽、野鳥、水禽和海鳥等均可感染。這種高度接觸性的傳染病可呈無癥狀感染、不同程度的呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降，以至引起頭冠和肉髯紫黑色、呼吸困難、下痢、腺胃乳頭和肌胃角膜下等器官組織廣泛性出血、胰臟壞死、纖維素性腹膜炎、甚至100%致死率的急性敗血癥。野鳥或者侯鳥是AIV的自然宿主，現(xiàn)已證實禽流感病毒可以由家禽直接感染人，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的不同，可將禽流感病毒分為16個HA亞型和9個NA亞型。其中H5亞型和H7亞型為高致病性禽流感(highlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI)，傳播迅速、病程短，可引起家禽大批死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。此外，越來越多的證據(jù)表明，HPAIV還可以突破種間障礙，感染人并造成發(fā)病和死亡。因此，世界動物衛(wèi)生組織將HPAI列入必須通報的疾病名錄，我國也將其定為一類動物傳染病。按照國際上通行的對動物疫苗的評價方法，必須進(jìn)行攻毒試驗，對于禽流感疫苗來說，也就是說給雞(動物)先免疫以后，再用毒株進(jìn)行攻擊，看它是否會發(fā)病。如果未發(fā)病，通過檢測血凝抑制抗體和/或保護(hù)性抗體也就是中和抗體的效價來確定疫苗的效力大小。傳統(tǒng)的禽流感病毒中和抗體的檢測主要采用全程細(xì)胞培養(yǎng)法，該方法通過觀察細(xì)胞病變(CPE)判斷結(jié)果，主觀性強(qiáng)；細(xì)胞病變一般要通過連續(xù)觀察5-7天才能最后確定結(jié)果，需要時間長；而且高致病性禽流感抗體檢測必須在BSL-3實驗室進(jìn)行；一次檢測標(biāo)本量少，難以一次大量檢測；該方法難以商品化。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法。本發(fā)明所提供的檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法，依次包括以下步驟1)將滅活的待測血清原液進(jìn)行倍比稀釋后，分別與禽流感病毒混合，得到病毒-血清混合物；2)將步驟l)中的病毒-血清混合物與禽流感病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)；3)以抗流感病毒NP蛋白的抗體為一抗，進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，確定待測血清中所述禽流感病毒血清中和抗體的效價。上述步驟2)中，所述禽流感病毒的宿主細(xì)胞具體可為MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞等。上述步驟2)中，所述共培養(yǎng)的條件可為在37。C、5%(]02溫箱中培養(yǎng)18-22小時。上述步驟3)中，所述抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。為了提高檢測結(jié)果的可靠性，所述方法中設(shè)置有陰性血清對照、陽性血清對照、陰性細(xì)胞對照和陽性細(xì)胞對照。所述陰性血清對照為未感染禽流感病毒的動物血清；所述陽性血清對照為感染禽流感病毒的動物血清；所述陰性細(xì)胞對照為未感染禽流感病毒的宿主細(xì)胞；所述陽性細(xì)胞對照為感染禽流感病毒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的方法可用于初步檢測禽流感疫苗的有效性，在實際應(yīng)用中，可結(jié)合其他方法對禽流感疫苗進(jìn)行綜合評價。本發(fā)明所提供的檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法，具有如下優(yōu)點1、檢測方法采用細(xì)胞培養(yǎng)與ELISA檢測方法結(jié)合，客觀性強(qiáng)，便于標(biāo)準(zhǔn)化。2、實驗可以在36小時內(nèi)完成，大大縮短了確定結(jié)果的時間。3、該方法不僅可以在BSL-3實驗室進(jìn)行，也可以在BSL-2實驗室進(jìn)行，擴(kuò)大了實驗操作的范圍。4、標(biāo)本可以進(jìn)行高通量檢測，結(jié)果計算有客觀的指標(biāo)。5、方法中所用的試劑可以裝配成試劑盒進(jìn)行商品化。6、自制配套試劑，方法穩(wěn)定可靠。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖1為96孔板布局圖。具體實施例方式本發(fā)明所提供的檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法包括病毒中和試驗和ELISA檢測兩個步驟。病毒中和試驗包括1)將滅活的血清原液倍比稀釋；2)將步驟l)的血清與200TCIDs。病毒液等體積比混合；3)病毒-血清混合物于37°C，5%C02反應(yīng)1小時。4)將步驟3)的病毒-血清混合物與宿主細(xì)胞混合，37°C、5%C02溫箱中培養(yǎng)18-22小時。其中，病毒-血清混合物與宿主細(xì)胞混合方式有兩種，一種是將細(xì)胞加入病毒-血清混合物中，另一種是將病毒-血清混合物加入細(xì)胞長成單層的培養(yǎng)板孔中。ELISA檢測包括1)吸出過夜細(xì)胞培養(yǎng)液，80%冷丙酮固定15-20分鐘，晾干；2)分別加入抗流感病毒NP蛋白單克隆抗體，37'C培養(yǎng)箱作用60分鐘，清洗，拍干；3)分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37。C作用45分鐘，清洗，拍干；4)辣根過氧化物酶顯色，測定OD值；5)通過細(xì)胞半數(shù)感染閾值計算血清中和抗體的效價。上述檢測方法中設(shè)置了陰性血清對照、陽性血清對照、陰性細(xì)胞對照和陽性細(xì)胞對照。上述細(xì)胞半數(shù)感染閾值的計算公式如下X=(VC-CC)/2+CC注X:為細(xì)胞半數(shù)感染閾值；VC:為陽性細(xì)胞對照平均OD值；CC:為陰性細(xì)胞對照平均OD值。上述血清中和抗體的效價的計算方式如下若被檢血清孔的OD值小于X值，則該孔血清能保護(hù)50%的細(xì)胞不被病毒感染。以能保護(hù)50%細(xì)胞不被感染的最高血清稀釋度的倒數(shù)作為中和終點，用中和抗體的效價表示。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例、檢測禽流感疫苗免疫動物血清中針對禽流感病毒的中和抗體一、中和抗體檢測(一)病毒滴度測定(組織培養(yǎng)半數(shù)感染量-TCIDs。滴定)1.配制病毒稀釋液病毒稀釋液的配制方法如下RPMI1640+lX牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。429毫升RPMI164066毫升7.5%牛血清白蛋白(BSA)5毫升青霉素與鏈霉素混合物(10000單位/毫升)2、病毒的稀釋1)取1管禽流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-rg(美國CDC，SafetyandimraunogenicityofaninactivatedsubvirioninfluenzaA(H5N1)vaccine.NEnglJMed2006:354:1343-51.)，1:100稀釋(100微升病毒液+9.9毫升稀釋液)。2)將1:100稀釋過的病毒液做系列半對數(shù)稀釋，使之成為原病毒液的10—2、10—25、10—3、10—:i'、5……l(T7。每個稀釋度的病毒液取100微升加至細(xì)胞培養(yǎng)板中。3、MDCK細(xì)胞的準(zhǔn)備1)使用前2天將MDCK細(xì)胞1:100傳代，使之70-90%成片，處亍對數(shù)生長期的細(xì)胞對病毒具有最大的敏感性，細(xì)胞過度生長以及代數(shù)太高(大于30代)將使細(xì)胞對病毒的敏感性降低。2)棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次，然后棄去，以去除牛血清。3)加1.5毫升0.25%胰酶覆蓋細(xì)胞(25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中)，37°C、5%C02溫箱中消化3-8分鐘。4)待細(xì)胞開始脫落時，加5-IO毫升MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打分散細(xì)胞。5)將細(xì)胞懸浮于病毒稀釋液中，用1毫升吸管充分吹打分散細(xì)胞，在細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。6)用病毒稀釋液將細(xì)胞稀釋成1.5X105細(xì)胞/毫升。7)加IOO微升細(xì)胞(1.5X104細(xì)胞/孔)于已稀釋好病毒的微量細(xì)胞培養(yǎng)板中。8)在37°C、5。/。C(V溫箱中培養(yǎng)18-22小時。4、測定組織細(xì)胞半數(shù)感染劑量(TCID5。)1)棄去微量培養(yǎng)板中的細(xì)胞液，250微升PBS洗細(xì)胞兩次。2)棄去PBS(不要讓細(xì)胞干燥)，加入100微升/孔固定液。3)覆蓋微量培養(yǎng)板，于室溫固定細(xì)胞15-20分鐘。4)棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。5)用ELISA檢測細(xì)胞感染。6)利用ELISA檢測儀，于490納米波長，測定每孔吸光度(OD)值，計數(shù)細(xì)胞陰性對照孔的平均OD值。7)若含有不同稀釋度病毒孔平均OD值是細(xì)胞陰性對照孔平均OD值的2倍以上，則判斷為病毒生長陽性。8)根據(jù)Reed和Muench方法對病毒滴度進(jìn)行計算。(二)病毒中和試驗1、血清的準(zhǔn)備和稀釋禽流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-rg(美國CDC，Safetyandi咖unogenicityofaninactivatedsubvirioninfluenzaA(H5N1)vaccine.NEnglJMed2006:354:1343-51.)56。C加熱滅活30分鐘后免疫Balb/C小鼠，不同時間采集血清進(jìn)行檢測。待檢動物血清56i:加熱滅活30分鐘。滅活后的血清用病毒稀釋液稀釋為原濃度的1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120。將未感染禽流感病毒的動物血清作為陰性血清，56"C加熱滅活30分鐘。滅活后的血清用病毒稀釋液稀釋為原濃度的1/80和1/160。將已感染禽流感病毒并產(chǎn)生中和抗體的動物血清作為陽性血清(哈爾濱獸醫(yī)研究所)。56。C加熱滅活30分鐘。滅活后的血清用病毒稀釋液稀釋為原濃度的1/100和1/200。2、病毒的準(zhǔn)備1)用病毒稀釋液稀釋步驟(一)得到的病毒液，使100wl中含有200TCIDs。禽流感病毒。2)分別取上述不同稀釋度的待檢血清稀釋液、陰性血清稀釋液、陽性血清稀釋液各120ul，分別加入120"1200TCID5。病毒液，使病毒-血清混合物混勻。3)病毒-血清混合物于37。C，5%0)2反應(yīng)1小時，30分鐘時混勻一次。3、在96孔板中，每孔加入100u1MDCK細(xì)胞液(1.5乂104細(xì)胞/孔)，200ii1PBS清洗含有細(xì)胞的培養(yǎng)板孔2次(注意最后一次將PBS盡量吸干凈)4、在加入細(xì)胞液的96孔板中分別加入病毒-血清混合物、病毒液、病毒稀釋液，見表l，將96孔板在37t:、5%C02溫箱中培養(yǎng)22小時。鄰孔板如圖1，具體布局見表1。如表1所示，向進(jìn)行完步驟3操作的96孔板的80個孔中，每孔加入步驟2制備的病毒-待測血清混合物100ul。每個96孔板進(jìn)行8個樣品的檢測，其中每個樣品血清占據(jù)10個孔(血清濃度分別為1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120)。每板含有2個陽性血清對照孔，分別加入100u11/100的病毒-陽性血清混合物和100u11/200的病毒-陽性血清混合物。每板含有2個陰性血清對照孔，分別加入100ulV80的病毒-陰性血清混合物和100wl1/160的病毒-陰性血清混合物。每板含有5個陽性細(xì)胞對照孔，每個孔分別加入50u1的200TCIDs。病毒液、50wl病毒稀釋液。每板含有5個陰性細(xì)胞對照孔，每個孔分別加入100ul病毒稀釋液。每板含有2個空白對照孔，不加任何試劑。實驗設(shè)三次重復(fù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(三)ELISA檢測1、吸出過夜細(xì)胞培養(yǎng)液，用200u1/孔PBS清洗2遍，加入200li1PBS配置的80%冷丙酮固定15-20分鐘，晾干備用(也可4。C保存)。2、每孔加入l:25000的抗流感病毒NP蛋白單克隆抗體(HB-65H16-L10-4R5，北京百星高科開發(fā)公司)100ul(注意空白不加)，放置37'C培養(yǎng)箱作用60分鐘，用PBS洗液洗5次后將液體拍干。3、每孔加入100nl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(GAM-IgG-HRP，北京萬泰生物科技公司)。37。C作用45分鐘，用PBS洗液洗5次后將液體拍干。4、每孔加A液(用5毫升無水乙醇溶解5mg四甲基聯(lián)苯胺，以l:4的比例與醋酸鹽緩沖液混合)50ul，B液(0.03%的&02水溶液)50Pl，避光反應(yīng)15分鐘后加終止液(2M硫酸)50n1，酶聯(lián)檢測儀450nm波長測定OD值。結(jié)果見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5、通過細(xì)胞半數(shù)感染閾值計算血清中和抗體的效價。計算公式X=(VC-CC)/2+CC注X:為細(xì)胞半數(shù)感染閾值；VC:為陽性細(xì)胞對照平均OD值；CC:為陰性細(xì)胞對照平均OD值。結(jié)果判定若被檢血清孔的OD值小于X值，則該孔血清能保護(hù)50%的細(xì)胞不被病毒感染。以能保護(hù)50%細(xì)胞不被感染的最高血清稀釋度的倒數(shù)作為中和終點，用中和抗體的效價表示。CO(O.047逸077+0.085+0.080)/4=0.07225，VC-(O.458+0.436+0.433+0.475)/4=0.4505，X二(O.07225+0.4505)/2=0.261。8個樣本的中和抗體效價結(jié)果見表3。二、檢測結(jié)果的驗證采用傳統(tǒng)的觀察CPE檢測方法檢測待檢血清中H5N1中和抗體。(一)病毒滴度測定同步驟一的(一)。(二)病毒中和試驗同步驟一的(二)。(三)CPE檢測觀察5-7天，每天記錄細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)情況，最終按CPE的孔數(shù)計算中和抗體的效價。8個樣本的中和抗體效價結(jié)果見表3。表3中和抗體與CPE結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果表明，本發(fā)明提供的新方法具有以下優(yōu)點1)相對于CPE-麗方法ELISA-MN檢測敏感度高。2)ELISA-MN檢測需要的時間短，30小時內(nèi)出結(jié)果，CPE-MN方法需要5-7天。3)CPE-MN方法必須在生物安全三級實驗室得出準(zhǔn)確結(jié)果。4)ELISA-MN檢測可標(biāo)準(zhǔn)化，比CPE-MN方法更客觀。權(quán)利要求1、一種檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法，依次包括以下步驟1)將滅活的待測血清原液進(jìn)行倍比稀釋后，分別與禽流感病毒混合，得到病毒-血清混合物；2)將步驟1)中的病毒-血清混合物與禽流感病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)；3)以抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗體為一抗，進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，確定待測血清中所述禽流感病毒血清中和抗體的效價。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述禽流感病毒的宿主細(xì)胞為MDCK細(xì)胞或Vero細(xì)胞。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述共培養(yǎng)的條件為在37-C、5%C02溫箱中培養(yǎng)18-12小時。4、如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。5、如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中設(shè)置有陰性血清對照、陽性血清對照、陰性細(xì)胞對照和陽性細(xì)胞對照。6、權(quán)利要求1-5中任一所述的方法在檢測禽流感疫苗有效性中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測禽流感疫苗免疫動物的血清中針對禽流感病毒中和抗體的方法。本發(fā)明提供的方法是將滅活的待測血清與禽流感病毒混合，將得到病毒-血清混合物與禽流感病毒的宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，以抗所述禽流感病毒NP蛋白的抗體為一抗，進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，確定待測血清中所述禽流感病毒血清中和抗體的效價。本發(fā)明的方法可用于檢測禽流感疫苗的有效性。本發(fā)明提供的方法具有客觀性強(qiáng)，便于標(biāo)準(zhǔn)化；所需時間短；可以在BSL-2實驗室進(jìn)行；可進(jìn)行高通量檢測，結(jié)果客觀；方法穩(wěn)定可靠的優(yōu)點。文檔編號G01N33/577GK101587121SQ20081011190公開日2009年11月25日申請日期2008年5月19日優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日發(fā)明者張泮河,曹務(wù)春,娜賈申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所