專利名稱：一種含mf59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，尤其是一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝。
背景技術(shù)：
禽流感是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，它是一種由甲型流感病毒的一種亞型(也稱禽流感病毒)引起的傳染性疾病，被國(guó)際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病，也能感染人類，人感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很聞。鋁佐劑用于疫苗已有80多年，但近來有資料顯示在疫苗制備中使用鋁佐劑后出現(xiàn)免疫抑制和中毒現(xiàn)象，使用量過小吸附不完全，過大吸附完全但存在安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，將R1203禽流感病毒株接種于雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒和純化、裂解、再純化等生產(chǎn)工藝制成。本發(fā)明采用MF59佐劑生產(chǎn)禽流感裂解疫苗，加入該佐劑比不加佐劑和加入氫氧化鋁佐劑生產(chǎn)的疫苗更加安全和有效。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案這種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，該方法步驟如下(I)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種經(jīng)稀釋的禽流感工作種子批毒種，置 33 35°C培養(yǎng)48 72小時(shí)；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時(shí)間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄清過濾后逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測(cè)定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C滅活15 24小時(shí)，滅活結(jié)束分別對(duì)每個(gè)病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化(5. I)蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時(shí)以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min,連續(xù)泵入病毒液,進(jìn)樣完畢，泵入緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機(jī)器停穩(wěn)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的 8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時(shí)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O. OlM pH7. 2PBS溶液進(jìn)行超濾濃縮，以去除蔗糖并進(jìn)一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量和微生物限度，控制細(xì)菌內(nèi)毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測(cè)要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)O. 22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價(jià)原液，單價(jià)原液應(yīng)置于2-8 °C保存。更進(jìn)一步的，半成品配制根據(jù)所配制的半成品總量計(jì)算原液用量，使血凝素含量為30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經(jīng)O. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。本發(fā)明有益的效果是I.用MF59佐劑制備的疫苗免疫原性強(qiáng)，能產(chǎn)生更高的抗體應(yīng)答；2.對(duì)接種常規(guī)疫苗后不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答或免疫應(yīng)答較低的兒童和老年人能增強(qiáng)其免疫力；3.能對(duì)不同流感病毒亞型產(chǎn)生交叉免疫；4.在保持免疫力不變的前提下可以降低抗原含量，同時(shí)降低了能引起副反應(yīng)的雜蛋白含量，因而疫苗的副反應(yīng)更低低、安全性更好，不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異的危險(xiǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明本發(fā)明采用MF59佐劑制備禽流感裂解疫苗。MF59是目前全世界公認(rèn)的最好佐劑， 是一種水包油的乳劑，包含I %鯊烯，O. 5% Tween80和O. 5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。它能激發(fā)已經(jīng)衰退的免疫應(yīng)答，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答，使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)大的免疫保護(hù)效力，MF59在國(guó)外已應(yīng)用于流感疫苗中，證明能增強(qiáng)兒童和老年人的免疫效力，并能對(duì)不同流感病毒亞型產(chǎn)生交叉免疫。本發(fā)明所述的這種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，該方法步驟如下(I)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種經(jīng)稀釋的禽流感工作種子批毒種，置 33 35°C培養(yǎng)48 72小時(shí)；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時(shí)間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄清過濾后逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測(cè)定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C滅活15 24小時(shí)，滅活結(jié)束分別對(duì)每個(gè)病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD 的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；
(5)、病毒純化(5.1)蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時(shí)以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min,連續(xù)泵入病毒液,進(jìn)樣完畢，泵入緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機(jī)器停穩(wěn)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的 8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 280nm，收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時(shí)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O. OlM pH7. 2PBS溶液進(jìn)行超濾濃縮，以去除蔗糖并進(jìn)一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量和微生物限度，控制細(xì)菌內(nèi)毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測(cè)要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價(jià)原液，單價(jià)原液應(yīng)置于2-8 °C保存。更進(jìn)一步的，半成品配制根據(jù)所配制的半成品總量計(jì)算原液用量，使血凝素含量為30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。各項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目經(jīng)檢測(cè)后，結(jié)果顯示均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。注本發(fā)明中提到的百分比濃度，除特別標(biāo)注的，其他均為體積百分比濃度。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是該方法步驟如下(1)、病毒接種與培養(yǎng)于雞胚尿囊腔接種經(jīng)稀釋的禽流感工作種子批毒種，置33 35°C培養(yǎng)48 72小時(shí)；(2)、病毒收獲篩選活雞胚，置2 8°C—定時(shí)間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄清過濾后逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；(3)、病毒滅活病毒滅活前取樣測(cè)定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200 μ g/ml的甲醒,置2-8°C滅活15 24小時(shí)，滅活結(jié)束分別對(duì)每個(gè)病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定；(4)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；(5)、病毒純化(5. I)蔗糖速率區(qū)帶離心在靜止時(shí)以不超過離心腔容積50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至35000r/min 40000r/min,連續(xù)泵入病毒液,進(jìn)樣完畢,泵入緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至Or/min，待機(jī)器停穩(wěn)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下，收集病毒峰；(5. 2)柱層析用S印hix)Se-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8%，洗脫液為O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上樣及洗脫線性流速為5 6mm/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm， 收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定；(6)、病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為O.3 O. 5% Triton X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20 30°C下作用90 120分鐘，然后梯度離心2小時(shí)，在280nm波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)下收集第一峰；(7)、除糖除裂解劑將離心后的裂解物用無菌O.OlM pH7. 2PBS溶液進(jìn)行超濾濃縮，以去除蔗糖并進(jìn)一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量和微生物限度，控制細(xì)菌內(nèi)毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測(cè)要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌過濾純化后的裂解物經(jīng)0.22 μ m孔徑的濾膜過濾即為單價(jià)原液，單價(jià)原液應(yīng)置于2-8°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是半成品配制根據(jù)所配制的半成品總量計(jì)算原液用量，使血凝素含量為30yg/ml，按50%的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經(jīng)0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾，即為半成品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，將R1203禽流感病毒株接種于雞胚，經(jīng)病毒接種與培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒和純化、裂解、再純化、除菌過濾等生產(chǎn)工藝制成。本發(fā)明有益的效果是用MF59佐劑制備的疫苗免疫原性強(qiáng)，能產(chǎn)生更高的抗體應(yīng)答；對(duì)接種常規(guī)疫苗后不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答或免疫應(yīng)答較低的兒童和老年人能增強(qiáng)其免疫力；能對(duì)不同流感病毒亞型產(chǎn)生交叉免疫；在保持免疫力不變的前提下可以降低抗原含量，同時(shí)降低了能引起副反應(yīng)的雜蛋白含量，因而疫苗的副反應(yīng)更低低、安全性更好，不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異的危險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102600468SQ20121005121
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者姚偉, 朱智勇, 蘇波, 蔣正東, 郭志軍, 鐘建琴 申請(qǐng)人:浙江天元生物藥業(yè)有限公司