專利名稱：：HIV-1p24抗原魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于臨床血液檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種用于臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HIV-1p24抗原的方法。本發(fā)明方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便。在新生兒HIV-1感染的診斷、HIV-1感染者病情發(fā)展的監(jiān)測(cè)、耐藥性監(jiān)測(cè)、抗病毒治療效果的評(píng)價(jià)等方面有重要應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HIV-l(Humanimmunodeficiencyvirus)病毒感染人體之后，在宿主細(xì)胞和病毒中會(huì)產(chǎn)生一些HIV感染的標(biāo)志性物質(zhì)(NielT.Constantine,HollyZink.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121.2005:519-524)，通過這些標(biāo)志物我們可以進(jìn)行病毒檢驗(yàn)、監(jiān)測(cè)病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況、了解感染后病情的發(fā)展、并實(shí)時(shí)掌握人體的免疫系統(tǒng)狀況。病毒感染后，這些標(biāo)志物隨著病毒侵染過程，p24抗原作為標(biāo)志物之一，在病毒診斷方面受到了人們的廣泛關(guān)注。常用的HIV-1p24抗原檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫分析法(Enzymelinkedimmuno-sorbentassay,ELISA)，并多采用雙抗夾心法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的靈敏度在3.5-10pg/ml，檢測(cè)寬度在2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。為了提高檢測(cè)靈敏度，使HIV-1p24抗原檢測(cè)方法能在檢測(cè)靈敏性和特異性方面不斷接近核酸>^測(cè)的水平，在過去的二十幾年時(shí)間里人們普通ELISA基礎(chǔ)上做了各種改進(jìn)，其中最為成功的方法有ELASTELISA方法和IPCR(Immunepolymerasechainreaction)-ELISA方法等。Ledergerberetal在文獻(xiàn)中報(bào)道，應(yīng)用ELASTELISA方法(Perkin-ElmerLifeSciences,Boston,MA)進(jìn)4亍HIV-1型p24抗原的4企測(cè)，其#全測(cè)限可以達(dá)到0.5pg/ml。JanetM.Barletta應(yīng)用免疫PCR方法同ELISA方法(Zeptomertrix,Buffalo,NY)結(jié)合，才企測(cè)低限可以達(dá)到1000個(gè)p24抗原分子。但從實(shí)際應(yīng)用中來分析以上兩種方法第一種方法所應(yīng)用的放大體系主要是生物素-鏈親和素放大系統(tǒng)，這種體系常會(huì)在血清樣品檢驗(yàn)中出現(xiàn)非特異性的反應(yīng)。因?yàn)橛H和素在pH中性環(huán)境中是帶正電荷的，可通過靜電作用非特異性地吸附到固相載體上，引起試驗(yàn)非特異性顯色，導(dǎo)致本底值升高。同時(shí)引入放大系統(tǒng)后操作步驟增加，反應(yīng)時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，為了減少非特異性反應(yīng)洗滌次數(shù)也要增加。第二種體系中引入的免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)，即在酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)束后，需進(jìn)行一個(gè)完整的PCR反應(yīng)，通常需要l-2個(gè)小時(shí)左右的時(shí)間，在反應(yīng)時(shí)間和操作步驟上增加難度之外，在核酸標(biāo)記反應(yīng)上也為實(shí)驗(yàn)體系的操作上增加了不便。另外，以酶聯(lián)免疫分析法為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，在檢測(cè)寬度上有很明顯的不足。通常情況下，國(guó)際最先進(jìn)的ELISA;f企測(cè)試劑盒只能達(dá)到5pg/ml到200pg/ml左右的檢測(cè)范圍。當(dāng)樣品中p24抗原含量超過200pg/ml時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果就已經(jīng)達(dá)到2.OA,即酶標(biāo)儀的最大檢測(cè)范圍，對(duì)結(jié)果的定性和定量帶來了諸多不便。以往的解決辦法是將高濃度樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)，既增加了結(jié)果的不確定性，又延長(zhǎng)了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。化學(xué)發(fā)光免疫分析方法其原理與酶聯(lián)免疫方法相似，是4巴化學(xué)發(fā)光物質(zhì)與免疫學(xué)反應(yīng)結(jié)合起來，用光反應(yīng)表現(xiàn)被測(cè)的免疫成分濃度。即把高靈敏的光反應(yīng)與特異性的免疫學(xué)反應(yīng)相結(jié)合，用發(fā)光強(qiáng)度來對(duì)抗原、抗體等物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。其中化學(xué)發(fā)光是伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物從分子狀態(tài)激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)時(shí)產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光(吳建民.臨床化學(xué)自動(dòng)化免疫分析.科學(xué)出版社，2000)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法自身具有靈敏度很高的靈敏性(C.Dodeigne,L.Thunus,R.Lejeune.ChemiluminescenceasDiagnosticTool.Talanta2000,51:415-439),由于不需要外來光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而本底低且具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比酶聯(lián)免疫分析或放射性免疫分析方法高1至2個(gè)數(shù)量級(jí)；另外化學(xué)發(fā)光試劑本身也有^^測(cè)線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)A.C.Calokerinos，N.T.Deftereos,W.R.G.Baeyens.ChemiluminescenceinDrugAssay.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.1995,13:1063-1071.)，可達(dá)6-7個(gè)數(shù)量級(jí)。魯米諾化學(xué)發(fā)光試劑屬酰肼類化合物的一種，是最常見的化學(xué)發(fā)光試劑之一。在堿性溶液一中加入適當(dāng)?shù)难趸瘎┗蛘叽呋瘎邕^氧化氫、鐵(n)鹽、錳(n)鹽、過渡金離子、辣根過氧化物酶、微過氧化物酶等，可以極大的提高化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。魯米諾因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易合成、有壽交好的水溶性以及其發(fā)光的量子效率高等特點(diǎn)，而得到了較深入和廣泛的研究與應(yīng)用。魯米諾類化合物，其化學(xué)名稱為3-氨基鄰苯二曱酰肼，化學(xué)分子式如下(A為魯米諾，R產(chǎn)HR2=NH2,B為異魯米諾，R產(chǎn)HR2=NH2)。但是，魯米諾直接與HA等氧化反應(yīng)速度很慢，并不纟艮理想。因此，又出現(xiàn)了酶標(biāo)發(fā)光技術(shù)，即以HRP(辣根過氧化物酶)、黃嘌呤、Fe"等為催化劑，以HA等作為氧化劑與魯米諾發(fā)生反應(yīng)而發(fā)光。在魯米諾(異魯米諾)及其衍生物化學(xué)發(fā)光體系中，魯米諾(異魯米諾)及其衍生物在過氧化氫和增強(qiáng)劑的聯(lián)合作用下2-5分鐘的反應(yīng)時(shí)間即可進(jìn)行結(jié)果的檢測(cè)。同吖咬酯類化合物的檢測(cè)體系相比，對(duì)于檢測(cè)儀器的要求更低，不需要實(shí)時(shí)加樣、實(shí)時(shí)檢測(cè)。但還未見有魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法應(yīng)用預(yù)HIV-lp24抗原檢測(cè)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、簡(jiǎn)單、快捷，的HIV-1p24抗原魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法。本發(fā)明采用雙抗夾心的方法，用過氧化氫和標(biāo)記于抗HIV-1p24抗體上的辣根過氧化物酶催化魯米諾類化合物發(fā)光，進(jìn)行HIV-1p24抗原的定性和定量分析，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對(duì)固相載體進(jìn)行包浮皮；(2)處理HIV-1樣品，即解離HIV-l樣品，分離HIV-1p24抗原；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1p24和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗HIV-1p24配對(duì)抗體加入步驟(1)中的反應(yīng)體系進(jìn)4亍免疫反應(yīng)；(4)將魯米諾類化合物和過氧化氫加入步驟(3)中的反應(yīng)體系，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(5)檢測(cè)步驟(4)中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)，進(jìn)行定性或/和定量分析。其中，步驟(l)中抗HIV-1p24抗體可以對(duì)各種各樣的固相載體進(jìn)行包被，如聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質(zhì)體、免疫磁性微珠等。步驟(2)中所述的HIV-1樣品為任意來源的HIV-1p24抗原，任意來源是指HIV-1艾滋病毒感染者的血液、以HIV-1病毒侵染細(xì)胞后得到的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物、以原核生物或真核生物為表達(dá)載體4艮據(jù)基因工程而得到的p24重組抗原。其中，血液需要通過物理方法離心得到血清。細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物需要物理方法、化學(xué)方法和生物方法使其裂解，離心f^其上清。重組抗原需要通過物理方法、化學(xué)方法和生物方法使其純化。血液來源和細(xì)胞培養(yǎng)物來源的p24抗原，以游離的p24抗原分子和p24抗原及其抗體的復(fù)合物的一種或任意組合的形式存在，需要預(yù)先進(jìn)行加熱解離或酸性解離以使抗原從抗原抗體復(fù)合物中解離出來。所述的HIV-1樣品包含任意類型的HIV-1型病毒。任意類型是指M亞群和O亞群的一種或任意組合。所述的M亞群中包括A、B(BE3、C、D、E、F、G、H、I和J等10個(gè)亞型。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果1)靈每文度較高，可達(dá)到O.5pg/ml，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平；2)檢測(cè)范圍較寬，可達(dá)到5-6個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)較高濃度的樣品無需稀釋即可檢測(cè)；3)操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，室溫孵育兩分鐘后即可4全測(cè)結(jié)果。圖1魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原的胡克效應(yīng)圖2魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析HIV-1p24抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合具體實(shí)施例方式材泮牛和試劑固相載體(白色96樣么孔^反ImmunoMaxiSorp)購(gòu)自Nunc/>司；魯米諾和過氧化氬(SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate)購(gòu)自Pierce公司；包#1緩沖液Na2C03-NaHC030.05MpH9.5洗滌緩沖液Na2HP04-NaH2P040.01MNaCl0.9%pH7.4封閉緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%BSA1%pH7.4分析緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%Tween-200.05°/oBSA0.5%pH7.0HIV—1樣品HIV-lp24重組抗原(病毒所提供)；HIV-lp24抗原國(guó)家參考品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)，包括20支HIV-lp24抗原陰性參考品，編號(hào)為Nl-N20;10支HIV-lp24抗原陽性參考品，編號(hào)為PI-P10;10支線性靈敏度參考品，編號(hào)為L(zhǎng)I-LIO;HIV-1p24抗原檢測(cè)精密度參考品，編號(hào)為AgCV;陰性對(duì)照人血清(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);陽寸生只t照重纟且p24^元原(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);實(shí)施例1)用包被緩沖液將包被用抗p24抗體稀釋至6^ig/ml,于白色96微孔板中，每孔加入10(V1，4。C封閉16個(gè)小時(shí)；2)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；3)每孔加入封閉緩沖液3(%1,37。C恒溫震蕩1個(gè)小時(shí)；4)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300|_il洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次，晾干后4IM呆存；5)將濃度為80、40、20、10、5pg/ml的五個(gè)陽性對(duì)照樣品加入孔中，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，每孔加入100pl;將陰性對(duì)照樣品分別加入4個(gè)孔中，每孔加入100pl;將HIV-1p24抗原國(guó)家參考品40個(gè)樣品(N1-N20、P1-P10和L1-L10)各加入1個(gè)孔中，加入量為lOOpl,將AgCV樣品分別加入4個(gè)孔中，每孔加入lOOjal，3rc恒溫振蕩1個(gè)小時(shí)；6)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300nl洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；7)用分析緩沖液對(duì)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗p24抗體進(jìn)行l(wèi):2000倍稀釋后，每孔加入100)il;8)將抗原抗體充分混合后，于37。C恒溫振蕩1個(gè)小時(shí)；9)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300|il洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；10)每孔加入50ju1魯米諾和50ia1過氧化氫，室溫孵育2分鐘；11)儀器調(diào)零(MultilabelCounterVICT0R1420，PerkinElmer)，450nm±5nm讀數(shù)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表lHIV-1p24抗原國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)20支HIV-1p24抗原陰性參考品不得出現(xiàn)陽性反應(yīng)(20/20)。10支HIV-1p24抗原陽性參考品不得出現(xiàn)陰性反應(yīng)(10/10)。10支線性靈敏度參考品對(duì)HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑，最低檢出量不得高于1.25U/ml(至少檢測(cè)出LI-L5)，進(jìn)行p24定量測(cè)定時(shí)，LI-L5共5個(gè)樣品測(cè)定值統(tǒng)計(jì)分析后線性關(guān)系系數(shù)(R值)必須>0.95。精密度測(cè)定統(tǒng)計(jì)分析后CV<15%。結(jié)合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果符合HIV-1p24抗原國(guó)家參考品標(biāo)準(zhǔn)的要求。相應(yīng)參數(shù)的確定1、分析靈敏度將80、40、20、10、5pg/ml五個(gè)梯度的陽性樣品，每個(gè)濃度做2個(gè)復(fù)孔,每孔加入10(^1;將4個(gè)陰性對(duì)照，每孔加入100^il;將500ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、2ng/ml，500pg/ml、200pg/ml、50pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ml、2pg/ml、lpg/ml、0.5pg/ml、0.2pg/ml、0.lpg/ml、Q.05pg/ml等18個(gè)梯度的重組p24抗原，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，每孔加入10G^1;37。C恒溫振蕩1個(gè)小時(shí)。作4次批內(nèi)重復(fù)測(cè)定，求各梯度測(cè)定值的均值(M)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CW。)。將各濃度梯度所得(M-3SD)x值與陰性對(duì)照的(M+3SD)Nc值進(jìn)行比較，選取(M-3SD)X〉(M+3SD)NC時(shí)的最小濃度值為該體系的檢測(cè)限，經(jīng)比較本發(fā)明方法的檢測(cè)限為0.5pg/ml。2、檢測(cè)寬度以最低檢測(cè)限為下限，以所能檢測(cè)的最高濃度值(考慮胡克效應(yīng)，如圖l所示，以及變異系數(shù)小于20°/。)為上限，確定本發(fā)明方法的檢測(cè)寬度為0.5pg/ml-5ng/ml。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合將0.5pg/m卜5ng/ml之間的濃度梯度檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性擬合本發(fā)明方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線大體上符合一元三次曲線，如圖2所示，曲線擬合得到的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=5393.45+5571.25x-0.52x2+9.06xl(T6x3,R2為1。權(quán)利要求1.一種HIV-1p24抗原魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用抗HIV-1p24抗體對(duì)固相載體進(jìn)行包被；(2)處理HIV-1樣品；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗HIV-1p24配對(duì)抗體加入步驟(1)中的反應(yīng)體系進(jìn)行免疫反應(yīng)；(4)將魯米諾類化合物和過氧化氫加入步驟(3)中的反應(yīng)體系進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；(5)檢測(cè)步驟(4)中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)，進(jìn)行定性或/和定量分析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所述的固相載體為聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質(zhì)體或免疫磁性微珠。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的HIV-1樣品選自血清、血漿、HIV-1細(xì)胞培養(yǎng)物裂解上清或HIV-lp24重組抗原的一種或多種。4、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的HIV-1樣品包含的HIV-1型病毒為M亞群和0亞群的一種或任意組合。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的M亞群中包括A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I和J亞型。全文摘要HIV-1p24抗原魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)方法屬于臨床血液檢測(cè)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
?，F(xiàn)有HIV-1p24抗原檢測(cè)方法存在靈敏度不高、操作繁瑣等問題。本發(fā)明采用雙抗夾心的方法，用過氧化氫和標(biāo)記于抗HIV-1p24抗體上的辣根過氧化物酶催化魯米諾類化合物發(fā)光，進(jìn)行HIV-1p24抗原的定性或/和定量分析。本發(fā)明方法與普通的ELISA檢測(cè)方法具有很好的相關(guān)性，在P≤0.01情況下，相關(guān)系數(shù)為0.996；測(cè)HIV-1p24抗原的靈敏度達(dá)到0.5pg/ml，達(dá)到國(guó)外先進(jìn)試劑盒的檢測(cè)水平；檢測(cè)范圍達(dá)到5-6個(gè)數(shù)量級(jí)；符合HIV-1p24抗原國(guó)家參考品標(biāo)準(zhǔn)的要求；反應(yīng)時(shí)間更短，操作更為簡(jiǎn)便。文檔編號(hào)G01N33/544GK101281197SQ200810111680公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日發(fā)明者娟馮,呂傳臣,毅曾,鐘儒剛,馬雪梅申請(qǐng)人:北京工業(yè)大學(xué)