專利名稱：快速檢測人ABO/Rh/MN血型的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及快速檢測人類ABO/Rh/MN血型的方法及相應的試劑盒。
背景技術：
血液分型方法是將人血液紅細胞分成A、 B、 AB和O四種不同類型以及Rh 血型系統(tǒng)和MN血型系統(tǒng)的常規(guī)方法。鑒定血型的一般方法是將受檢紅細胞與含 有血型抗體的試劑混合，兩者反應后，通過觀察紅細胞是否發(fā)生細胞凝集來判斷 被檢紅細胞的血型。此類方法是首先從病人血清中分離紅細胞。將適量的紅細胞 與引入試管中或玻片上的試驗溶液(含有抗A血清、抗B血清或者抗D血清或 者抗M血清、抗N血清)混和，可以另外加入利于免疫反應進行的其他試劑并 保溫、離心和攪拌。然后肉眼觀察，確定細胞是否發(fā)生了聚集。
如果樣品在抗A試劑存在下發(fā)生細胞聚集，而在抗B存在下不發(fā)生聚集即 鑒定為A型血。樣品在抗B試劑存在下發(fā)生細胞聚集，但在抗A存在下不發(fā)生 聚集則鑒定為B型血。樣品與抗A和抗B試劑均有聚集，樣品為AB型血。樣 品與抗A和抗B試劑均不發(fā)生反應則定為O型血。樣品與抗D試劑發(fā)生聚集的 為Rh陽性血型，樣品與抗D試劑不發(fā)生凝集的血樣為Rh陰性血型。MN血型 系統(tǒng)根據是否發(fā)生相應的凝集反應可以分為M、 N和MN三種血型。
目前檢測人ABO/Rh/MN血型的技術可以分為兩類， 一類是檢測細胞膜上結 合的血型抗原，包括紅細胞鹽水凝集法、中和實驗、吸收實驗、解離實驗和混合 凝集反應等。另一類是直接檢測游離血型抗原，包括協(xié)同凝集反應、放射免疫反 應等。
目前常用的紅細胞鹽水凝集法是通過己知的IgM或IgG型抗體結合新鮮紅 細胞表面的血型抗原，導致紅細胞凝集，進而判斷被檢血液的血型。此方法被廣 泛用于臨床輸血前的血型檢驗(配型)。然而，這種方法需要相應的配套試劑， 而且試劑需要低溫保存，結果也難以判斷。
其他血型檢測方法也都存在各自的缺點，例如中和實驗方法費時較長，而
3且靈敏度比較低。解離實驗和混合凝集反應法操作要求高，每次實驗需要反復摸 索條件，其靈敏度也不高；協(xié)同凝結反應方法是用IgG型抗體致敏金黃色葡萄球 菌A蛋白(SPA)，通過觀察葡萄球菌是否凝集來判斷被檢樣品的血型，但該方 法對試劑保存要求較高；放射免疫和酶聯(lián)免疫方法雖然靈敏度高，但是費時較長、 不適合單人份檢測，也無法進行現(xiàn)場檢測。
總之，目前常用的臨床血型鑒定方法存在檢定時間長、手工勞動強度大，以 及結果受主觀偏差影響較大和存在污染的可能等問題。因此，有必要對傳統(tǒng)的血 型檢測方法做出實質性的改進。

發(fā)明內容
本方法的一個目的是提供一種檢測人ABO/Rh/MN血型的方法，該方法包括 將被測血樣滴加在預先包被固定了抗A或抗B或抗D或者抗M或者抗N血型 抗體的測試條上，在測試條的一端滴加沖洗液后，使未與抗體發(fā)生凝集反應的紅 細胞在沖洗液的泳動下遠離加樣點處，而與抗體發(fā)生免疫凝集的紅細胞被殘留在 加樣點處，然后即可根據反應位點是否有凝集的紅細胞殘留來判定被測樣品的血 型。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中測試條上滴加的待測血樣的體積可以 小至l-10pl。所說的沖洗液是lOmM磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水或者其他 溶液。所說的待檢血樣是滴加在檢測試劑條的加樣墊上。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的固定血型抗體的方法可以是物 理吸附或者化學交聯(lián)等方法。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待測血樣可以是紅細胞或者全 血或者是用生理鹽水、磷酸鹽緩沖液等等張溶液稀釋的紅細胞或全血懸浮液。并 且所說的血樣也可以包括部分溶血或者高血脂含量的血樣。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中檢測結果的判斷可以是肉眼觀察或者 利用光學信號或者電信號采集儀器進行判斷。
簡單地說，當血液樣品與結合了相應的血型抗體的加樣墊接觸并反應后，即 在加樣墊上與相應的抗體發(fā)生免疫結合反應。用沖洗液體沖洗之后，發(fā)生了免疫 結合反應的樣品即在加樣墊上殘留顯著的紅色物質，而沒有發(fā)生免疫結合反應的血樣則被沖洗液沖洗而離開加樣墊，加樣點處便沒有紅色物質殘留。從而可根據 紅細胞與相應抗體發(fā)生免疫反應后，加樣墊上是否有紅色物質的殘留來判斷紅細 胞是否和血型抗體發(fā)生了免疫反應，進而判定血液樣品的ABO/Rh/MN血型。
本發(fā)明的另一個目的是提供完成上述檢測方法的試劑盒，該試劑盒由檢測試 劑條、沖洗液和采血工具組成，其中檢測試劑條由沖洗墊、加樣墊、緩沖墊、吸 水墊、防水膠布以及用來做背襯的聚酯板組成。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待測血樣可以是紅細胞或者全 血或者是用生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)等等張溶液稀釋的紅細胞懸浮液或 者全血稀釋液。并且所說的血樣也可以包括溶血樣品或者高血脂含量的血樣。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的滴加的待測血樣的體積不大于 10pl。所說的沖洗液是10mM磷酸鹽緩沖液、生理鹽水或者其他溶液。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的固定血型抗體的方法可以是物 理吸附或者化學交聯(lián)等方法。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的沖洗墊、加樣墊、緩沖墊、吸 水墊是由玻璃纖維等具有一定孔徑的多孔高分子材料制成的，并且其孔徑大小至 少允許單個紅細胞通過。根據其材質的選擇，其中沖洗墊、加樣墊和緩沖墊有時 又統(tǒng)稱為玻璃纖維墊。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待測血樣是滴加在加樣墊上， 并且所說的沖洗液體是滴加在沖洗墊上。加樣墊是固定有血型抗體的多孔載體。 并且固定血型抗體的方法可以是物理吸附或者化學交聯(lián)等方法。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的血樣包括有一定程度溶血或者 血脂含量較高的血樣。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中檢測結果的判斷可以是用肉眼或者利 用光學信號或者電信號采集和判讀儀器來完成。
具體地說，使用本發(fā)明的試劑盒，檢測人ABO/Rh/MN血型的操作步驟包括
1)將人ABO/Rh/MN血型抗體直接或者間接固定在加樣墊3 (圖2)上通 過物理吸附或者化學交聯(lián)手段將血型抗體固定在具有一定孔徑的玻璃纖維墊上。 其中所采用的物理或者化學固定方法對抗體的生物活性影響不大，同時固定化抗 體內添加有抗體蛋白保存劑，保護劑可選自牛血清白蛋白、小牛血清、蛋白胨、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮及其組合物。
取高效價的人ABO/Rh/MN血型單克隆抗體，以5mM磷酸鹽緩沖液稀釋到 適當的效價，并加入抗體固定保護劑以利于抗體在玻璃纖維墊上的固定和保存， 稀釋后的抗體溶液中可加入反應增強劑，以促進后續(xù)免疫反應的進行。按照每 1.5ml稀釋后的抗體鋪展5cmX5cm的纖維墊的比例，將抗體鋪敷在預先活化的 玻璃纖維墊上，37'C烘干后密封保存。
2) 在加樣墊3上滴加待測樣品，然后在沖洗墊2 (圖3)上滴加沖洗液體。 加樣并滴加沖洗液后，即發(fā)生免疫結合反應，同時顯現(xiàn)結果。
3) 反應完成并沖洗后，可根據加樣墊上是否有紅色殘留物來判定被檢血樣 的血型。
在ABO血型檢測試劑條上，當反應物被沖洗后，含有抗A抗體的加樣墊上 有顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣被相應抗A抗體捕獲，從而與抗A抗 體發(fā)生了凝集反應(即陽性反應)；沖洗后，含有抗A抗體的加樣墊上沒有顯著 的紅色物質殘留時，說明待測血樣與抗A抗體未發(fā)生凝集反應(即陰性反應)； 當反應沖洗完畢后含有抗B抗體的加樣墊上有顯著的紅色物質殘留時，說明待 測血樣與抗B抗體發(fā)生了凝集反應；沖洗后，含有抗B抗體的加樣墊上沒有顯 著的紅色、物質殘留時，說明待測血樣與抗B抗體未發(fā)生凝集反應。因此，由檢 測結果可以判定，與抗A抗B抗體均發(fā)生凝集反應的血樣血型為AB型，僅與 抗A抗體發(fā)生凝集反應的血樣的血型為A型；僅與抗B抗體發(fā)生凝集反應的血 樣的血型為B型。與抗A抗B抗體均未發(fā)生凝集反應的血樣的血型為O型。
在Rh血型檢測試劑條上，當反應沖洗完畢后含有抗D抗體的加樣墊上有 顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣與抗D抗體未發(fā)生凝集反應；當反應沖 洗完畢后含有抗D抗體的加樣墊上沒有顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣 與抗D抗體未發(fā)生凝集反應。因此，由檢測結果可以判定，與抗D抗體發(fā)生凝 集反應的血樣的血型為Rh陽性血型，與抗D抗體不發(fā)生凝集反應的血樣的血型 為Rh陰性血型。
在MN血型檢測試劑條上，當反應物被沖洗后，含有抗M抗體的加樣墊上 有顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣被相應抗M抗體捕獲，從而與抗M抗 體發(fā)生了凝集反應；沖洗后，含有抗M抗體的加樣墊上沒有顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣與抗M抗體未發(fā)生凝集反應；當反應沖洗完畢后含有抗N 抗體的加樣墊上有顯著的紅色物質殘留時，說明待測血樣與抗N抗體發(fā)生了凝 集反應。因此，由檢測結果可以判定，與抗M抗N抗體均發(fā)生凝集反應的血樣 血型為MN型，僅與抗M抗體發(fā)生凝集反應的血樣的血型為M型；僅與抗N抗 體發(fā)生凝集反應的血樣的血型為N型。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的快速檢測試劑條由背襯、沖洗 墊、加樣墊、緩沖墊、吸水墊以及防水膠布組成。在背襯上依次貼上沖洗墊、加 樣墊、緩沖墊、吸水墊以及防水膠布。加樣墊邊緣壓在沖洗墊邊緣上，緩沖墊邊 緣壓在加樣墊邊緣上，吸水墊邊緣壓在緩沖墊邊緣上，防水膠布粘貼在沖洗墊和 加樣墊重疊的邊緣上，以防止沖洗液體從加樣墊表面漫延。背襯可以由但是不限 于聚酯材料制成。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的抗體固定是指利用物理或者化 學交聯(lián)等方法將抗A或抗B或抗D或抗M或抗N等抗體固定在具有一定孔徑 的玻璃纖維墊或者其他相似孔徑的載體上。固定前，可根據抗體的效價不同對抗 體進行一定比例的稀釋，使其達到可以使用的適當濃度?？梢圆捎媒莼蛘呔鶆?涂抹或者噴霧的方法將抗體固定在玻璃纖維墊(加樣墊)上，然后再行凍干或者 烘干處理。其中所說的抗體可以是預先用戊二醛交聯(lián)劑處理的。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待測血樣可以是紅細胞或者全 血或者用lOmM磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水等等張溶液稀釋的紅細胞懸浮液 (稀釋度通常為2-50%)。有一定程度的溶血或者有較高血脂含量的血樣也適用于 本發(fā)明的試劑盒。
可以將經過適當稀釋或未稀釋的待檢全血或者血細胞樣品加至固定有血型 抗體的加樣墊上，待發(fā)生免疫結合反應后用沖洗液沖洗加樣墊。沖洗液可以是 lOmM磷酸鹽緩沖液(PBS)或者其他溶液。免疫反應后凝集的紅細胞的存在 可以很容易用肉眼觀察到，或者也可利用光信號或者電信號采集和判讀儀器讀 出批量樣品的血型檢測結果。
如進行ABO血型的檢測，實際操作可以在分隔并列制作于同一塊聚酯板背 襯上、分別在加樣墊上固定有抗A或抗B血型抗體的兩條檢測試劑條上完成。
如進行MN血型的檢測，實際操作可以在分隔并列制作于同一塊聚酯板背襯上、分別在加樣墊上固定有抗M或抗N血型抗體的兩條檢測試劑條上完成。
本發(fā)明的人ABO/Rh/MN血型快速檢測試劑盒適合血站血型篩查、街頭采血 以及家庭ABO/Rh/MN血型自檢使用。通過快速免疫反應及簡單方便的結果判 讀，達到對血型快速簡單準確的鑒定。該方法操作簡單易行，不需要額外添加抗 人球蛋白等試劑。本發(fā)明的方法中，被檢血樣的加樣量可以不超過IO微升，全 部檢測過程不超過2分鐘。
本發(fā)明快速檢測人ABO/Rh/MN血型的方法和檢測試劑盒是根據免疫層析 法的原理，利用血型物質抗原抗體反應后是否殘留有因為紅細胞凝集而殘留的 紅色物質來實現(xiàn)對血型的判斷。本發(fā)明的方法操作簡單、可避免現(xiàn)有、普通血型 檢測方法的各種缺陷。本發(fā)明方法適合單人份或者多人份快速檢測。特別適合 采血現(xiàn)場ABO/Rh/MN血型的快速檢測以及血型的家庭自檢。如結合使用相應 的儀器，該方法可用于血站系統(tǒng)對批量血液樣品ABO/Rh/MN血型的人群快速 篩査。


圖1顯示本發(fā)明血型檢測試劑盒中ABO血型快速檢測試劑條的模式圖。 圖2顯示本發(fā)明血型檢測試劑盒中ABO血型快速檢測試劑條的進一步模式
圖結構分解。其中1為沖洗墊，2為防水膠布，3為含有血型抗體的加樣墊，4
為緩沖墊，5為吸水墊，6為聚酯板背襯。
圖3顯示本發(fā)明血型檢測試劑盒中Rh血型快速檢測試劑條的模式圖。其中
l為沖洗墊，2為防水膠布，3為含有抗D抗體的加樣墊，4為緩沖墊，5為吸水墊。
圖4顯示本發(fā)明血型檢測試劑盒中MN血型快速檢測試劑條的模式圖。 圖5顯示為固定有血型抗體的玻璃纖維墊上滴加陽性血樣后的反應示意圖。 其中l(wèi)為紅細胞，2為血型抗體，3為玻璃纖維加樣墊。
具體實施方案
以下實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，這些實施例并不以任何方式限制本 發(fā)明。在不背離本發(fā)明技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動或者改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。
實施例1:人ABO血型試劑盒中檢測試劑條的制備及檢測步驟 (1)在加樣墊上固定血型抗體(抗A、抗B抗體)
取高效價的血型單克隆抗A抗B抗體(由長春博德生物技術有限公司生產)， 以5mM磷酸鹽緩沖溶液稀釋到lml，終效價為64。在稀釋后的抗體液中加入抗 體固定保護劑(由5%牛血清白蛋白、5%蔗糖、5%PVP、 5%小牛血清的磷酸鹽 緩沖液組成)以便促進抗體在玻璃纖維墊上的固定和保存。按照每1.5ml稀釋后 的抗體鋪展5cmX5cm玻璃纖維墊的比例在預先活化的玻璃纖維墊上鋪展抗體， 然后37'C烘干處理并密封保存。
(2) 快速檢測試劑條的組裝 在一寬度約5-10cm的長方形的聚酯板背襯中央貼上20mm寬的沖洗玻璃纖
維墊，然后兩邊依次貼上10mm寬的加樣墊、緩沖墊和30mm寬的吸水墊，最后 在沖洗墊和加樣墊交接處用防水膠布粘貼，防止貼墊翻起以及加樣和沖洗液的漫 延。然后將各層均粘貼好的聚酯板切成5mm寬的條,即得到長約5-10cm,寬約 5mm的檢測試劑條(參見圖1和圖2)。
(3) 樣品檢測
在試劑條的加樣墊上滴加5pl的全血樣品。滴加待檢測樣品后，在沖洗墊2 上緩慢勻速滴加反應沖洗液5滴。待沖洗液層析后觀察加樣墊的顏色。加樣墊3 上有顯著的紅色物質殘留為陽性反應，加樣墊3上沒有紅色物質殘留為陰性反 應。結合ABO血型抗體和紅細胞反應的關系，可以很容易得知待檢測樣品的血 型?；蛘?，也可以利用光信號或者電信號采集系統(tǒng)采集加樣墊上殘留的紅色物質， 然后可以對結果自動化判斷，從而實現(xiàn)對批量血液樣品的ABO血型的快速篩査。
實施例2:人Rh血型檢測試劑盒中檢測試劑條的制備及檢測步驟 (1)在加樣墊上固定血型抗體(抗D抗體)
取高效價的血型單克隆抗D抗體(美國MILLIPORE公司生產)，以5mM 磷酸鹽緩沖溶液稀釋到lml，終效價為32。在稀釋后的抗體液中加入抗體固定保 護劑(由5%白蛋白、5%蔗糖、5%PVP、 5。/。小牛血清的PBS溶液組成)以便促進抗體在玻璃纖維墊上的固定和保存，并且加入反應增強劑(含有2%Tween20 和2%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液)，用以促進后續(xù)免疫反應的進行。按照每1.5ml 稀釋后的抗體鋪展5cmX5cm的纖維墊的比例在預先活化的玻璃纖維墊上鋪展 抗體，然后37。C烘干處理，然后密封保存(參見圖3)。
其他步驟與ABO血型試劑盒快速檢測試劑條的制備及檢測步驟類似。
實施例3:人MN血型檢測試劑盒中檢測試劑條的制備及檢測步驟
人MN血型檢測試劑盒快速檢測試劑條的制備及檢測步驟與人Rh血型檢 測試劑盒快速檢測試劑條的制備及檢測步驟類似(參見圖4)。
實施例4:本發(fā)明血型檢測方法與現(xiàn)有常規(guī)方法的比較
我們使用傳統(tǒng)的血型檢測方法和本發(fā)明的方法與試劑盒，對普通人群1500 例個體(獻血員)同時進行血型雙盲法檢測。結果顯示，本方法的檢測結果和與 已知的血球液體凝集方法相比較，符合率達到100%。而且本發(fā)明可檢測樣本范 圍比較廣，對于部分溶血、高血脂等樣本也可以檢測。同時，本發(fā)明的試劑盒檢 測方法避免了目前常用的臨床血型鑒定方法存在檢定時間長、手工勞動強度大， 以及結果受操作者主觀偏差影響較大和存在污染的可能等缺陷。
權利要求
1、一種檢測人ABO/Rh/MN血型的方法，該方法包括將被測血樣滴加在預先包被固定了抗A或抗B或抗D或抗M或抗N血型抗體的測試條上，在測試條的一端滴加沖洗液后，使未與抗體發(fā)生凝集反應的紅細胞在沖洗液的泳動下遠離加樣點處，而與抗體發(fā)生免疫凝集的紅細胞被殘留在加樣點處，然后即可根據反應位點是否有凝集的紅細胞殘留來判定被測樣品的血型。
2、 根據權利要求1的方法，其中所說的待測血樣可以是紅細胞或者全血或 者是用生理鹽水或等滲磷酸鹽緩沖液稀釋的紅細胞或全血。
3、 根據權利要求1的方法，其中所說的血樣可以包括部分溶血或者高血脂 含量的血樣。
4、 根據權利要求1的方法，其中所說的抗體是以物理吸附或者化學交聯(lián)法 固定在測試條上。
5、 根據權利要求l的方法，其中反應位點是否有凝集可以是以肉眼觀察或 者利用光學信號或者電信號采集儀器進行判斷。
6、 用于完成根據權利要求1的方法的試劑盒，該試劑盒由檢測試劑條和沖洗 液及采血工具組成，其中檢測試劑條由沖洗墊、加樣墊、緩沖墊、吸水墊、透明 防水膠布以及用來做被襯的聚酯板組成。
7、 根據權利要求6的試劑盒，其中構成檢測試劑條的所說的沖洗墊、加樣 墊、緩沖墊、吸水墊是由具有一定孔徑的多孔高分子材料制成的，并且其孔徑大 小至少允許單個紅細胞通過。
8、 根據權利要求6的試劑盒，其中在固定有血型抗體的加樣墊上滴加待測 血樣，并且在沖洗墊上滴加沖洗液。然后觀察加樣墊上是否有凝集的紅細胞殘留 來判斷被測血樣的血型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人ABO/Rh/MN血型的快速檢測方法及所使用的試劑盒。本發(fā)明的方法和檢測試劑盒是根據免疫層析法的原理，利用血型物質抗原抗體反應后是否有因為紅細胞凝集而殘留的紅色物質來實現(xiàn)對血型的檢測。本發(fā)明的方法操作簡單、可避免現(xiàn)有普通血型檢測方法的各種缺陷。本發(fā)明的方法中，被檢血樣的加樣量不超過10微升，全部檢測過程不超過2分鐘。
文檔編號G01N33/80GK101603967SQ20081011156
公開日2009年12月16日 申請日期2008年6月10日 優(yōu)先權日2008年6月10日
發(fā)明者文 楊, 汪大明, 王保丹, 肖江群 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司