專利名稱：：穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥用植物指紋圖譜測定的方法，特別是穿心蓮提取物指紋圖譜測定方法的建立。技術(shù)背景穿心蓮為爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，為常用的傳統(tǒng)中藥材，性味苦，寒。歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)。具有清熱解毒、涼血、消腫等功效，常用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫疫瘍，毒蛇咬傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮具有廣泛的生理活性，除了抗菌消炎作用外，還有抗腫瘤、增強免疫、抗病毒、防治心血管疾病等作用，廣泛應(yīng)用于臨床。穿心蓮提取物是由穿心蓮經(jīng)過提取加工而成，其為常用中藥成方_制劑穿心蓮片、穿心蓮膠囊、蓮芝消炎片等的中間體及一些化妝品、獸藥的原料。建立穿心蓮提取物有效的質(zhì)量評價方法，確保穿心蓮提取物的質(zhì)量穩(wěn)定，直接關(guān)系到穿心蓮提取物相關(guān)產(chǎn)品的有效性、安全性、穩(wěn)定性和均一性。公開文獻報道，穿心蓮主要有效成分是二萜內(nèi)酯類成分，穿心蓮藥材及其復(fù)方制劑多以該類成分中含量較高的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。然而，單一的某成分含量測定不能完全反映中藥的藥效作用。指紋圖譜技術(shù)是目前反映中藥作用機理的最有效途徑，是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)之一，是中藥質(zhì)量控制最先進技術(shù)。因此，我們將指紋圖譜的技術(shù)應(yīng)用于穿心蓮提取物的質(zhì)量控制中。我們建立了穿心蓮提取物的HPLC指紋圖譜測定方法，為穿心蓮提取物的質(zhì)量控制提供有效方法。目前公開文獻報道了一些穿心蓮藥材指紋圖譜的研究，例如題名規(guī)范化種植穿心蓮藥材HPLC指紋圖譜研究作者祝晨藤莫建霞刊名中國藥學(xué)雜志.2004，39(10).-737-739文摘目的為規(guī)范化種植穿心蓮藥材質(zhì)量研究提供新的基礎(chǔ)研究資料。方法RP-HPLC建立穿心蓮指紋圖譜，并進行不同種植基地(產(chǎn)地)與商品藥材、不同生長期、不同藥用部位指紋圖譜的比較，采用計算機輔助的相似度評價軟件進行相似度評價。結(jié)果在選定的色譜條件下，226rai檢測波長下的15個峰構(gòu)成穿心蓮藥材的指紋特征，各批次樣品指紋圖譜均具有上述特征，但特征峰的相對含量分布差異導(dǎo)致色譜概貌存在一定差異。計算機輔助相似度評價，5個規(guī)范化種植基地產(chǎn)穿心蓮藥材指紋特征相互間較為吻合，具有較好的一致性，商品藥材則差異較大。不同生長期藥材指紋圖譜也具有較好的一致性，多數(shù)特征峰含量呈現(xiàn)隨生長期而增加的動態(tài)累積過程，不同部位則特征峰的含量分布葉中大大高于莖。結(jié)論實行規(guī)范化種植對于保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性具有重要的意義，所建立的方法可較全面地反映穿心蓮藥材多成分特征，并進行藥材質(zhì)量評價。題名穿心蓮藥材的色譜指紋圖譜作者張尊建[l]董海,[l]余靜[2]刊名中國天然藥物.2005，3(6).-373-3文摘目的建立穿心蓮藥材的HPLC/UV色譜指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地的藥材進行比較。方法應(yīng)用ShimadzuVP-0DS柱，0.1%甲酸乙腈與0.2%甲酸進行梯度洗脫，流速為1.0ml/min，檢測波長254nm，柱溫為室溫。結(jié)果得到分離度、重現(xiàn)性均較好的穿心蓮藥材HPLC/UV指紋圖譜，標(biāo)示了9個共有峰。應(yīng)用HPLC/MS技術(shù)對其7個主要色譜峰進行了初步歸屬，并對不同產(chǎn)地藥材的色譜指紋圖譜進行了相似度評價。結(jié)論穿心蓮藥材指紋圖譜的建立，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)。題名不同產(chǎn)地穿心蓮藥材色譜指紋圖譜的比較研究作者董海娟[1]張尊建[l]余靜[2]刊名中成藥.2006，28(3).-321-32文摘目的建立穿心蓮藥材的HPLC指紋圖譜，為其全面質(zhì)量評價及控制提供參考。方法采用HPLC/UV法，測定了10個不同產(chǎn)地的23批穿心蓮藥材樣品。色譜條件Shimadzu0DS柱，流動相為0.1%甲酸乙腈與0.2%甲酸，梯度洗脫，流速1.0ml/min，檢測波長254咖，住溫為室溫。應(yīng)用聚類分析、非線性映射和相似度計算等方法對所得指紋圖譜進行了定性、定量評價。結(jié)果建立了操作簡單、分離度佳、重現(xiàn)性好的穿心蓮藥材指紋圖譜檢測方法，不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜具有一定差異。結(jié)論聚類分析、非線性映射和相似度計算等方法可實現(xiàn)對指紋圖譜的定性、定量評價，所建立的色譜指紋圖譜可用于穿心蓮藥材的鑒別及質(zhì)量評價。上述公開報道的文獻主要是對穿心蓮藥材指紋圖譜的研究，而本發(fā)明是對穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法的建立。穿心蓮提取物是由穿心蓮經(jīng)過提取加工而成，為常用中藥成方制劑穿心蓮片、穿心蓮膠囊、蓮芝消炎片等的中間體及一些化妝品、獸藥的原料。穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法尚未見有文獻報道和專利申請。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供從穿心蓮中制備穿心蓮提取物的方法及穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法。制備得到的穿心蓮提取物可以作為常用中藥成方制劑穿心蓮片、穿心蓮膠囊、蓮芝消炎片等的中間體及一些化妝品、獸藥的原料。通過穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法能有效地控制穿心蓮提取物的質(zhì)量，從而確保穿心蓮提取物相關(guān)產(chǎn)品的有效性、安全性、穩(wěn)定性和均一性。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是1.將穿心蓮用乙醇提取，制備穿心蓮提取物；2.供試品溶液的制備精密稱取穿心蓮提取物，加甲醇溶液，浸泡，超聲處理，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即為供試品；3.色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液；檢測波長為254nm;4.測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色l普法測定，得到指紋圖譜。以上所述第l步的穿心蓮提取物的制備方法取干燥的穿心蓮的地上部分，粉碎成粗粉，用85%乙醇(體積濃度)熱浸提取二次，每次2小時，每次加8倍量85%乙醇(體積比)，合并提取液，濾過，濾液80'C以下減壓回收乙醇濃縮至相對密度為1.301.32(60°C),8(TC以下真空干燥，即得。以上所述第2步的中的甲醇溶液為40%甲醇(體積比)的水溶液。以上所述第3步的中供試品溶液的制備精密稱取穿心蓮提取物(過四號篩)0.5g，置25mL量瓶中，加入40%甲醇(體積比)20mL，浸泡lh，超聲處理(功率160W，頻率40kHz)20min，放冷，加40%甲醇(體積比)至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45um)濾過，即為供試品樣；以上所述第3步的中的流動相B為0.1%磷酸水溶液。以上所述第4步的中所述色譜條件檢測波長為254nm;柱溫25°C;進樣量5^1;流動相A相為乙腈，B相為O.P/。磷酸溶液，流速為1.0mL/min。采用梯度洗脫，梯度洗脫程序如下0~18分鐘，流動相A為23.5。/。的乙腈、B為76.5。/。的0.1。/。磷酸溶液；18~40分鐘，流動相A為38。/。的乙腈、B為62%的0.1%磷酸溶液；40~55分鐘，流動相A為46。/n的乙腈、B為54%的0.1%磷酸溶液；55-60分鐘，流動相A為24。/。的乙腈、B為76。/。的0.1。/。磷酸溶液。以上所述A相乙腈和流動B溶液的配制比例是按體積比配制。以上所述穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法參照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄VID)，結(jié)合指紋圖譜的要求進行測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用WatersXTerraTMRP!8色譜柱(4:6腿X250mm，5Wn)色譜柱；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按比例進行梯度洗脫，流速為l.OmL/min;檢測波長為254nm。理論板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于8000，按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于70000。參照物溶液的制備精密稱取穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每lmL各含O.lmg的溶液，搖勻，即得。測定法分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各5ial，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。本發(fā)明的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步是1.穿心蓮藥材及其復(fù)方制劑多以二萜內(nèi)酯類成分中含量較高的穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。然而，單一的某成分含量測定不能完全反映中藥的藥效作用。指紋圖譜技術(shù)是目前反映中藥作用機理的最有效途徑，是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)之一，是中藥質(zhì)量控制最先進技術(shù)。因此，我們將指紋圖譜的技術(shù)應(yīng)用于穿心蓮提取物的質(zhì)量控制中。2.本發(fā)明建立的穿心蓮提取物HPLC指紋圖譜，代表著穿心蓮部分藥理活性，能有效地表征穿心蓮提取物的質(zhì)量。3.以穿心蓮提取物的HPLC指紋圖譜作為控制其質(zhì)量的手段，既避免了因只測定一、二個化學(xué)成分而判定穿心蓮整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標(biāo)而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評價穿心蓮提取物的質(zhì)量提供了有效方法，從而使.其進一步的產(chǎn)品的質(zhì)量及療效得到保證。4.本發(fā)明具有方法簡便，易于掌握，穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好的特點。具體實施方式實施例l穿心蓮提取物的制備取干燥的穿心蓮的地上部分，粉碎成粗粉，用體積比85%乙醇熱浸提取二次，每次2小時，每次加8倍量85%乙醇，合并提取液，濾過，濾液80。C以下減壓回收乙醇濃縮至相對密度為1.301.32(6(TC)，8(TC以下真空干燥，即得。實施例2穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法取上述實施例1得到的穿心蓮提取物，粉碎過四號篩，精密稱取0.5g，置25mL量瓶中，加入體積比40%甲醇20mL，^泡lh，超聲處理(功率160W，頻率40kHz)20min，放冷，加40%甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45ym)濾過，即為供試品樣；另精密稱取穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成每lmL各含O.lmg的溶液，搖勻，作為參照物溶液；分別精密吸取參照,物溶液與供試品溶液各5^1，注入液相色譜儀，測定。實施例2的色譜柱的選擇曾選用Lichrospher<:18柱(4.6mmX250mm，5Pm)、WaterspBONDAPAKC18色譜柱(PIN27324)禾卩WatersXTerraTMRPw色譜柱(4.6mmX250mm，5Mm)進行試驗篩選，比較分離度、出峰數(shù)、峰形和柱效，結(jié)果WatersXTerraTMRP,8色譜柱(4.6mmX250mm，5Wn)較為合適，故選其作為指紋圖譜研究的色譜柱。實施例2的流動相的選擇試驗過程中曾選擇甲醇一水、甲醇一磷酸溶液和乙腈一磷酸溶液等多組流動相系統(tǒng)，以不同的比例和不同的梯度進行梯度洗脫。結(jié)果以乙腈一0.1%磷酸溶液(體積比)的梯度洗脫為佳，色譜圖上在254nm的各色譜峰分離效果及形狀較好，故選其作'為指紋圖譜研究的流動相。實施例2的檢測波長的選擇參考有關(guān)文獻，曾分別選用225nm和254nm為檢測波長。以225nm為檢測波長時，檢出峰數(shù)雖較多，但分離效果不好，基線不平；而以254nm為檢測波長時，檢出的峰數(shù)雖比在225nm檢出的峰數(shù)少2個，但其分離度、峰形和柱效及出峰的穩(wěn)定性較為滿意，故選擇254nm為檢測波長。實施例2的系統(tǒng)適用性試驗根據(jù)以上研究結(jié)果，擬訂色譜條件為WatersXTerraTMRP18色譜柱(4.6mmX250mm，5陶)；以乙腈為流動相A，以O(shè).P/。磷酸溶液為流動相B，按表l進行梯度洗脫，'流速為1.0mL/min;檢測波長為254nm;柱溫25。C;進樣量5PL。表1流動相條件及梯度條件時間Cmin)流動相A(%)流動相B(%)o-4823.576.518'-403862格。55465455--602476用擬訂的色譜條件檢測穿心蓮提取物10批，按穿心蓮內(nèi)酯峰計算理論板數(shù)，結(jié)果均在8000以上，故擬訂理論板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于8000;按'脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計算理論板數(shù)，結(jié)果均在70000以上，故擬訂理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于70000。實施例2的參照峰的標(biāo)定取參照物溶液和供試液各5PL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖12)，供試品色譜圖中，以參照物溶液中脫水穿心蓮內(nèi)酯峰保留時間相應(yīng)位置上的峰'為參照峰。實施例2的記錄時間記錄60min色譜圖，35min以后沒有出峰，提示35min內(nèi)穿心蓮提取物成分出峰完全。實施例2的方法學(xué)考察(1)穩(wěn)定性試驗精密吸取同一樣品(9#)溶液各5PL，每隔一定時間進樣測定一次，共測定6次。結(jié)果各共有峰的相對保留時間和峰面積比值的RSD均小于3。/。(見表23);使用相似度計算軟件(國家藥典委員會推薦的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的操作規(guī)范(版本2004A)"，下同。)計算相似度，各指紋圖譜相似度均為1.000，符合色譜指紋圖譜研究技術(shù)要求。表2穩(wěn)定性試驗各共有峰的相對保留時間<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3穩(wěn)定性試驗各共有峰的相對峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)精密度試驗精密吸取同一樣品(9#)溶液各5HL，分別連續(xù)6次進樣測定。'結(jié)果各共有峰的相對保留時間和峰面積比值的RSD均小于3%(見表45);使用相似度計算軟件計算相似度，各指紋圖譜相似度均為1.000，符合色譜指紋圖譜研究技術(shù)要求。表4精密度試驗各共有峰的相對保留時間<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表5精密度試驗各共有峰的相對峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(3)重現(xiàn)性試驗取同一樣品(9#)，制備6份供試品溶液，分別進樣測定。結(jié)果各共有峰的相對保留時間和峰面積比值的RSD均小于3e/。(見表67);使用相似度計算軟，件計算相似度，各指紋圖譜相似度均為1.000，符合色譜指紋圖譜研究技術(shù)要求。表6重現(xiàn)性試驗各共有峰的相對保留時間<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表7重現(xiàn)性試驗各共有峰的相對峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2的樣品的測定取實施例1穿心蓮提取物10批，每批2份，制成穿心蓮提取物供試液，按擬訂的色譜條件測定，記錄色譜圖。實施例2的共有峰的選擇根據(jù)IO批樣品測定結(jié)果，各批樣品指紋圖譜色譜峰均在35min內(nèi)全部出完。我們主要是對穿心蓮內(nèi)酯類成分指紋圖譜研究，而色譜保留時間5分鐘前一般"是溶劑及雜質(zhì)峰，故選擇共有峰時扣除保留時間5分鐘前的色譜峰。綜合10批樣品的色譜圖，從5min之后，有10個峰是10批樣品所共有，其中6號峰為穿心蓮內(nèi)酯峰，IO號峰為脫水穿心蓮內(nèi)酯峰。各批樣品的10個峰總面積占總峰面積比例均大于90%，因此確定這10個峰為共有指紋峰。實施例2的穿心蓮提取物指紋圖譜檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立采用國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的操作規(guī)范(版本2004A)，采用均值法，由10批樣品的20個指紋圖譜生成對照指紋圖譜(見圖3)。以對照譜圖為參照，各樣品指紋圖譜與對照譜圖進行比較，計算得不同批次穿心蓮提取物指紋圖譜相似度值，結(jié)果各批提取物與對照指紋圖譜之間的相似度均大于0.90，平均0.942，RSD為3.28%(見表8)。表8IO批穿心蓮提取物指紋圖譜測定結(jié)果(n=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)以上試驗結(jié)果，并結(jié)合中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求，暫定本品指紋圖譜應(yīng)與對照指紋圖譜一致，相似度值不得低于0.90。圖1是本發(fā)明實施例2所說的參照物圖。圖2是本發(fā)明實施例2所說的穿心蓮提取物指紋圖譜。圖3是本發(fā)明實施例2所說的穿心蓮提取物對照指紋圖譜。圖中的編號110為共有峰，6和10分別為穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯參照峰。權(quán)利要求1.一種穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于(a)將穿心蓮用乙醇提取，制備穿心蓮提取物；(b)供試品溶液的制備精密稱取穿心蓮提取物，加甲醇溶液，浸泡，超聲處理，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即為供試品；(c)色譜條件色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為磷酸溶液；檢測波長為254nm；(d)測定精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于穿心蓮提取物的制備方法是取干燥的穿心蓮的地上部分，粉碎成粗粉，用體積比85%乙醇熱浸提取二次，每次2小時，每次加8倍85%乙醇，合并提取液，濾過，濾液8(TC以下減壓回收乙醇濃縮至60。C時相對密度為1.301.32，8(TC以下真空干燥，即得。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于甲醇溶液為體積比40%的甲醇水溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于供試品溶液的制備是精密稱取穿心蓮提取物，過四號篩0.5g，置于量瓶中，加入體積比40%甲醇20mL，浸泡lh，用功率160W，頻率40kHz超的聲處理20min，放冷，加體積比40%甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，即為供試品樣。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于流動相B為體積比O.1%磷酸水溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，其特征在于所述色譜條件檢測波長為254nm;柱溫25。C;進樣量5^1;流動相A相為乙腈，B相為按體積比0.1%磷酸溶液，流速為LOmL/min。采用梯度洗脫，梯度洗脫程序如下018分鐘，流動相A為體積比23.5%的乙腈、B為76.5%的0.1%磷酸溶液；18~40分鐘，流動相A為體積比38%的乙腈、B為62%的0.1%磷酸溶液；40~55分鐘，流動相A為體積比46%的乙腈、B為54%的0.1%磷酸溶液；55~60分鐘，流動相A為體積比24。/。的乙腈、B為76%的0.1%磷酸溶液。全文摘要本發(fā)明涉及穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法，首先將穿心蓮用乙醇提取，制備穿心蓮提取物，然后精密稱取穿心蓮提取物，加甲醇溶液，浸泡，超聲處理，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，作為供試品；采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；采用梯度洗脫，流動相A為乙腈，流動相B為0.1％磷酸溶液；檢測波長為254nm；精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。本發(fā)明穿心蓮提取物的指紋圖譜測定方法簡便，易于掌握，且穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性均良好，可用于穿心蓮提取物的質(zhì)量控制，確保穿心蓮提取物相關(guān)產(chǎn)品的有效性、安全性、穩(wěn)定性和均一性。文檔編號G01N30/00GK101231273SQ200810073460公開日2008年7月30日申請日期2008年2月3日優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日發(fā)明者茂李,蔣珍藕,饒偉源申請人:廣西壯族自治區(qū)天然藥物研究中心