專利名稱：：一種用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域。特別是涉及一種用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒。二、
背景技術(shù)：
卵巢惡性腫瘤是目前國內(nèi)外常見的婦科惡性腫瘤，其死亡率已占全部婦女惡性腫瘤的第四位，盡管近20年來，人們在治療方面做了相當(dāng)大的努力包括新的藥物和方案的發(fā)現(xiàn)、手術(shù)的改進。但死亡率高居婦科惡性腫瘤首位，五年生存率僅為30%左右。造成其死亡率居高不下的重要原因之一是缺乏早期診斷的手段，70%的病人初診時已為晚期患者。雖然各種新的卵巢腫瘤標(biāo)記物及新的卵巢惡性腫瘤的診斷手段層出不窮，但由于卵巢惡性腫瘤早期癥狀不明顯，外科手術(shù)和物理影像學(xué)檢測費用高昂、費時，造成對于無癥狀、無家族史的婦女進行早期卵巢惡性腫瘤的診斷、篩查手段仍然不盡人意。迄今為止，沒有一個有效的血清標(biāo)志物用于個體篩查和早期診斷，包括血清CA125對I期卵巢惡性腫瘤的診斷特異性、敏感性也僅有25%-30%左右，因此，早期發(fā)現(xiàn)、對卵巢惡性腫瘤進行早期診斷對于改善卵巢惡性腫瘤患者的預(yù)后有著極其重要的意義。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，它能夠?qū)β殉矏盒阅[瘤進行早期檢測，改善卵巢惡性腫瘤患者的預(yù)后。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的一種用于早期卵巢癌診斷的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，由重組人趨化因子配體18(以下簡稱CCL18)和重組人黑色素瘤生長激活因子-a(以下簡稱CXCL1)參照品、鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體、兔抗人CCL18多克隆抗體、兔抗人CXCL1多克隆抗體、HRP標(biāo)記的人抗兔IgG、多克隆抗體包被板、質(zhì)控品和輔助試劑組成。所述重組人CCL18和重組人CXCL1參照品是經(jīng)CCL18和CXCL1cDNA克隆、重組蛋白的誘導(dǎo)表達、NiNTA螯合樹脂層析分離純化而獲得。所述兔抗人CCL18多克隆抗體，兔抗人CXCL1多克隆抗體，是將重組人CCL18，重組人CXCL1，免疫新西蘭兔，經(jīng)過3-4次加強免疫后符合效價要求時，立即頸動脈采血，分離血清后，用ProteinG柱親和層析純化獲得。所述鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體是將純化的His融合蛋白與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)皮下注射免疫BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔注射加強免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原，共加強免疫，取效價高的老鼠，脾內(nèi)注射抗原加強免疫4天后，取脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0在PEG4000作用下融合，用間接酶聯(lián)免疫法篩選單克隆抗體(mAb)分泌陽性的雜交瘤細胞，經(jīng)3、4次有限稀釋法克隆化后,選擇2株mAb分泌持續(xù)陽性的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，并按常規(guī)制備腹水并純化獲得。所述多克隆抗體包被板是將兔抗人CCL18多克隆抗體和兔抗人CXCL1多克隆抗體稀釋后滴入酶標(biāo)板各孔，經(jīng)吸附、洗板、封閉、吹干等步驟處理后制得。所述輔助試劑包括酶聯(lián)反應(yīng)溶液、顯色液、終止液及清洗緩沖液。本發(fā)明所述用于檢測早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒的制作方法包括標(biāo)準(zhǔn)品的制備、單克隆抗體、多克隆抗體的制備、多克隆抗體包被板的制作及輔助試劑的配置。(一)試劑盒的CCL18、CXCL1標(biāo)準(zhǔn)品制備步驟1、CCL18和CXCL1cDNA的克隆(1)卵巢癌組織總RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):取新鮮卵巢癌組織組織，液氮冷凍后按RNA提取試劑盒中的說明抽提RNA，用紫外分光光度法鑒定其純度，甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性。經(jīng)電泳證實RNA無降解后進行反轉(zhuǎn)錄，操作按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行。(2)PCR擴增根據(jù)GenBank中CCL18和CXCL1的cDNA序列，設(shè)計引物，用以擴增編碼成熟蛋白cDNA。CCL18引物1:5，GCACMGTTGGMCCMCA3，；引物2:5，TCAGGCATTCAGCTTCAG3，；CXCL1引物1:5'GCGTCCGTGGCCACTGM3';引物2:5，AGTGTTGGATTTGTCACTGTTCAGCAT3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化。(3)cDNA的鑒定將純化的PCR產(chǎn)物與pETSUMOTACloning載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌MachltTlRE.coli。轉(zhuǎn)化菌液涂布于含5(￥g/ml的卡那霉素的LB平板上，于37t:培養(yǎng)過夜,挑取白色菌落進行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，以質(zhì)粒引物進行PCR鑒定，陽性克隆進行DNA測序，選擇正向連入了PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達。2、重組蛋白的誘導(dǎo)表達將pETSUMOTACloning表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞BL21(DE3),挑取菌落PCR陽性的單菌落接種于含卡那霉素LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1:50轉(zhuǎn)染，加入終濃度分別為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后，以12000rpm離心收集誘導(dǎo)表達后的菌體沉淀，將沉淀重懸于裂解緩沖液(50畫l/LTris'HCl，0lmmol/LEDTA，100mmol/LNaCl，pH75，0lmg/ml溶菌酶)中，冰上裂解lh后超聲破碎，離心后再取上清，經(jīng)NiNTA螯合樹脂層析,洗脫回收蛋白。將洗脫液離心超濾濃縮(可截留5ka以上的蛋白)，最后測定得到的蛋白溶液濃度。經(jīng)ESI—MS/MS質(zhì)譜鑒定獲得重組CCL18和CXCL1蛋白。(二)兔抗人CCL18多克隆抗體、兔抗人CXCL1多克隆抗體制備步驟分別選用2.5k新西蘭兔3只，免疫前取血作為陰性血清對照。將定量后的His融合蛋白與弗氏完全佐劑等量乳化后，于兔背部皮下多點注射，每點約100ug。2周后加強免疫，劑量同前，用不完全福氏佐劑充分乳化后，于兔背部皮下多點注射；以后隔2周加強免疫1次；從第3次加強免疫開始，每次免疫后7d，經(jīng)耳中央動脈采血測定抗體的效價，經(jīng)過4次加強免疫后符合要求時，立即頸動脈采血，分離血清后，用ProteinG柱親和層析純化，無菌分裝保存于-8(TC備用。將純化出的CCL18和CXCL1蛋白抗原稀釋后以125^g/ml每孔200u1包被96孔酶標(biāo)板,兔免疫前血清作為陰性對照，最后一次加強免疫后的血清作為陽性血清，行間接酶聯(lián)免疫檢測多克隆抗體的效價。多克隆抗體Western印跡檢測提取重組大腸肝菌BL21(DE3)裂解總蛋白，進行SDSPAGE凝膠電泳，分別以制備的多克隆抗體，購買的商品化CCL18和CXCL1單克隆抗體，以及免疫前陰性對照血清作為一抗，以羊抗兔辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體為二抗，進行Western印跡檢測抗體的特異性。(三)鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體制備步驟用120uL純化的His融合蛋白(25g/L)稀釋于880uLPBS(0lmol/LPB、015mol/LNaCl)并與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)皮下注射免疫BALB/c小鼠(50ug/只)。一個月后，經(jīng)腹腔注射加強免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原，注射劑量同前，共加強免疫3次，每次間隔2周。檢測抗血清的效價，取效價高的老鼠，脾內(nèi)注射10ug抗原加強免疫，4d后，取脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0在PEG4000作用下融合。用間接酶聯(lián)免疫法篩選單克隆抗體(mAb)分泌陽性的雜交瘤細胞。經(jīng)3、4次有限稀釋法克隆化后，選擇2株mAb分泌持續(xù)陽性的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，并按常規(guī)制備腹水并純化。mAb的特性鑒定(1)效價測定:采用間接酶聯(lián)免疫法。用50uLCCL18和CXCLl蛋白(lmg/L)包被酶標(biāo)板。一抗為適當(dāng)稀釋的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清或腹水樣本，二抗為1:2000的HRP羊抗鼠IgG。(2)Ig亞類(型)的鑒定:參照試劑盒的說明書進行。(3)特異性鑒定:純化的融合蛋白進行SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜于封閉液中封閉后，先后與抗CCL18和CXCL1的mAb和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG進行孵育，進行Western印跡檢測抗體的特異性。(四)多克隆抗體包被板的制作步驟將上述多克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100ul，吸附過夜，用吐溫20磷酸鹽緩沖液洗板，再用吐溫20磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得多克隆抗體包被酶標(biāo)板。(五)輔助試劑的配制步驟(1)底物溶液采用磷酸-檸檬酸緩沖液(PH=5.0)配制的3%過氧化氫溶液。(2)顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為O.lmg/ml。(3)反應(yīng)終止2mol.l^硫酸(4)清洗緩沖液PBS(pH=7.4)配制的0.05%吐溫20磷酸鹽溶液。四圖1是本發(fā)明建立區(qū)分卵巢惡性腫瘤和非惡性腫瘤的分類樹模型示意圖。五具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細描述。實施例一CCL18、CXCL1定量酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒應(yīng)用實例一種卵巢癌蛋白標(biāo)志物CCL18、CXCL1定量酶免檢測酶聯(lián)免疫試劑盒96人份，其中包括CCL18、CXCL1重組蛋白、多克隆抗體積96孔包被板各一塊。酶聯(lián)免疫法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。(2)加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。(3)加酶標(biāo)抗體使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。(4)加底物夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。本實例采用兩株來源不同免疫動物的抗體，其中一株作為包被酶標(biāo)板的捕獲抗體，以識別和結(jié)合待檢測血清中的抗原，另一株作為檢測抗體，與結(jié)合包被抗體的抗原的另一種表位結(jié)合，并與HRP標(biāo)記的酶標(biāo)抗體結(jié)合，催化底物顯色。捕獲抗體和檢測抗體分配按表l。表1檢測潛在血清標(biāo)記物抗體來源<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>酶聯(lián)免疫檢測血清CCL18包被捕獲抗體的濃度為1Ug/ml，檢測抗體的濃度為0.2"g/ml;CXCLl包被捕獲抗體的濃度為50ng/ml，檢測抗體的濃度為0.5tig/ml。1、參照品標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的確定按確定上述捕獲抗體的最佳濃度包被96孔板，將CCL18,CXCLl的參照品稀釋如下濃度梯度:31.2pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml加入100^1至96孔板。，加入最佳濃度二抗，測0D450。根據(jù)包被濃度與相應(yīng)的0D450值繪制曲線，選取線性范圍的包被濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、血清檢測濃度的確定分別取各組三份血清，將血清樣品稀釋2X，5X，IOX進行測定，每樣品兩個重復(fù)，以0D450值在0.6-1.5且在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍上限的濃度為最終實驗濃度。3、潛在血清標(biāo)記物酶聯(lián)免疫法檢測步驟方法1)用包被液將捕獲抗體稀釋至所需濃度。2)包被每孔加100u1稀釋好的捕獲抗體4"C包被16h。3)甩盡包被液并拍干，按300ii1/孔的量用洗板液洗板3次，每次振蕩5min。4)按300u1/孔用封閉液37'C封閉4小時。5)抗原抗體反應(yīng)按上述方法洗板并拍干后，按100ul/孔的量加入稀釋好的血清，37。C孵育2h。6)檢測抗體反應(yīng)洗板甩干，按100ul/每孔加入所需稀釋度的檢測抗體,37。C孵育2h。7)每孔加入1:1000的每孔加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的人抗羊或人抗兔鼠IgG100uL，37-C孵育15min。8)甩干液體后洗板液洗板3次，拍干后按100u1/孔加入TMB顯色底物(A、B液l:l混勻)，37'C避光顯色30分鐘。9)每孔加入終止液50ix1終止，混勻后立即測0D450。4、血清檢測設(shè)計每板均設(shè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)空白對照孔(復(fù)孔)每份血清樣品設(shè)2個復(fù)孔，結(jié)果分析時取其平均值減去空白對照孔平均值得到該樣品的初始值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出待測標(biāo)本中抗原含量。5、結(jié)果判斷及統(tǒng)計學(xué)分析采用SSPS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，根據(jù)卵巢癌、卵巢良性腫瘤患者和正常對照人群血清中各潛在血清標(biāo)記物的含量繪制受試者工作特征曲線ROC(receiveoperatingcharacteristiccurve),根據(jù)ROC曲線分析卵巢癌潛在血清標(biāo)記物的含量對卵巢癌檢測的敏感性和特異性。敏感性定義為所有卵巢惡性腫瘤患者血清樣品中正確診斷為陽性的比例，特異性定義為所有卵巢良性腫瘤患者及正常對照人群血清樣品中正確診斷為陰性的比例。將達到最佳敏感性與特異性的cutoff值作為判斷陽性、陰性的臨界值。評估診斷的準(zhǔn)確性，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，并與CA125檢測的結(jié)果比較，結(jié)果見表2。表2CCL18、CXCL1與CA125對不同臨床病理分期卵巢惡性腫瘤的判別結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6、CCL18、CXCL1血清標(biāo)記物酶聯(lián)免疫法檢測模型的建立采用BiomarkerPatterns軟件對卵巢惡性腫瘤患者與對照(正常人和卵巢良性腫瘤病人)血清中各潛在標(biāo)記物的含量做線性分類分析，建立診斷模型，判斷建立診斷模型的血清標(biāo)本歸屬哪一類。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，計算模型的敏感度和特異度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，評估此診斷模型的準(zhǔn)確性。對照圖1，采用Ciphergen公司BiomarkerPatterns5.0軟件建立區(qū)分卵巢惡性腫瘤和非惡性腫瘤的分類樹模型。用此模型選擇V-foldcross-validation法，將用于建立模型的265份血清標(biāo)本隨機分成12組，進行返回驗證，將血清中CXCL1值>349.759pg/ml且CCL18含量高于40.811ng/ml的人群劃為卵巢惡性腫瘤組，反之為非惡性腫瘤組，顯示診斷模型ROC曲線下面積達到理想的診斷效果1.000，兩個分組完全判別正確。潛在血清標(biāo)志物CXCL1和CCL18建立的卵巢惡性腫瘤診斷分類樹模型BiomarkerPatterns5.0軟件建立區(qū)分卵巢惡性腫瘤和非惡性腫瘤的分類樹模型，結(jié)果表明以CXCL1和CCL18兩個指標(biāo)建立的診斷模型靈敏度和特異度達100%,優(yōu)于CA125。權(quán)利要求1、一種用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，包括96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板、過氧化物酶標(biāo)記的人抗兔IgG、多克隆抗體包被板、質(zhì)控品和輔助試劑，其特征在于還含有重組人CCL18和重組人CXCL1參照品、鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體、兔抗人CCL18多克隆抗體、兔抗人CXCL1多克隆抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，其特征在于所述重組人CCL18和重組人CXCL1參照品是經(jīng)CCL18和CXCL1cDNA克隆、重組蛋白的誘導(dǎo)表達、NiNTA螯合樹脂層析分離純化而獲得。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，其特征在于所述兔抗人CCL18多克隆抗體，兔抗人CXCL1多克隆抗體，是將重組人CCL18，重組人CXCL1，免疫新西蘭兔，經(jīng)過3-4次加強免疫后符合效價要求時，立即頸動脈采血，分離血清后，用ProteinG柱親和層析純化獲得。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，其特征在于所述鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體是將純化的His融合蛋白與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)皮下注射免疫BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔注射加強免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原，共加強免疫，取效價高的老鼠，脾內(nèi)注射抗原加強免疫4天后，取脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0在PEG4000作用下融合，用間接酶聯(lián)免疫法篩選mAb分泌陽性的雜交瘤細胞，經(jīng)3、4次有限稀釋法克隆化后，選擇2株mAb分泌持續(xù)陽性的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，并按常規(guī)制備腹水并純化獲得。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，其特征在于所述多克隆抗體包被板是將兔抗人CCL18多克隆抗體和兔抗人CXCL1多克隆抗體稀釋后滴入酶標(biāo)板各孔，經(jīng)吸附、洗板、封閉、吹干步驟處理后制得。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，其特征在于所述輔助試劑包括酶聯(lián)免疫反應(yīng)溶液、顯色液、終止液及清洗緩沖液。全文摘要本發(fā)明提供一種用于檢測早期卵巢癌診斷的檢測試劑盒，它由96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板、過氧化物酶標(biāo)記物、鼠抗人CCL18單克隆抗體、鼠抗人CXCL1單克隆抗體、兔抗人CCL18多克隆抗體、兔抗人CXCL1多克隆抗體，顯色液、終止液、標(biāo)準(zhǔn)液和蓋板膜構(gòu)成。該試劑盒使用了卵巢癌血清標(biāo)志物CCL18、CXCL1。本試劑盒可用于檢測良、惡性卵巢腫瘤，特別是檢測早期的卵巢癌。文檔編號G01N33/577GK101261275SQ20081007343公開日2008年9月10日申請日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者力李,琪王,陽志軍,黎丹戎申請人:李力;王琪;黎丹戎;陽志軍