專利名稱：一種檢測纖溶酶類物質(zhì)纖溶活性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體涉及一種檢測纖溶酶類物質(zhì)纖溶活 性的試劑盒。
技術(shù)背景目前，相關(guān)纖溶酶類物質(zhì)的體外檢測方法常用纖維蛋白平板法和瓊脂 糖-纖維蛋白平板法。但上述方法，存在著制板操作繁雜，試劑成本高， 測定結(jié)果受操作技術(shù)影響較大等缺點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、成本低，能夠?qū)崿F(xiàn)體外定性、 定量檢測纖溶酶類物質(zhì)纖溶活性的試劑盒及檢測方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是首先取300ml新鮮牛血 液，在3500-3800r/min離心20分鐘，收集血漿，并在血漿中加入500ml 蒸餾水稀釋；然后在稀釋后的血漿中滴加300ml飽和度為80%的冷硫酸銨， 滴加速度為2-3滴/秒，在4'C靜置6-8小時后在3500-3800 r / min離心 15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0. lmol/L的NaCl溶液中， 再加入300ml的蒸餾水稀釋；然后再在稀釋液中滴加200ml飽和度為80% 的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4'C靜置6-8小時后以3500-3800 r/min離心15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0.2mol/L， pH 值為7. 4的PBS緩沖液中;在溫度-50。C至-6(TC，真空度0. 08Mbar下真 空冷凍干燥20-22小時得到牛血提取物；取0. 5625-0. 6875g的牛血提取物溶于37. 5ml的pH值為7. 4的PBS緩沖液中，取1. 000-1. 125g的瓊脂 粉溶于62. 5ml水中加熱至完全溶解，然后將兩種溶液混合并在55'C保溫 5min，趁熱倒平板并搖勻，得到檢測試劑盒。按照本發(fā)明的方法制備的試劑盒，不僅可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測 纖溶酶類物質(zhì)是否具備溶栓活性，而且可以與標(biāo)準(zhǔn)品對比，計算相對溶栓 活性，具有操作簡單，檢測成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是采用本發(fā)明的試劑對纖溶酶類物質(zhì)纖溶活性觀lj定效果示意圖；圖2尿激酶濃度與纖溶面積關(guān)系曲線。
具體實施方式
具體實施方式
實施例l:尿激酶注射粉針纖溶活性測定 將醫(yī)用尿激酶粉針劑配制成200IU/ml的溶液。首先取300ml新鮮牛血液，在3500r/min離心20分鐘，收集血漿，并 在血漿中加入500ml蒸餾水稀釋；然后在稀釋后的血漿中滴加300ml飽和 度為80%的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4"C靜置6小時后在3500r / min離心15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， O.lmol / L的NaCl 溶液中，再加入300ml的蒸餾水稀釋；然后再在稀釋液中滴加200ml飽和 度為80%的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4'C靜置8小時后以3500r /min離心15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0.2mol/L， pH 值為7.4的PBS (磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液)緩沖液中；在溫度-60 'C，真空度0.08Mbar下真空冷凍干燥20小時得到牛血提取物；取0.5625g 的牛血提取物溶于37.5ml的pH值為7.4的PBS緩沖液中，取l.OOOg的瓊脂粉溶于62.5ml水中，然后將兩種溶液混合并在55-C保溫5min得到檢測 試劑(該劑量的檢測試劑可以一次制作7個直徑為9cm平板)。將檢測試 劑趁熱倒入平板中，并晃動使其均勻。待平板完全冷卻后，打孔，定量吸 取5ul樣品，加入孔內(nèi)。將平板加蓋，3rC恒溫孵育8-10小時，即可觀察 到在平板上有明顯的纖溶圈出現(xiàn)。進(jìn)行定量分析時，通過與標(biāo)準(zhǔn)品溶液對 比纖溶圈面積大小，可以計算出相對活性。實施例2:納豆激酶的纖溶活性測定將納豆激酶發(fā)酵液抽濾，濾液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用。首先取300ml新鮮牛血液，在3700r/min離心20分鐘，收集血漿，并在 血漿中加入500ml蒸餾水稀釋；然后在稀釋后的血漿中滴加300ml飽和度為 80%的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4t:靜置7小時后在3700r/min 離心15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0. lmol/L的NaCl溶液中， 再加入300ml的蒸餾水稀釋；然后再在稀釋液中滴力B200ml飽和度為80yo的 冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4'C靜置6小時后以3700r/min離心 15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0.2mol/L， pH值為7.4的PBS 緩沖液中；在溫度-55。C，真空度0.08Mbar下真空冷凍干燥20、 21、 22小 時得到牛血提取物；取O. 6g的牛血提取物溶于37. 5ml的pH值為7. 4的PBS緩 沖液中，取1.05g的瓊脂粉溶于62.5ml水中，然后將兩種溶液混合并在55 T:保溫5inin得到檢測試劑，趁熱將檢測試劑倒平板。待平板完全冷卻后， 打孔，定量吸取5ul樣品，加入孔內(nèi)。將平板加蓋，3rC恒溫孵育8-IO小 時，即可觀察到在平板上有明顯的纖溶圈出現(xiàn)。進(jìn)行定量分析時，通過與 標(biāo)準(zhǔn)尿激酶溶液對比纖溶圈面積大小，可以計算出相對活性。實施例3:尿激酶濃度與纖溶圈面積關(guān)系的測定稱取尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品粉末2mg，溶解于lml蒸餾水中，制成5000IU/ml的 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋成如下濃度2000， 1000， 500， 200， 100(IU/ml)備 用。首先取300ml新鮮牛血液，在3800r/min離心20分鐘，收集血漿，并在 血漿中加入500ml蒸餾水稀釋；然后在稀釋后的血漿中滴加300ml飽和度為 80%的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4。C靜置8小時后在3800r/min 離心15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0. lmol /L的NaCl溶液中， 再加入300ml的蒸餾水稀釋；然后再在稀釋液中滴加200ml飽和度為80呢的 冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4i:靜置7小時后以3800r/min離心 15分鐘，收集沉淀物；將沉淀物溶于150ml， 0.2mol/L， pH值為7.4的PBS 緩沖液中；在溫度-6(TC,真空度O. 08Mbar下真空冷凍干燥22小時得到牛 血提取物；取O. 6875g的牛血提取物溶于37. 5ml的pH值為7. 4的PBS緩沖液 中，取1.125g的瓊脂粉溶于62.5ml水中，然后將兩種溶液混合并在55。C保 溫5min得到檢測試劑，趁熱將檢測試劑倒入平板中。待平板完全冷卻后， 打孔，定量吸取5ul以上各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，點(diǎn)于同一塊板上，31'C恒溫 孵育8-10小時，用游標(biāo)卡尺測纖溶圈的直徑。計算溶圈面積并作圖分析其 線性關(guān)系如圖2。由于纖溶酶類物質(zhì)具有良好的預(yù)防和治療血栓的作用。因為血栓的主 要成分是纖維蛋白，纖溶酶類物質(zhì)主要作用于纖維蛋白，而起到溶栓的作 用。本發(fā)明的原理是根據(jù)在體外對纖維蛋白的作用及溶解效果來反映纖溶 酶類物質(zhì)的纖溶活性。本發(fā)明主要成分是牛血提取物，其中主要含有纖維蛋白原。操作過程 中通過物理方法，將牛血提取物中的纖維蛋白原，交聯(lián)轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，均勻的與瓊脂混合，鋪滿檢測板。由于纖溶酶類物質(zhì)可以直接作用于纖維 蛋白，并將其溶解，^f以點(diǎn)樣附近的纖維蛋白由于被溶解，而顯示出瓊脂 的半透明色，板子的其他部分因為沒有纖溶酶類物質(zhì)溶解作用，而呈現(xiàn)乳 白色(參見圖1，縱向兩個較大的纖溶圈是酶活較高的纖溶酶的纖溶效果 示意圖，橫向兩個較小的是酶活較低的纖溶酶的纖溶效果示意圖)。這樣 用肉眼就可以很直觀的看到本來乳白色的板子上，出現(xiàn)了幾個半透明的小 圈。不同酶活的纖溶酶，對纖維蛋白的溶解能力不同，顯然酶活大的纖溶 酶溶解能力強(qiáng)，其纖溶圈的直徑就大，而酶活小的纖溶酶，纖溶圈的直徑 較小。在一定的點(diǎn)樣量和一定的孵育條件下，纖溶圈的大小與酶活呈較好 的線性關(guān)系，根據(jù)這樣的性質(zhì)，可以將已知酶活的標(biāo)準(zhǔn)品與待測纖溶酶類 物質(zhì)同時點(diǎn)于一塊板子上，孵育一定時間，通過檢測纖溶圈的直徑，來計 算相對酶活。比起傳統(tǒng)的方法，節(jié)省檢測成本，并且操作簡單。
權(quán)利要求
1、一種檢測纖溶酶類物質(zhì)纖溶活性的試劑盒，其特征在于1)首先取300ml新鮮牛血液，在3500-3800r/min離心20分鐘，收集血漿，并在血漿中加入500ml蒸餾水稀釋；2)然后在稀釋后的血漿中滴加300ml飽和度為80％的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4℃靜置6-8小時后在3500-3800r/min離心15分鐘，收集沉淀物；3)將沉淀物溶于150ml，0.1mol/L的NaCl溶液中，再加入300ml的蒸餾水稀釋；4)然后再在稀釋液中滴加200ml飽和度為80％的冷硫酸銨，滴加速度為2-3滴/秒，在4℃靜置6-8小時后以3500-3800r/min離心15分鐘，收集沉淀物；5)將沉淀物溶于150ml，0.2mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液中；6)在溫度-50℃至-60℃，真空度0.08Mbar下真空冷凍干燥20-22小時得到牛血提取物；7)取0.5625-0.6875g的牛血提取物溶于37.5ml的pH值為7.4的PBS緩沖液中，取1.000-1.125g的瓊脂粉溶于62.5ml水中加熱至完全溶解，然后將兩種溶液混合并在55℃保溫5min，趁熱倒平板并搖勻，得到檢測試劑盒。
全文摘要
一種檢測纖溶酶類物質(zhì)纖溶活性的試劑盒，首先通過離心提取牛血漿，然后加入冷硫酸銨，離心收集沉淀物；將沉淀物溶于NaCl溶液中；再加入冷硫酸銨離心，再次收集沉淀物；將沉淀物溶于pH值為7.4的PBS緩沖液中；再冷凍干燥得到牛血提取物；檢測時，將牛血提取物溶于pH值為7.4的PBS緩沖液中，將瓊脂粉溶于水中，然后將兩種溶液混合，在55℃保溫5min，趁熱倒平板得到試劑盒。按照本發(fā)明的方法制備的試劑盒，不僅可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測纖溶酶類物質(zhì)是否具備溶栓活性，而且可以與標(biāo)準(zhǔn)品對比，計算相對溶栓活性，具有操作簡單，檢測成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/78GK101216432SQ20081001728
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者史卓強(qiáng), 麗 桂, 齊香君 申請人:陜西科技大學(xué)