專利名稱：一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇化的葡激酶突變體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
天然葡激酶(staphylokinase，Sak)是來源于金黃色葡萄球菌的一種蛋白質(zhì)，由 136個(gè)氨基酸組成。Sak是一“間接型”纖溶酶原激活劑，它不能直接使纖溶酶原(Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，Plm)，而是先與纖溶酶原按1 1比例結(jié)合形成無活性的復(fù)合物 Sak *plg，在少量纖溶酶啟動(dòng)下，纖溶酶原活性部位暴露，由單鏈變?yōu)殡p鏈的纖溶酶，形成活性Sak-plm復(fù)合物，后者進(jìn)一步激活纖溶酶原分子，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，纖溶酶溶解血栓基質(zhì)纖維蛋白從而溶解血栓。在血漿中，Sak · plm很快被α 2-抗纖溶酶抑制，不激活纖溶系統(tǒng)；有血栓存在時(shí)Sak · plm復(fù)合物與血栓中的纖維蛋白結(jié)合，α 2_抗纖溶酶對(duì)Sak · plm 復(fù)合物的抑制速度會(huì)下降100倍。臨床研究結(jié)果表明，它與美國治療急性心肌梗塞的標(biāo)準(zhǔn)溶栓藥物阿特普酶有等同的溶栓療效，且葡激酶激活纖溶酶原的纖維蛋白特異性更強(qiáng) (Collen D. et al. Nature Medicine. 4. 279—284(1998))。盡管葡激酶在臨床上表現(xiàn)出諸多優(yōu)點(diǎn)，但是它還存在明顯的缺點(diǎn)。葡激酶是異體蛋白，在人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的中和抗體，甚至?xí)l(fā)生超敏反應(yīng)。因此，降低葡激酶的免疫原性，已經(jīng)成為將其廣泛應(yīng)用于臨床亟待解決的問題。研究表明，Sak存在三個(gè)互不重疊的B細(xì)胞抗原決定簇，抗原表位1包括K74，E75，R77，抗原表位3包括K35， E38，E80，D82，抗原表位2尚無具體定位，可能包括一些與二聚體形成相關(guān)的氨基酸。Petra Α. M.等對(duì)^kSTAR的T細(xì)胞表位進(jìn)行了分析，篩選得到了 6個(gè)不同的免疫原性區(qū)域，其中 Sak的71-87氨基酸序列(C3區(qū))可刺激90%的T淋巴細(xì)胞克隆的特異性增殖(Warmerdam P. A. ,et al. J. Immunol.，2002，168 :155-161)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) C3 區(qū)肽段包含 Sl (72-82) 和S2(75-8Q 二個(gè)重疊的T細(xì)胞表位序列，其中Y73、F76位氨基酸分別為兩個(gè)表位的關(guān)鍵氨基酸，將它們替換為A，則肽段S1、S2與HLA-DR的結(jié)合能力下降。以上研究結(jié)果表明，C3 區(qū)段是B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位非常集中的區(qū)域。對(duì)蛋白質(zhì)的關(guān)鍵性抗原表位進(jìn)行聚乙二醇定點(diǎn)修飾，既可以去除B細(xì)胞抗原表位，也可以去除T細(xì)胞抗原表位，可以顯著降低蛋白質(zhì)的免疫原性，并且可以延長蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇化葡激酶突變體及其制備方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種所述聚乙二醇化葡激酶突變體作為血栓栓塞性疾病溶栓治療藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的本發(fā)明選擇葡激酶71-87位氨基酸序列之中的任一親水性氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其替換為半胱氨酸(簡寫為C)，然后使用甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)此半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，希望對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行的聚乙二醇修飾能夠綜合破壞這個(gè)
4區(qū)段內(nèi)的T、B細(xì)胞表位，所構(gòu)建的聚乙二醇化葡激酶突變體的免疫原性大大降低，并延長其在體內(nèi)的血漿半衰期，同時(shí)保留其溶解血栓的纖溶活性。所選擇的突變氨基酸包括第74 位賴氨酸(簡寫為K74)、第75位的谷氨酸(簡寫為E75)、第77位精氨酸(簡寫為R77)、第 80位的谷氨酸(簡寫為E80)和第82位天冬氨酸(簡寫為D82)。具體地，本發(fā)明設(shè)計(jì)的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SPQ是將野生型Sak 的K74替換為半胱氨酸(簡寫為C)后，再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇 (簡寫為即)對(duì)葡激酶突變體&ik(K74C)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)純化后得到的產(chǎn)物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連。本發(fā)明設(shè)計(jì)的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E75C_SPO是將野生型Sak的E75替換為半胱氨酸(簡寫為C)后，再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇(簡寫為 P5)對(duì)葡激酶突變體&ik(E75C)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)純化后得到的產(chǎn)物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連。本發(fā)明設(shè)計(jì)的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(R77C_SPO是將野生型Sak的R77 替換為半胱氨酸后，再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體 Sak(R77C)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)純化后得到的產(chǎn)物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連。本發(fā)明設(shè)計(jì)的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E80C-SPO和Mk (E80C-SP10)分別是將野生型Sak的E80替換為半胱氨酸后，再用分子量為5000和10000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體Sak(ESOC)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)純化后得到的產(chǎn)物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連。本發(fā)明設(shè)計(jì)的突變體Sak(D82C-SPO是將野生型Sak的D82替換為半胱氨酸后， 再用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體Sak(D82C)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)純化后得到的產(chǎn)物，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連。本發(fā)明所述的聚乙二醇化的葡激酶突變體的制備方法包括以下步驟(1)本發(fā)明選擇K74、E75、R77、E80和D82作為突變位點(diǎn)，使用基因工程方法分別將它們突變?yōu)榘腚装彼岷?，?jīng)過表達(dá)和純化后得到葡激酶突變體，再用分子量為5000或 10000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、 Sak(ESOC), Sak(D82C)中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，經(jīng)過純化后得到聚乙二醇化葡激酶突變體，聚乙二醇化葡激酶突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連；與野生型葡激酶相比，所構(gòu)建聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SP5)、 Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、Sak (E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)和 Sak (D82C-SP5)的免疫原性顯著降低，纖溶活性基本保留，體內(nèi)的血漿半衰期明顯延長；(2)根據(jù)步驟⑴設(shè)計(jì)Sak突變體的突變引物，并以野生型Mk的表達(dá)質(zhì)粒 PBV-Sak為模板，使用突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接得到表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆；使用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA，核苷酸序列分析驗(yàn)證是否發(fā)生預(yù)計(jì)位置的突變；(3) Sak突變體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到各個(gè)突變體的工程菌，所使用的細(xì)胞為大腸桿菌，菌株可以是DH5a、JF1125、JM109或BL21 ；通過升高培養(yǎng)溫度(達(dá)到42°C)可以誘導(dǎo) Sak (K74C)、Sak (E75C)、Sak (R77C)、Sak (E80C)、Sak (D82C)基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在；(4)發(fā)酵技術(shù)=WM9CA培養(yǎng)基培養(yǎng)Sak突變體工程菌，pH = 6. 5-7. 5，溫度37 °C時(shí)， 培養(yǎng)菌體，在42°C時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；(5) Sak突變體工程菌發(fā)酵后，離心收集菌體，重懸后超聲破碎菌體，離心并收集上清液，用色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序?yàn)殛栯x子交換色譜、凝膠過濾色譜和陰離子交換色譜，得到高純度的葡激酶突變體Sak (K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、 Sak (D82C)；(6)根據(jù)葡激酶突變體濃度，加入20倍摩爾量的二硫蘇糖醇(DTT)，37°C水浴反應(yīng)1. 5小時(shí)后，凝膠過濾色譜除去未反應(yīng)的二硫蘇糖醇；用0. IM的乙酸或氫氧化鈉將濃度為 100 μ M 的葡激酶突變體 Sak (K74C)、Sak (E75C)、Sak (R77C)、Sak (E80C)、Sak (D82C)溶液的ρΗ調(diào)整到5. 0-7. 5，加入修飾劑分子量為5000或10000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇， 室溫反應(yīng)1小時(shí)；用色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序?yàn)殛栯x子交換色譜、凝膠過濾色譜， 得到高純度的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SPQ、Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、 Sak(E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)和 Sak (D82C-SP5)。(7)與野生型Sak性質(zhì)比較表明，聚乙二醇化葡激酶突變體Sak (K74C-SP5)、 Sak(E75C-SP5), Sak(R77C-SP5)和 Sak(D82C-SP5)纖溶活性略有降低，Sak(E80C-SP5) 和Sak (E80C-SP10)纖溶活性稍有增高；將野生型Sak及聚乙二醇化葡激酶突變體 Sak (K74C-SP5)、Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、Sak (E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)禾口 Sak (D82C-SP5)免疫Balb/c小鼠，測(cè)定小鼠體內(nèi)的IgG抗體水平，發(fā)現(xiàn)聚乙二醇定點(diǎn)修飾的突變體 Sak (K74C-SP5)、Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、Sak (E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10) 和Sak(D82C-SPO所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度顯著下降(ρ < 0. 0 ；新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇化葡激酶突變體Sak (K74C-SP5)、Sak (E75C-SP5)、 Sak(R77C-SP5), Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和 Sak(D82C-SP5)的體內(nèi)半衰期與野生型Sak相比顯著延長(ρ < 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型Sak相比，聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C_SP5)、 Sak (E75C-SP5)、Sak (R77C-SP5)、Sak (E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)和 Sak (D82C-SP5)的免疫原性顯著降低，但是溶解血栓的纖溶活性卻得到了保留，同時(shí)，血漿半衰期得到了延長， 藥效更持久，可以作為血栓栓塞性疾病的溶栓治療藥物使用。本發(fā)明取得的有益效果如下本發(fā)明的技術(shù)方案提供了對(duì)葡激酶分子中抗原表位較為集中的區(qū)域71-87內(nèi)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變和聚乙二醇定點(diǎn)修飾的方法以及聚乙二醇化葡激酶突變體制備的工藝，所得到的聚乙二醇化葡激酶突變體純度和產(chǎn)率均較高，易于工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明所提供的聚乙二醇化葡激酶突變體具有免疫原性顯著下降，體內(nèi)血漿半衰期顯著延長，藥效更持久，溶解血栓的纖溶活性得到保留的特點(diǎn)，可以作為血栓栓塞性疾病的溶栓治療藥物使用。


圖 1 為野生型 Sak、Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、 Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)和 Sak(D82C-SP5)在 Balb/c 小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性抗體滴度隨時(shí)間變化圖(n = 5)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明。實(shí)施例11、葡激酶突變體&ik(K74C)基因及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建應(yīng)用基于PCR反應(yīng)原理的定點(diǎn)突變技術(shù)，以含野生型Sak基因的表達(dá)質(zhì)粒載體 PBV-Sak為模板，利用完全互補(bǔ)的含突變堿基的引物擴(kuò)增表達(dá)載體，然后用Dpn I酶切消化甲基化的模板DNA(PCR產(chǎn)物的線性載體不含甲基化位點(diǎn)，因而不被Dpn I酶消化)后， 直接轉(zhuǎn)化處于感受態(tài)的大腸桿菌DH5 α (由常規(guī)分子生物學(xué)方法制備)，重組子接種含有 50-100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)公司)提取陽性克隆的質(zhì)粒DNA。經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列分析證實(shí)已發(fā)生設(shè)計(jì)的突變，序列分析由北京華大基因生物技術(shù)公司完成。所述寡核苷酸突變引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。所述寡核苷酸突變引物的序列如下Sak (K74C)引物 1 :GCGACAGCATATTGTGAGTTTAGAGTAG
引物 2 CTACTCTAAACTCACAATATGCTGTCGC用上述篩選得到的突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α、JF1125、JM109、BL21, 含有50-100mg/ml氨芐青霉素的LB平板篩選得到工程菌單克隆，單克隆接種搖瓶中的 M9CA (Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4,葡萄糖，酪蛋白水解物)液體培養(yǎng)基，首先在37°C培養(yǎng)， 后經(jīng)升溫到42°C誘導(dǎo)表達(dá)。15% SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)考馬斯亮蘭染色，可見誘導(dǎo)后細(xì)菌裂解液在分子量約15. 5kD處有一濃集條帶，選擇表達(dá)量高的克隆作為工程菌。取部分細(xì)菌裂解液滴于纖維蛋白凝膠平板的小孔中，37°C孵育數(shù)小時(shí)，有明顯的溶圈，可見表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性。菌體經(jīng)超聲破碎后，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，突變體表達(dá)產(chǎn)物的15. 5kD 條帶主要位于上清中，說明突變體的表達(dá)產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶形式存在。2、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將搖瓶篩選Sak(K74C)的高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進(jìn)行低密度發(fā)酵，培養(yǎng)基pH6. 9，37°C培養(yǎng)菌體，42°C誘導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBQ洗滌后，-70°C保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按 1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細(xì)胞破碎完全。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果顯示，DH5a、JF1125、JM109、BL21均可高效表達(dá)Sak (K74C)，Sak (K74C)的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的40% 50% ；3、重組蛋白的分離純化SP-Sepharose FF 層析柱(5. OX 30cm)先用 10 倍柱床體積 0. 02mol/LpH5. 6NaAC-HAC緩沖液平衡。將步驟2收集的上清液加入層析柱，上樣完成后，以0. 02mol/ L pH 5. 6NaAc-HAc 洗脫至基線，以含 0-lmol/L NaCl 梯度的 0. 02mol/L pH 5. 6NaAc_HAc 緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，分部收集洗脫組分，15% SDS-PAGE鑒定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。用10倍柱床體積0. 01mol/L磷酸鈉(pH8. 5)緩沖液平衡kphadex G_50層析柱 (2. 5 X 100cm)，將含目的蛋白SP柱收集液加入層析柱，0. Olmol/L磷酸鈉(pH8. 5)緩沖液洗脫。分部收集洗脫組分，15% SDS-PAGE鑒定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。Q-Sepharose FF層析柱(2. 5 X 30cm)上樣前，先用10倍柱床體積0. 01mol/L磷酸鈉(pH8. 5)緩沖液平衡；將含目的蛋白的kphadex G_50柱收集液加入層析柱中，0. Olmol/ L磷酸鈉(pH8. 5)緩沖液洗脫至基線，以含0-lmol/L NaCl梯度的0. 01mol/L磷酸鈉緩沖液(PH8. 5)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，收集含目的蛋白質(zhì)的組分；層析過程中HD-4電腦核酸蛋白監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)蛋白峰，SDS-PAGE分析收集組分目的蛋白分布，合并含目的蛋白的收集液。并以Bradford法(蛋白定量試劑盒II)測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，Sak(K74C)上樣量為IOyg 時(shí)呈現(xiàn)單帶，未見雜質(zhì)蛋白條帶；反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析結(jié)果顯示其純度達(dá)到 97.8% ；纖維蛋白平板溶圈法測(cè)定純化過程中葡激酶突變體在各個(gè)純化組分中的纖溶活性，主要過程如下瓊脂糖溶于0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7. 4)，加熱溶解，冷卻至60°C 后與纖維蛋白原和凝血酶溶液混合，加入NaR*纖溶酶原，混勻，澆灌于平板上。凝膠形成后用打孔器打直徑3-4mm小孔。在各孔中加等體積葡激酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，37°C濕盒保溫過夜。測(cè)定各孔溶圈直徑，以標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所)活性的對(duì)數(shù)和溶圈直徑的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的活性單位。結(jié)果表明純化過程中葡激酶突變體 Sak (K74C)纖溶活性收率達(dá)到45 %。4、突變體&ik(K74C)的聚乙二醇修飾根據(jù)Sak(K74C)濃度，加入20倍摩爾量的二硫蘇糖醇(DTT)，37°C水浴，反應(yīng)1. 5 小時(shí)。上樣前用10倍柱體積的0. 02mol/L NaAC-HAC緩沖液(PH5. 6)平衡kphadex G-50 層析柱O. 5\30 11)，將上述反應(yīng)完成后的樣品以；31111/1^11速度上^^11￡1(1^ G-50層析柱， 用0. 02mol/L NaAC-HAC(PH = 5. 6)的緩沖液洗脫，分部收集洗脫組分，15% SDS-PAGE鑒定目的蛋白分布。將含葡激酶的收集液調(diào)濃度為100 μ mol/L，PH調(diào)到7. 4，加入10倍摩爾量的修飾劑甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇(MAL-PEG，分子量為5000，購自北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司)室溫下反應(yīng)1小時(shí)。上樣前用10倍柱體積的0. 02mol/L NaAC-HAC緩沖液 (PH5.6)平衡SP-S印harose FF層析柱(1. 0 X 10cm)，將上述反應(yīng)完成后的樣品調(diào)PH值5. 6 后，加樣 SP-S^harose FF 層析柱，0. 02mol/L NaAc-HAc (PH5. 6)洗脫至基線，以含 O-Imol/ L NaCl梯度的0. 02mOl/LNaAC-HAC緩沖液(PH5. 6)進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，分部收集洗脫組分， 15% SDS-PAGE鑒定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。用10倍柱體積的0. 02mol/L 磷酸鈉緩沖液(PH7. 0)平衡 kphadex G-75 層析柱(2. 5 X 100cm)，將上述 0. 16mol/L NaCL 洗脫下的樣品上樣kphadex G-75層析柱，用0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)洗脫，分部收集洗脫組分；用0. 22 μ m的濾膜過濾除菌，分裝，凍干，_80°C保存。凍干的Sak(K74C_SP5)蛋白樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣10 μ g蛋白為單帶，分子量大約30kD ；RP-HPLC分析純度達(dá)到97. 5%;纖維蛋白平板溶圈
8法測(cè)定葡激酶突變體的纖溶活性，聚乙二醇修飾和純化過程中Sak(K74C-SPO纖溶活性收率達(dá)到82%。5、聚乙二醇化葡激酶突變體纖溶活性的測(cè)定纖維蛋白平板溶圈法測(cè)定葡激酶突變體的纖溶活性，以Bradford法(蛋白定量試劑盒II)測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算可知，野生型葡激酶的比活性為9.4X104HU/mg， Sak(K74C-SP5)的比活性為8. 8X 104HU/mg，基本保留了野生型葡激酶的纖溶活性。6、野生型Sak和Sak (K74C)誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力10只6_8周的Balb/c小鼠隨機(jī)分成2組，每組5只。采用皮下注射的方法分別注射(10yg/200yl) 野生型Sak和Sak (K74C-SP5)，初次免疫記為第0天，以后每隔14天免疫一次，一共免疫4 次，每次免疫后第10天取血，將制備好的血清分裝，_20°C保存。間接ELISA法分析野生型Sak和Sak (K74C-SP5)在小鼠體內(nèi)的抗體水平將野生型和Sak(K74C-SPO樣品用包被緩沖液稀釋至10 μ g/ml, 100 μ 1/孔包被酶標(biāo)板(每一樣品包被3個(gè)復(fù)孔)，4°C濕盒過夜，含0. 5%吐溫-20的0. lmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7. 4， 簡稱PBST)洗滌3次。每孔中分別加入封閉液(1 % BSA溶液)100 μ 1，37°C濕盒溫育2小時(shí)，PBST洗滌3次。用PBS將陰性小鼠血清以及野生型Sak和Sak(K74C-SP5)免疫后的小鼠血清分別稀釋250 100000倍，加入對(duì)應(yīng)的包被了野生型Sak和Sak(K74C_SPQ的孔中 (100 μ 1/孔)，37°C濕盒溫育1小時(shí)，PBST洗滌3次。每孔分別加入1 4000稀釋的HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠IgG 100 μ 1，37°C濕盒溫育lh，PBST洗滌3次。加入TMB-過氧化氫溶液 100 μ 1，避光顯色15min，加入終止液50 μ 1終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD45tl值，確定抗原誘導(dǎo)的抗體滴度。大于或者等于陰性對(duì)照孔OD45tl值2倍的確定為陽性，低于陰性對(duì)照孔OD45tl 值2倍的確定為陰性。結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak誘導(dǎo)的抗體滴度(滴度為80000)對(duì)比，突變體 Sak(K74C-SP5)所誘導(dǎo)特異性抗體滴度(滴度為16000)顯著下降(ρ < 0. 05)。7、野生型Mk及其聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(K74C_SP5)在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)在新西蘭兔體內(nèi)進(jìn)行，耳緣靜脈2 %戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，靜脈內(nèi)SOOyg/kg野生型Sak和Sak(K74C-SP5)注射給藥，分別于給藥后1、2· 5、5、10、15、 20、30、45、60、90min股動(dòng)脈插管取血，取血后立即以8000rpm離心5min，離心后血漿立即置于-40°C冰箱保存。血漿中Sak和Sak(K74C_SPO濃度采用雙抗體夾心ELISA法分析將鼠源野生型 Sak多克隆抗體(由石家莊賽爾生物技術(shù)有限公司制備)用包被緩沖液稀釋至10yg/ml， 100 μ 1/孔包被酶標(biāo)板(每一樣品包被3個(gè)復(fù)孔)，4°C濕盒過夜，PBST洗滌3次；每孔中分別加入封閉液(1<%85々溶液)10(^1，371濕盒溫育》1，？8511洗滌3次；用PBS將適當(dāng)稀釋的兔血漿和葡激酶標(biāo)準(zhǔn)品加入對(duì)應(yīng)的包被了多克隆抗體的孔中(100μ 1/孔)，37°C濕盒溫育lh，PBST洗滌3次(3min/次)；每孔分別加入1 3000稀釋的HRP標(biāo)記的兔源野生型 Sak多克隆抗體(由石家莊賽爾生物技術(shù)有限公司制備)100 μ 1，37°C濕盒溫育lh，PBST洗滌3次；加入TMB-過氧化氫溶液100 μ 1，避光顯色15min，加入終止液50 μ 1終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD45tl值。根據(jù)葡激酶標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD45tl值之間的關(guān)系，計(jì)算血漿樣品中野生型Mk和 k (K74C-SP5)的濃度；
根據(jù)給藥后不同時(shí)間血藥濃度的測(cè)定數(shù)據(jù)，采用中國藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)編制的3p87藥代動(dòng)力學(xué)軟件在微機(jī)上擬合藥物濃度-時(shí)間曲線，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，野生型Mk的血漿分布半衰期(t1/2a)為3. 2min，血漿清除率為13士0. 3ml/min ；而聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(K74C-SP5)的t1/2a為7. 5min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(P < 0. 05)，血漿清除率為6. 2士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak顯著降低(ρ < 0. 05)。實(shí)施例21、葡激酶突變體&ik(E75C)基因及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建葡激酶突變體Sak(E75C)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程與Sak(K74C)基本相同，不同的地方僅是PCR擴(kuò)增引物的差異，Sak(E75C)所用的PCR擴(kuò)增引物為Sak (E75C)引物 1 :GCGACAGCATATAAATGTTTTAGAGTAGTTG引物 2 CAACTACTCTAAAACATTTATATGCTGTCGCSak (E75C)的 DH5 α、JF1125、JM109、BL21 工程菌單克隆篩選過程與 &ik(K74C)相同，其表達(dá)產(chǎn)物同樣以胞內(nèi)可溶形式存在。2、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將搖瓶篩選Sak (E75C)的高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進(jìn)行低密度發(fā)酵，37°C培養(yǎng)菌體，42°C溫度誘導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體，PBS洗滌后，_70°C保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細(xì)胞破碎完全。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果顯示，DH5ci、JF1125、JM109、BL21均可高效表達(dá)Sak(E75C)，Sak(E75C)的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的40% 50% ；3、Sak (E75C)重組蛋白的分離純化Sak(E75C)的分離純化過程與Sak(K74C)相同，蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，Sak(E75C)上樣量為10 μ g時(shí)呈現(xiàn)單帶，未見雜質(zhì)蛋白條帶；RP-HPLC分析結(jié)果顯示其純度達(dá)到97. 1% ；純化過程中葡激酶突變體Mk(E75C)纖溶活性收率達(dá)到 47% ；4、Sak(E75C)的聚乙二醇修飾Sak (E75C)的聚乙二醇修飾和產(chǎn)物純化過程與Sak (K74C-SP5)相同，凍干的 Sak(E75C-SP5)蛋白樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣IOyg蛋白為單帶，分子量大約30kD，未見雜質(zhì)蛋白的條帶；凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0mg/ml， RP-HPLC分析純度達(dá)到97. 7% ；聚乙二醇修飾和純化過程中Sak(E75C_SPQ纖溶活性收率達(dá)到81%。5、Sak(E75C_SP5)的纖溶活性測(cè)定Sak(E75C-SP5)的生物活性測(cè)定方法與Sak(K74C_SPO相同，計(jì)算結(jié)果表明，野生型葡激酶的比活性為9. 4X104HU/mg,Sak(E75C-SP5)的比活性為7. 5 X 104HU/mg，基本保留了野生型葡激酶的纖溶活性。6、Sak(E75C-SP5)誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力Sak(E75C-SP5)免疫Balb/c小鼠過程和誘導(dǎo)的抗體滴度測(cè)定方法與
10Sak(K74C-SP5)相同；結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak誘導(dǎo)的抗體滴度(滴度為80000) 對(duì)比，突變體&ik(E75C-SPO所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度(滴度為20000)顯著下降(ρ
<0. 05)。7、聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(E75C-SPO在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)Sak(E75C-SP5)在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、血漿中Sak(E75C-SP5) 濃度測(cè)定方法和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法均與&ik(K74C-SPO使用的方法相同。研究結(jié)果表明，野生型Sak的血漿分布半衰期(t1/2a)為3. 2min，血漿清除率為13士0. 3ml/min ；而聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(E75C-SP5)的t1/2a為7. 8min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(P < 0. 05)，血漿清除率為6. 2士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak顯著降低(ρ
<0. 05)。實(shí)施例31、葡激酶突變體&ik(R77C)基因及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建葡激酶突變體&ik(R77C)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程與Sak(K74C)基本相同，不同的地方僅是PCR擴(kuò)增引物的差異，Sak(R77C)所用的PCR擴(kuò)增引物為Sak(R77C)引物 1 :GCATATAAAGAGTTTTGTGTAGTTGAATTAGATC引物 2 :GATCTAATTCAACTACACAAAACTCTTTATATGCSak (R77C)的 DH5 α、JF1125、JM109、BL21 工程菌單克隆篩選過程與 &ik(K74C)相同，其表達(dá)產(chǎn)物同樣以胞內(nèi)可溶形式存在。2、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將搖瓶篩選Sak (R77C)的高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進(jìn)行低密度發(fā)酵，37°C培養(yǎng)菌體，42°C溫度誘導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體，PBS洗滌后，_70°C保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細(xì)胞破碎完全。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果顯示，DH5ci、JF1125、JM109、BL21均可高效表達(dá)&ik(R77C)，Sak(R77C)的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的40% 50% ；3、Sak (R77C)重組蛋白的分離純化Sak(R77C)的分離純化過程與Sak(K74C)相同，蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，Sak(R77C)上樣量為10 μ g時(shí)呈現(xiàn)單帶，未見雜質(zhì)蛋白條帶；RP-HPLC分析結(jié)果顯示其純度達(dá)到97. 2% ；純化過程中Sak(R77C)纖溶活性收率達(dá)到49%。4、Sak(R77C)的聚乙二醇修飾Sak (R77C)的聚乙二醇修飾和產(chǎn)物純化過程與Sak (K74C-SP5)相同，凍干的 Sak(R77C-SP5)蛋白樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣IOyg蛋白為單帶，分子量大約30kD，未見雜質(zhì)蛋白的條帶；凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0mg/ml， RP-HPLC分析純度達(dá)到97. 3% ；聚乙二醇修飾和純化過程Sak(R77C_SPO纖溶活性收率達(dá)到 74%。5,Sak(R77C-SP5)的纖溶活性測(cè)定Sak(R77C-SP5)的生物活性測(cè)定方法與Sak(K74C_SPO相同，計(jì)算結(jié)果表明，野生型葡激酶的比活性為9. 4X104HU/mg,Sak(R77C-SP5)的比活性為7. O X 104HU/mg，基本保留了野生型葡激酶的纖溶活性。6、Sak(R77C-SP5)誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力Sak(R77C-SP5)免疫Balb/c小鼠過程和誘導(dǎo)的抗體滴度測(cè)定方法與 Sak(K74C-SP5)相同；結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak誘導(dǎo)的抗體滴度(滴度為80000) 對(duì)比，突變體&ik(R77C-SPO所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度(滴度為20000)顯著下降(ρ
<0. 05)。7、聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(R77C-SPO在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)Sak(R77C-SP5)在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、血漿中Sak(R77C-SP5) 濃度測(cè)定方法和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法均與&ik(K74C-SPO使用的方法相同。研究結(jié)果表明，野生型Sak的血漿分布半衰期(t1/2a)為3. 2min，血漿清除率為13士0. 3ml/min ；而聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(R77C-SP5)的t1/2a為7. 6min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(P < 0. 05)，血漿清除率為6. 3士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak顯著降低(ρ
<0. 05)。實(shí)施例41、葡激酶突變體&ik(E80C)基因及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建葡激酶突變體Sak(E80C)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程與Sak(K74C)相同，不同的地方僅是PCR擴(kuò)增引物的差異，Sak(ESOC)所用的PCR擴(kuò)增引物為引物 1 :GAGTTTAGAGTAGTTTGTTTAGATCCAAGCG引物 2 CGCTTGGATCTAAACAAACTACTCTAAACTCSak (E80C)的 DH5 α、JF1125、JM109、BL21 工程菌單克隆篩選過程與 &ik(K74C)相同，其表達(dá)產(chǎn)物同樣以胞內(nèi)可溶形式存在。2、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將搖瓶篩選的Sak(ESOC)高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進(jìn)行低密度發(fā)酵，37°C培養(yǎng)菌體，42°C溫度誘導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體，PBS洗滌后，_70°C保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細(xì)胞破碎完全。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果顯示，DH5ci、JF1125、JM109、BL21均可高效表達(dá)Sak(E80C)，Sak(E80C)的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的40% 50% ；3、Sak (E80C)重組蛋白的分離純化Sak(ESOC)的分離純化過程與Sak(K74C)相同，蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，Sak(ESOC)上樣量為IOyg時(shí)呈現(xiàn)單帶，未見雜質(zhì)蛋白條帶；RP-HPLC分析結(jié)果顯示其純度達(dá)到97. 9% ；純化過程中Sak(ESOC)纖溶活性收率達(dá)到51%。4、Sak(E80C)的聚乙二醇修飾Sak(E80C)的聚乙二醇修飾過程與(K74C-SP5)相同，不同的地方是除使用分子量為5000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇進(jìn)行聚乙二醇修飾外，還使用分子量為10000 的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)Sak(ESOC)進(jìn)行聚乙二醇修飾，得到的兩種聚乙二醇化葡激酶突變體分別為&ik(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)。純化后凍干的Sak(E80C-SP5)、 Sak(E80C-SP10)樣品分別進(jìn)行15% SDS-PAGE分析，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣10 μ g蛋白均呈現(xiàn)單帶，分子量大約30kD，未見雜質(zhì)蛋白條帶；Sak(E80C-SPQ和(E80C-SP10)樣品復(fù)溶后稀釋為1. Omg/ml，RP-HPLC分析顯示Sak (E80C-SP5)純度達(dá)到98. 1 %， Sak(E80C-SP10)純度達(dá)到 97. 9% ；Sak(E80C-SP5)和 Sak(E80C-SP10)聚乙二醇修飾過程中纖溶活性收率分別達(dá)到85%和87%。5、&ik(E80C-SP5)和 &ik(E80C-SP10)的纖溶活性測(cè)定Sak(E80C-SPQ 和 Sak(E80C-SP 10)的生物活性測(cè)定方法與 Sak(K74C_SP5)相同，計(jì)算結(jié)果表明，野生型葡激酶的比活性為9.4X104HU/mg，Sak(E80C-SP 5)的比活性為 11. 1 X 104HU/mg, Sak(E80C-SP10)的比活性為10. 1 X 104HU/mg，兩種產(chǎn)物的纖溶活性比野
生型葡激酶均略有升高。6、Sak(E80C-SP5)和&ik (E80C-SP10)誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力Sak(E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)免疫Balb/c小鼠過程和所誘導(dǎo)的抗體滴度測(cè)定方法均與&ik(K74C-SPO相同；結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak誘導(dǎo)的抗體滴度(滴度為 80000)對(duì)比，突變體&ik(E80C-SP5)、&ik(E80C-SP10)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度均顯著下降(P < 0. 05)，誘導(dǎo)的特異性抗體滴度均是16000。7、聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E80C_SPQ和&ik(E80C-SP10)在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)Sak(E80C-SP5)和(E80C-SP10)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、血漿中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法以及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法均與&ik(K74C-SPO使用的方法相同。研究結(jié)果表明，野生型Sak的血漿分布半衰期(t1/2a)為3. 2min，血漿清除率為13士0. 3ml/min ；而聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(E80C-SP5)的t1/2a為7. 9min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(P < 0. 05)，血漿清除率為6. 1 士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak顯著降低(ρ < 0. 05)；聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(E80C-SP10)的t1/2a為10. 2min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(ρ < 0. 05)，血漿清除率為4. 1 士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak 顯著降低(P < 0. 05)。實(shí)施例51、葡激酶突變體&ik(D82C)基因及原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建葡激酶突變體Sak(D82C)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程與Sak(K74C)相同，不同的地方僅是PCR擴(kuò)增引物的差異，Sak(D82C)所用的PCR擴(kuò)增引物為引物 1 :GAGTAGTTGAATTATGTCCAAGCGCAAAGATC引物 2 :GATCTTTGCGCTTGGACATAATTCAACTACTCSak (D82C)的 DH5 α、JF1125、JM109、BL21 工程菌單克隆篩選過程與 &ik(K74C)相同，其表達(dá)產(chǎn)物同樣以胞內(nèi)可溶形式存在。2、工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)將搖瓶篩選Sak (D82C)的高表達(dá)菌株作為工程菌，然后以2L發(fā)酵搖瓶于M9CA中進(jìn)行低密度發(fā)酵，37°C培養(yǎng)菌體，42°C溫度誘導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體，PBS洗滌后，_70°C保存待用。2L發(fā)酵液得菌體15g左右，濕菌用PBS緩沖液按1 20 (W/V)重懸，超聲波破碎儀破碎，功率400W，每次20min循環(huán)破碎，共破碎3次。顯微鏡鏡檢確定細(xì)胞破碎完全。細(xì)胞裂解液離心后收集上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果顯示，DH5ci、JF1125、JM109、BL21均可高效表達(dá)Sak(D82C)，Sak(D82C)的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的40% 50%。3、Sak (D82C)重組蛋白的分離純化
Sak(D82C)的分離純化過程與Sak(K74C)相同，蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，Sak(D82C)上樣量為10 μ g時(shí)呈現(xiàn)單帶，未見雜質(zhì)蛋白條帶；RP-HPLC分析結(jié)果顯示其純度達(dá)到97. 5% ；純化過程中Sak(D82C)纖溶活性收率達(dá)到49%。4、Sak(D82C)的聚乙二醇修飾Sak (D82C)的聚乙二醇修飾和產(chǎn)物純化過程均與Sak (K74C-SP5)相同，凍干的 Sak(D82C-SP5)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R-250染色，上樣IOyg蛋白為單帶，分子量大約30kD，未見雜質(zhì)蛋白條帶；凍干的蛋白樣品復(fù)溶后稀釋為1.0mg/ml， RP-HPLC分析純度達(dá)到98.0% ；聚乙二醇修飾和純化過程中Sak(D82C_SPO纖溶活性收率達(dá)到86%。5,Sak(D82C-SP5)的纖溶活性測(cè)定Sak(D82C-SP5)的生物活性測(cè)定方法與Sak(K74C_SPO相同，計(jì)算表明，野生型葡激酶的比活性為9. 4X104HU/mg,Sak(D82C-SP5)的比活性為7. 6X 104HU/mg，基本保留了野生型葡激酶纖溶活性。6、Sak(D82C-SP5)誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體的能力Sak (D82C-SP5)免疫Balb/c小鼠過程和所誘導(dǎo)的抗體滴度測(cè)定方法與 Sak(K74C-SP5)相同；結(jié)果如附圖1所示，與野生型Sak誘導(dǎo)的抗體滴度(滴度為80000) 對(duì)比，突變體&ik(D82C-SPO所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體滴度(滴度為M000)顯著下降(ρ < 0. 05)。7、聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(D82C-SPO在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)Sak(D82C-SP5)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、血漿中Sak(D82C_SPO濃度測(cè)定方法和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法均與&ik(K74C-SPO使用的方法相同。研究結(jié)果表明，野生型 Sak的血漿分布半衰期(t1/2a)為3. 2min，血漿清除率為13士0. 3ml/min ；而&ik(D82C-SP5) 的t1/2a為7.6min，血漿半衰期比野生型Sak顯著延長(ρ < 0. 05)，血漿清除率為 6. 3士0. 2ml/min，血漿清除率比野生型Sak顯著降低(ρ < 0. 05)。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于是將野生型葡激酶的71-87氨基酸序列之中的任一親水性氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其替換為半胱氨酸，通過構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒， 得到葡激酶突變體，然后使用甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，得到的聚乙二醇化葡激酶突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SPO是將野生型Sak的K74替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為 5000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E75C-SPO是將野生型Sak的E75替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為 5000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突變體&ik(R77C-SPO是將野生型Sak的R77替換為半胱氨酸(簡寫為C)，突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為5000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(E80C-SPQ和(E80C-SP10)是將野生型Sak的E80替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量分別為5000和10000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體，其特征在于聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(D82C-SPO是將野生型Sak的D82替換為半胱氨酸，突變體中半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子與甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇通過共價(jià)鍵相連，其中聚乙二醇的平均分子量為 5000。
7.—種聚乙二醇化葡激酶突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)以野生型Sak的表達(dá)質(zhì)粒pBV-Sak為模板，使用突變引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直接得到表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗(yàn)證是否發(fā)生預(yù)計(jì)位置的突變；(2)Sak突變體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到各個(gè)突變體的工程菌，通過升高培養(yǎng)溫度誘導(dǎo) Mk (K74C)、Sak (E75C)、Sak (R77C)、Sak (E80C)、Sak (D82C)基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在；(3)發(fā)酵技術(shù)以M9CA培養(yǎng)基培養(yǎng)Sak突變體工程菌，pH= 6. 5-7. 5，溫度37°C時(shí)，培養(yǎng)菌體，在42°C時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；(4)Sak突變體工程菌發(fā)酵后，離心收集菌體，重懸后超聲破碎菌體，離心并收集上清液，用色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序?yàn)殛栯x子交換色譜、凝膠過濾色譜和陰離子交換色譜，得到高純度的葡激酶突變體Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、 Sak (D82C)；(5)所得到的葡激酶突變體Sak (K74C)、Sak (E75C)、Sak (R77C)、Sak (E80C)、Sak (D82C) 與過量的二硫蘇糖醇反應(yīng)后，Sephadex G-50層析柱除去未反應(yīng)的二硫蘇糖醇，然后，葡激酶突變體 Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)與分子量為 5000 或 10000的甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇室溫下反應(yīng)，用色譜法純化產(chǎn)品，色譜方法的順序?yàn)殛栯x子交換色譜、凝膠過濾色譜，得到高純度的聚乙二醇化葡激酶突變體Sak(K74C-SP5)、 Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak (E80C-SP10)、Sak (D82C-SP5)。
8. —種如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突變體的應(yīng)用，其特征在于作為血栓栓塞性疾病的溶栓治療藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚乙二醇化葡激酶突變體，是將野生型葡激酶的71-87位氨基酸序列之中的任一親水性氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將其替換為半胱氨酸，在大腸桿菌高效表達(dá)，色譜層析純化出葡激酶突變體，然后使用甲氧基馬來酰亞胺聚乙二醇對(duì)葡激酶突變體中的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾，得到的聚乙二醇化葡激酶突變體。所制備的聚乙二醇化葡激酶突變體的免疫原性顯著下降，體內(nèi)血漿半衰期顯著延長，藥效更持久，溶解血栓的纖溶活性基本得到保留，可以作為血栓栓塞性疾病的溶栓治療藥物使用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102212512SQ20111010261
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者劉建偉, 王改珍, 賀進(jìn)田 申請(qǐng)人:河北師范大學(xué)