專利名稱：一種產(chǎn)磷脂酶A₂的工程菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體涉及一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌，同時涉及一種含磷脂酶A2基因的質(zhì)粒，還涉及一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌的制備方法，該工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的磷脂酶A2在植物油脂脫膠及溶血磷脂制備等方面的應用。
背景技術(shù)：
磷脂酶A2 (Phospholipase A2, PLA2)，即磷脂 _2_ ?；饷?EC 3. 1. 1. 4)，是磷脂分解代謝中起重要作用的酶。它催化甘油磷脂C-2位酯鍵的水解反應，生成溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶A2最早由Belfanti于1擬4年用生物化學方法從肝臟組織中分離出來。后來，人們從腎臟、前列腺等其他組織中都分離出此酶。武內(nèi)忠男于1952年在光鏡下用組織化學法證明了磷脂酶A2的存在。不同來源的磷脂酶A2分子量差異較大。例如，來源于鏈霉菌、蛇毒、、蜂毒、胰腺等外分泌型的磷脂酶A2的分子量一般在13KD-18kD，其活性依賴Ca2+離子的存在。存在于犬 /人的心肌胞漿內(nèi)的磷脂酶A2分子量為40kD，而存在于鼠腎及人血小板胞漿內(nèi)的磷脂酶A2 的分子量則達到85kD?，F(xiàn)在已有幾十種不同來源的磷脂酶A2的一級結(jié)構(gòu)被闡明，氨基酸順序已測出。例如，豬的磷脂酶A2，酶原的活力很低，通過胰蛋白酶除去氨基端七肽后能轉(zhuǎn)變成活性形式。一些來源比較接近的磷脂酶A2，同源性較高，例如江浙蝮蛇毒中的酸性、中性和堿性磷脂酶A2,其同源性高達50%以上，含有14個Cys殘基，組成七對二硫鍵。這幾種磷脂酶A2雖然都有將磷脂水解成為溶血磷脂的功能，但在溶血活性、神經(jīng)毒素活性、抑制血小板聚集等功能方面卻有很大不同。眼鏡蛇毒的磷脂酶A2已經(jīng)分離純化得到了均一產(chǎn)物，對熱穩(wěn)定，分子量為 11，000D，分子內(nèi)含有一個組氨酸殘基和一個色氨酸殘基，5-6個二硫鍵。豬胰的磷脂酶A2 與蛇毒磷脂酶A2的同源性也很高，含有12個Cys殘基，組成六對二硫鍵。來源不同且一級結(jié)構(gòu)上差異很大的磷脂酶A2,卻都能水解甘油磷脂上C-2位脂肪酸，行使著相同的功能，分析其蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，其相同或相似的結(jié)構(gòu)應該是其行使磷脂酶A2催化功能所必需的。通過對蜜蜂毒腺磷脂酶A2 —級和高級結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒磷脂酶A2不僅在一級結(jié)構(gòu)中半胱氨酸的間距、Ca2+結(jié)合區(qū)域、與催化活性中心有關(guān)的幾個氨基酸的位置上與來源于其他生物的磷脂酶A2相似，這些應該是磷脂酶A2的結(jié)構(gòu)特征。蛇毒磷脂酶A2的研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2的酶活性與質(zhì)子傳遞系統(tǒng)、Ca2+結(jié)合環(huán)及疏水通道等有關(guān)。其中質(zhì)子傳遞系統(tǒng)由His-48、Asp-99、Tyr-52和Tyr-73等氨基酸組成；Ca2+ 結(jié)合環(huán)由25-35位氨基酸組成；疏水通道由高度保守的疏水性殘基Leu-2、Phe-5, Met_8、 Ile-9、Tyr-22、Cys-27、Cys-29、Cys-45、Tyr-52、Ala-102、Ala-103 和 Phe-106 等組成。江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A2 (APLA2)和尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A2(A.aAPLA2II)的這三個因素基本相同(只有個別氨基酸殘基不一致)但酶活性差別較大。有些來源差異大的的磷脂酶A2，盡管分子量接近，但其一級結(jié)構(gòu)的同源性卻很低， 例如鏈霉菌與豬胰磷脂酶A2的同源性小于10%，鏈霉菌磷脂酶A2的一級結(jié)構(gòu)只有4個Cys 殘基，但卻都擁有與蛇毒磷脂酶A2相似的質(zhì)子傳遞系統(tǒng)、Ca2+結(jié)合環(huán)和疏水通道?，F(xiàn)在已有幾十種不同來源的磷脂酶A2的一級結(jié)構(gòu)被闡明，大鼠、豬、牛、馬、羊、以及人的胰臟磷脂酶A2已被提純，豬、馬和牛的磷脂酶A2酶原的氨基酸順序已測出。磷脂酶A2不僅具有重要的生理功能，在代謝過程中能夠消化磷脂分子；在激素信號的傳遞、生物膜的穩(wěn)衡過程、脂質(zhì)介體的產(chǎn)生以及發(fā)炎過程等方面起著重要的作用。磷脂酶A2還具有廣闊的應用前景。1、磷脂酶A2用于生物膜構(gòu)造和機能的研究磷脂酶A2在脂類代謝中起重要作用，它可以水解磷脂產(chǎn)生脂肪酸，進入其他脂肪酸代謝途徑，是許多脂肪酸代謝的一個限速步驟，因此，研究脂類代謝PLA2是重要的工具酶之一。2、磷脂酶A2用于溶血磷脂的制造溶血磷脂(lysophospholipid)是由甘油磷脂經(jīng)蛇毒和胰臟的磷脂酶A(PLA1或 PLA2)的作用，除去了 Cl或C2位脂肪酸的一酰基甘油磷脂質(zhì)。天然僅少量存在。C2位上結(jié)合了脂肪酸的溶血磷脂在堿性中很不穩(wěn)定，脂肪酸容易轉(zhuǎn)移到1位上去。一般稍溶于水， 也溶于乙醇、甲醇、氯仿。溶血磷脂在食品加工中可作為乳化分散劑、乳化劑使用，且具有一定的抗菌作用， 效果優(yōu)于普通磷脂，已被中國、日本等多國批準為天然食品添加劑。溶血磷脂添加在護膚化妝品中，能起到調(diào)節(jié)皮膚呼吸，舒展皮膚皺紋，改善粗糙結(jié)構(gòu)的作用。在醫(yī)學上溶血磷脂具有抗病毒、抗腫瘤的作用。天然的磷脂Cl位結(jié)合的是飽和脂肪酸，C2位結(jié)合的是不飽和脂肪酸，利用磷脂酶 A2制備的溶血磷脂Cl位上是飽和脂肪酸，因而穩(wěn)定性優(yōu)于利用磷脂酶A1制備的溶血磷脂。溶血磷脂溶血磷脂是生物體內(nèi)正常存在的安全物質(zhì)，溶血磷脂于2008年在中國已經(jīng)被批準為天然食品添加劑。3、磷脂酶A2用于植物油脂精煉在植物油脂精煉中，需要將毛油中的磷脂除去(即脫膠)，如果不進行脫膠，油脂在加熱到一定溫度時就會發(fā)黑并產(chǎn)生黑煙，傳統(tǒng)的脫膠工藝是采用堿化學的方法，即在毛油中加入NaOH，把磷脂轉(zhuǎn)化成脂肪酸鈉，在通過離心除去，此法油脂損耗和能耗較大、且產(chǎn)生的廢水和皂角污染環(huán)境。而將磷脂酶A2應用于植物油脂精煉，利用磷脂酶A2將油脂中的磷脂轉(zhuǎn)化成易于溶解在水中的溶血磷脂，再經(jīng)過離心即可除去油脂中的磷脂，達到脫膠的目的，不產(chǎn)生含堿廢水和皂角。酶法脫膠技術(shù)以其良好的經(jīng)濟效益、卓越的環(huán)保優(yōu)勢和簡單的生產(chǎn)工藝已成為油脂精煉工藝的發(fā)展趨勢。除此之外，磷脂酶A2在飼料添加劑和疾病治療方面也具有應用前景。磷脂酶A2的研究在理論上和開發(fā)應用上都很有意義。在早期，磷脂酶A2主要從動物胰臟、蛇毒、蜂毒中提取，但從動物性原料中提取 PLA2，成本高，產(chǎn)量低。例如從動物內(nèi)臟中提取磷脂酶A2,工藝復雜產(chǎn)量低，蛇毒或蜂毒則來源稀少，不利于磷脂酶A2的大量生產(chǎn)和利用，因此價格昂貴。
微生物是磷脂_A2資源的重要來源。天然的真核(如米曲霉、黑曲霉、擔子菌、酵母等)及原核(如鏈霉菌、大腸桿菌和芽孢桿菌等)微生物都能產(chǎn)生磷脂酶A2。但普遍產(chǎn)量很低，達不到工業(yè)應用的要求。來源于微生物的磷脂酶A(A1或A2)相關(guān)的報道和專利較多的是真菌的磷脂酶A， 如從曲霉屬、鏈孢霉屬、木霉屬的真菌中克隆磷脂酶A基因，并加以改造，有些是脂肪酶，在一定條件下具有磷脂酶A的功能，專一性不強。有人從紫紅鏈霉菌A-2683 (Mrptomyces. Violaceoruber A-2683)中克隆了磷脂酶A2的基因，并將此基因轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌TKM中進行表達(公開特許公報。特開平 6-327468,1994)。使磷脂酶A2的產(chǎn)量較出發(fā)菌株有所提高。但他們所構(gòu)建的菌株及構(gòu)建方法上仍存在有不足之處，例如1、菌株的產(chǎn)酶能力仍不夠理想；2、在基因組文庫的構(gòu)建上，選用的載體是質(zhì)粒pUC118，這個質(zhì)粒只能在大腸桿菌中復制，不能在鏈霉菌中復制，構(gòu)建表達菌株時還需將磷脂酶A2基因再克隆到鏈霉菌質(zhì)粒 PIJ680上，操作煩瑣，且質(zhì)粒的穩(wěn)定性不高，因而重組菌株不夠穩(wěn)定；3、在基因的克隆策略上，所用的探針是人工合成的幾組核苷酸片段，長度都小于 30bp，用如此小的核苷酸片段作為探針從基因組文庫中釣取磷脂酶A2基因，特異性不強，所以在雜交篩選時信號較弱。李維琳從紫紅鏈霉菌四17中克隆了磷脂酶A2基因(李維琳，武漢大學學報理科版，第48卷，第4期，2002)，測定了其基因的全序列，并將此序列與其他來源的磷脂酶A2 基因序列進行比較研究發(fā)現(xiàn)，與來源天藍色鏈霉菌的同源性為98%，與來源蛇毒的同源性 < 10%，但有類似的質(zhì)子傳遞系統(tǒng)、Ca++結(jié)合環(huán)以及疏水通道等結(jié)構(gòu)。李維琳還將載體為 PHZ132的含有磷脂酶A2基因的亞克隆質(zhì)粒pHZ2265 (插入片段21Λ)，用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導入宿主變鉛青鏈霉菌13 ，構(gòu)建了重組菌株變鉛青鏈霉菌LEE2^55，得到了較好表達效果。本發(fā)明在此技術(shù)基礎(chǔ)上進行了改進，構(gòu)建了表達量更高的重組質(zhì)粒pLHOOl和工程菌變鉛青鏈霉菌LH 001，使磷脂_A2的產(chǎn)量比重組菌株變鉛青鏈霉菌LEE 2265高5倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌，該工程菌的宿主菌是變鉛青鏈霉菌，導入了多拷貝質(zhì)粒PLH001，穩(wěn)定性好，插入質(zhì)粒的外源片段較大，達31Λ，除含有磷脂酶A2基因和前導信號肽序列外，可能還包含其他增強表達的其他序列，因此該工程菌具有酶表達量大、分泌型、菌株穩(wěn)定性高的優(yōu)點。利用該工程菌發(fā)酵生產(chǎn)磷脂酶A2，發(fā)酵液中的磷脂酶A2的活力>2，000U/mL，遠遠高于出發(fā)菌和宿主菌，也高于以前的報道。本發(fā)明提供了該磷脂酶A2性質(zhì)。最適反應溫度為50°C ；在37°C以下穩(wěn)定性良好，50°C以上時酶活損失較大，70°C酶5小時全部消失；最適pH為8. 0 ；在pH5 9范圍內(nèi)較穩(wěn)定；在Ca2+濃度為0. 5mmol/L時酶活力最高。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種重組質(zhì)粒PLH001，是在載體質(zhì)粒pHZ132 的Bam Hl酶切位點導入一段31Λ的來源于紫紅鏈霉菌的DNA片段。該31Λ的插入片段可以從野生的紫紅鏈霉菌四17或其他菌株中得到，包含有磷脂酶A2 (EC 3. 1. 1. 4)基因和其
5前導信號肽序列。該重組質(zhì)粒在宿主細胞中可以多拷貝復制。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在植物油脂(大豆油、菜籽油、米糠油等)脫膠中的應用。利用工程菌發(fā)酵產(chǎn)生的磷脂酶^將毛油中的非水合磷脂水解掉一個脂肪酸，生成溶血磷脂，溶血磷脂具有良好的親水性，可以方便地利用水化的方法除去，使油脂中的磷含量彡10ppm(相當于磷脂含量低于0^6%。)。與現(xiàn)有的化學法相比，具有環(huán)保、節(jié)能、出油率高的優(yōu)點。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在制備溶血磷脂中的應用。采用磷脂酶A2可將天然磷脂的C2位脂肪酸除去，生成溶血磷脂。與天然磷脂相比，溶血磷脂具有以下優(yōu)點(1)增強水包油型乳化性( 提高了乳化穩(wěn)定性C3)對溫度的適應性更強(4)改善了與蛋白質(zhì)和淀粉結(jié)合的能力( 具有極好的脫?；蛎摫P特性(6)添加量小等特點。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌的制備方法，其步驟是A、磷脂酶A2基因的制備PCR引物的設計及磷脂酶A2基因片段的擴增登陸http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/GenBank，根據(jù)已知的磷脂酶A2的DNA序列的特點，從中找出鏈霉菌磷脂酶A2的基因， 并據(jù)此設計了兩個長度為21個堿基對的PCR引物Oligol (SEQ ID NO. 03)和01igo2 (SEQ ID NO. 04)。用Oligo 1和Oligo 2為引物，以紫紅鏈霉菌四17(李維琳，武漢大學學報(理科版)，第48卷，第4期，2002)的總DNA為模板，用PCR的方法擴增出磷脂酶A2的基因片段， 其片段大小約為450bp，與磷脂酶^基因大小相當，命名為plaT，PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見附圖1。以PCR擴增出的片段plaT為探針用酶切和Southern雜交的方法從紫紅鏈霉菌 2917的總DNA的酶切產(chǎn)物中釣取含磷脂酶A2基因的DNA片段。將含有磷脂酶A2基因的DNA片段克隆質(zhì)粒pBluescript II SK(+)上用于測序。 經(jīng)測序，磷脂酶A2基因序列見SEQ ID NO. 2，據(jù)此磷脂酶A2基因的開放閱讀框架(ORF)的 DNA序列推導出的氨基酸序列見SEQ ID N0. 1。在核苷酸序列中1 87為編碼前導信號肽的序列，G+C的百分含量為82. 76% ； 88 450為磷脂酶A2的基因序列，G+C的百分含量為66. 94% ；451 453為終止密碼子。 總 G+C%^ 69. 76%。在氨基酸序列中-1 - 是前導信號肽是氨基酸序列；前導信號肽序列和編碼前導信號肽，可使細胞內(nèi)產(chǎn)生的有活性的磷脂酶分泌到細胞外，方便酶蛋白的分離和利用。1 121是磷脂酶A2氨基酸序列。此酶的分子量為13，421. 74道爾頓，等電點為 6. 78。與已知的磷脂酶A2氨基酸序列比對，其氨基酸結(jié)構(gòu)中具有的質(zhì)子傳遞系統(tǒng)、Ca2+結(jié)合環(huán)及疏水通道等符合磷脂酶A2的特征。此酶磷脂酶A2的活性功能，能有效地將磷脂C2位的脂肪酸切除，使之成為溶血磷脂，可應用于油脂精煉和溶血磷脂制備等方面。B、重組質(zhì)粒的構(gòu)建將含有磷脂酶A2基因大小約為31Λ Bam Hl酶切片段克隆到高拷貝質(zhì)粒pHZ132 上，得到重組質(zhì)粒PLHOOl，一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌，在變鉛青鏈霉菌中含有一種重組質(zhì)粒pLHOOl。見附圖3。質(zhì)粒pLHOOl為環(huán)狀雙鏈DNA，131Λ，包含有一段31Λ的來源于紫紅鏈霉菌的DNA片段，可以表達產(chǎn)生有活性的磷脂酶A2，還含有氨芐青霉素、硫鏈絲菌素和紫霉素抗性基因，便于重組質(zhì)粒和工程菌的篩選。該質(zhì)粒具有表達能力強，穩(wěn)定性高，傳代培養(yǎng)質(zhì)粒不易丟失等特點。C、工程菌的構(gòu)建用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pLHOOl導入宿主菌株野生型變鉛青鏈霉菌 1326 (S. Iividans 13 )，得到重組菌株。該菌株已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年3月25日，保藏編號CCTCCN0 M2011096，分類命名重組基因工程菌株變鉛青鏈霉菌LH001 (Str印tomyce，livdans LH 001)。該工程菌具有典型的鏈霉菌特征。菌絲呈分枝狀，無橫隔，革蘭氏陽性，固體培養(yǎng)時菌絲相互交錯纏繞形成質(zhì)地致密的小菌落，成熟菌落呈灰白色，直徑2-5毫米、干燥、不透明、 難以挑取。可用高氏1號培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，可大量產(chǎn)生具有磷脂酶A2 活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO 01，分子量為13，421. 74道爾頓，等電點為6. 78。具有磷脂酶A2活力。一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在除去植物油脂(大豆油、菜籽油、米糠油)中磷脂中的應用，其步驟是取植物油毛油100g(磷含量150-300ppm，相當于磷脂含量4 8%。)，預熱至80°C， 加入2. 5mol/L檸檬酸0. 125ml，均質(zhì)lmin，于該溫度維持30min。冷卻至40 45°C，加入 4mol/L NaOH溶液和2 3%的蒸餾水混合均勻，再加入50 150 μ L的工程菌變鉛青鏈霉菌LH 001發(fā)酵液(即磷脂酶A2酶液)，40 45°C反應2 3小時。取樣，測定含磷含量。 采用這種方法可將植物油中的磷含量降到10ppm(相當于磷脂含量低于0. 26%0)以下，滿足物理精煉的要求。一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在將磷脂酶解成溶血磷脂中的應用，其步驟是用磷脂酶A2酶液在配制濃度為1 10% (w/v)的磷脂，加入2 lOmmol/L CaCl2, 置恒溫搖床中，在30 45°C，200r/min條件下反應，每隔2小時用標定的NaOH滴定游離脂肪酸的生成量，以每克磷脂平均可釋放1200 μ moL脂肪酸計，將滴定脂肪酸的量換算為磷脂酶解轉(zhuǎn)化率。當酶解反應趨于平緩時，結(jié)束反應。本發(fā)明構(gòu)建的工程菌具有以下優(yōu)點a.可以產(chǎn)生分泌型有活力的磷脂酶A2，無需破細胞處理，無需激活，有利于分離純化；b.工程菌穩(wěn)定性好，導入的質(zhì)粒不易丟失。c.發(fā)酵液中酶活力彡2，000U/mL,產(chǎn)酶量優(yōu)于現(xiàn)有水平d.發(fā)酵液無需純化和濃縮處理即可直接應用于油脂脫膠或溶血磷脂的制備。


圖1為一種磷脂酶A2基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。A泳道為紫紅鏈霉菌四17總DNA，B泳道為Ikb ladder, C和D泳道為磷脂酶A2基因的PCR擴增產(chǎn)物。圖2為一種大腸桿菌-鏈霉菌雙功能柯斯質(zhì)粒PHZ 132限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖3為一種質(zhì)粒pLH 001構(gòu)建過程示意圖。圖4為一種測序用載體pBluescript II SK(+)的圖譜及多克隆位點示意5為一種磷脂酶A2的溫度-活力曲線示意6為一種磷脂酶A2的熱穩(wěn)定性曲線示意7為一種磷脂酶A2的pH-活力曲線示意8為一種磷脂酶A2的pH穩(wěn)定性曲線示意9為一種磷脂酶A2的Ca++-活力曲線示意圖
具體實施例方式通過結(jié)合附圖及具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解的是，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。所有實施例中的培養(yǎng)基和操作方法為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，可參考Sambrook等“分子克隆“(實驗室手冊，冷泉港，1989)及“精編分子生物學實驗指南”(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學出版社，1998)、“鏈霉菌遺傳操作實驗手冊”(霍普伍德等著，長沙，湖南科學技術(shù)出版社，1988)。實施例1 —種含有磷脂酶A2基因和前導信號肽質(zhì)粒的制備方法，其步驟是A、用于擴增磷脂酶A2基因的引物的合成登陸http://www. ncbi. nlm. nih. gov/GenBank，根據(jù)天藍色鏈霉菌 A3 ( 磷脂酶 A2的DNA序列的特點，從中找出鏈霉菌磷脂酶A2的基因，并據(jù)此設計了兩個長度為21個堿基對的PCR引物Oligol (SEQ ID NO. 03)和01igo2(SEQ ID NO. 04)，設計的引物交由生物技術(shù)公司進行合成，其序列和特性詳見下表。表2引物Dll和D12的特性
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌，其特征在于變鉛青鏈霉菌LH 001 istreptomyce ， livdans LH 001)，CCTCC No :M2011096。
2.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌，其特征在于所述的變鉛青鏈霉菌含有一種重組質(zhì)粒PLH001。
3.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在大豆油脂脫膠中的應用。
4.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在菜籽油脂脫膠中的應用。
5.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在米糠油脂脫膠中的應用。
6.權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌在制備溶血磷脂中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)磷脂酶A2的工程菌及其應用，其步驟A、磷脂酶A2基因的制備PCR引物的設計及磷脂酶A2基因片段的擴增；以擴增出的片段plaT為探針克隆含磷脂酶A2基因(序列為SEQIDNO.2)的DNA片段。B、重組質(zhì)粒的構(gòu)建將含有磷脂酶A2基因大小為3kb的BamH1酶切片段克隆到高拷貝質(zhì)粒pHZ132上，得到重組質(zhì)粒pLH001； C、工程菌的構(gòu)建用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pLH001導入宿主菌變鉛青鏈霉菌1326，得到工程菌變鉛青鏈霉菌LH001。該工程菌穩(wěn)定性好，導入的質(zhì)粒不易丟失。液體發(fā)酵能產(chǎn)生分泌型有活力的磷脂酶A2(氨基酸序列為SEQIDNO.1)，發(fā)酵液中酶活力≥2,000U/mL，產(chǎn)酶能力優(yōu)于現(xiàn)有水平?？蓱糜谥参镉椭撃z、溶血磷脂制備等領(lǐng)域。
文檔編號C12P9/00GK102226165SQ201110101940
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者李維琳 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學