專利名稱：檢測煙草的煙氣對肺的損傷的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測煙草的煙氣對肺的損傷的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際上對煙草制品及煙用添加劑的安全性評價開展了大量研究工作。自20世紀90年代起，雷諾士(RJR)公司就以“Eclipse”卷煙為評價載體，一直進行煙草制品的安全性評價研究。其評估主要分為4個方面①有害煙氣成分分析，包括焦油、煙堿、粒相物和氣相物分析；②毒理學(xué)試驗，包括遺傳和細胞的體外毒理試驗、嚙齒動物呼吸系統(tǒng)(鼻、喉、肺)病理解剖、小鼠皮膚涂布致瘤試驗以及DNA加合物分析；③吸煙試驗，測定受試者的呼吸曲線、血清中的煙堿和羥基血色素、尿液變化，觀察肺部炎癥；④獨立科學(xué)評價，由專家組對所掌握的全部的有關(guān)“Eclipse”的數(shù)據(jù)進行評價。英美煙草(BAT)公司的評價方法為卷煙煙氣中“霍夫曼分析物”分析、煙氣的體外短期毒性試驗細菌基因突變——Ames測試、染色體畸形、微核測試和中性紅細胞毒性測試ο菲利普·莫里斯(PM)公司的評價方法為煙氣有害成分分析、體外細胞毒性及基因毒性試驗、90d亞慢性毒性試驗、臨床試驗和環(huán)境煙草煙氣釋放量分析等。1999年FDA (美國食品藥品管理局)要求IOM(美國科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所)制定一套科學(xué)的方法，用于評估長期使用藥物產(chǎn)品或者煙草替代產(chǎn)品(用于降低而不是消除煙草危害)的安全性和效果。國際煙草科學(xué)研究合作中心(C0RESTA)也成立了相關(guān)的工作組(煙草煙氣體外毒性測試工作組)，其主要任務(wù)是根據(jù)國際認可的體外毒性測試準則并加以修改，以適應(yīng)煙草煙氣的性質(zhì)和獨特特性，確定主要的方法。2002年，經(jīng)過大量的文獻調(diào)研和近三年的協(xié)作實驗，工作組確定了三項實驗評價卷煙產(chǎn)品的相對毒性——細菌誘變實驗(推薦鼠傷寒沙門氏菌突變實驗即Ames實驗)、細胞遺傳學(xué)/突變的哺乳動物細胞分析(工作組推薦微核分析或小鼠淋巴瘤L5178Y細胞分析或染色體畸變分析、用合適的哺乳動物細胞系進行的細胞毒性分析(工作組推薦中性紅細胞毒性分析)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測煙草的煙氣對肺的損傷的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的方法，是通過檢測待測煙草的煙氣凝集物對離體的肺巨噬細胞的作用確定待測煙草的煙氣對肺的損傷；所述作用體現(xiàn)為激活細胞的吞噬功能或抑制細胞生長。當(dāng)煙氣中有害物質(zhì)的含量較低時，會激活所述細胞的吞噬功能。當(dāng)煙氣中有害物質(zhì)的含量較高時，會抑制所述細胞生長。所述作用體現(xiàn)為激活細胞的吞噬功能時，所述檢測待測煙草的煙氣凝集物對離體的肺巨噬細胞的作用包括如下步驟比較所述煙氣凝集物處理前后的所述離體的肺巨噬細胞對細菌的吞噬能力，確定所述煙氣凝集物是否激活所述離體的肺巨噬細胞的吞噬功能。
所述細菌上可具有熒光素標(biāo)記。所述熒光素優(yōu)選為異硫氰酸熒光素(FITC)。所述方法中可采用流式細胞儀檢測所述離體的肺巨噬細胞對所述細菌的吞噬能力。所述吞噬能力優(yōu)選通過細胞內(nèi)的平均熒光強度和/或異硫氰酸熒光素陽性細胞所占的比例體現(xiàn)。當(dāng)煙氣中有害物質(zhì)的含量較低時，會激活所述細胞的吞噬功能，細胞內(nèi)的平均熒光強度增強。當(dāng)煙氣中有害物質(zhì)的含量較高時，會抑制所述細胞生長，細胞內(nèi)的平均熒光強度反而降低。所述細菌可為大腸桿菌，如購自美國invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為E-2861德 FITC標(biāo)記的大腸桿菌。所述離體的肺巨噬細胞可為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。離體的肺巨噬細胞在制備檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述離體的肺巨噬細胞可為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。所述煙氣凝集物具體可通過如下方法制備將卷煙、裝有乙酸乙酯的氣體采樣管 (大包氏管)、裝有F12K培養(yǎng)基的氣體采樣管(大包氏管)和吸煙機依次串聯(lián)后用所述吸煙機進行抽吸，然后將所述乙酸乙酯和所述F12K培養(yǎng)基混合，最后揮發(fā)所述乙酸乙酯，得到煙氣凝集物。本發(fā)明還保護一種檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的試劑盒，包括離體的肺巨噬細胞和能被所述離體的肺巨噬細胞吞噬的細菌。所述細菌可為大腸桿菌，如購自美國invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為E-2861德 FITC標(biāo)記的大腸桿菌。所述離體的肺巨噬細胞可為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。以上任一所述的方法，或任一所述的試劑盒可用于評價煙草的安全性。人吸煙后，卷煙煙氣最直接的作用部位是肺，尤其肺的固有(天然)免疫系統(tǒng)首當(dāng)其沖。肺巨噬細胞是肺部免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，在非特異性免疫防御及特異性免疫應(yīng)答中均起十分關(guān)鍵的作用。肺巨噬細胞也是沉積于肺中的煙氣積聚物的主要清除細胞，顯微鏡下觀察呼吸性細支氣管腔內(nèi)聚集了大量吞噬了煙塵顆粒的肺泡巨噬細胞。因而評價卷煙煙氣影響肺巨噬細胞吞噬功能，對全面評價卷煙煙氣的安全性及煙草生產(chǎn)的減害研究具有重要意義。


圖1為未經(jīng)CSC處理的NR8383細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。圖2為CSC處理后的NR8383細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
大鼠肺泡巨噬細胞株NR8383細胞(NR8383細胞)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，產(chǎn)品目錄號為GNR9。FITC標(biāo)記的大腸桿菌(E.coli)購自美國 invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為E-2861。磷酸鹽緩沖液(PBS,ρΗ7· 4)稱取 63. 03g Na2HPO4 · 12Η20，3· 74g NaH2PO4 · 2H20， 溶于1000ml去離子水，調(diào)pH至7. 4，高壓滅菌或過濾除菌。LB培養(yǎng)基稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g及NaC15g，溶于800ml去離子水中， 調(diào)節(jié)PH為7. 4，定容至1000ml，高壓滅菌。LB瓊脂平板量取未滅菌的LB培養(yǎng)基100ml，加入1. 5g瓊脂，高壓滅菌，待溫度降低至80°C左右，無菌條件下倒入消毒的90mm玻璃皿中，每皿約25ml，待凝固后37°C過夜，以除去水分及檢查有無污染。0. 2mol/L Na2CO3 溶液稱取 21. 198g Na2CO3,溶于 IOOOml 去離子水中。0. 2mol/L NaHCO3 溶液稱取 16. 80g NaHCO3，溶于 IOOOml 去離子水中。0. 2mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9. 5)量取 13. Oml 的 0. 2mol/L Na2CO3 溶液與 37. Oml 的0. 2mol/L NaHCO3溶液，混勻后過濾除菌。臺盼藍溶液4g臺朌藍加雙蒸水100ml，研磨溶解，離心后取上清；將上清與 1. 8g/100mL氯化鈉水溶液等體積混合，得到2%臺朌藍溶液，使用前稀釋10倍。滅活胎牛血清將胎牛血清化凍后置于56°C滅活30min，中間每隔5min震蕩1次， 冷卻后4°C保存。F12K培養(yǎng)基購于北京邁晨科技公司，產(chǎn)品目錄號為CM10025。實施例1、一、細胞培養(yǎng)采用含有15% (體積百分含量)滅活胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，在37°C、5%C(V_ 溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)NR8383細胞，得到NR8383細胞的細胞液。二、評價煙草的安全性1、制備煙氣凝集物(CSC)采用10支2R4F參比卷煙(美國肯塔基大學(xué))作為實驗煙，抽吸前置于溫度 (22士 1)°C和濕度(60士2)%的恒溫恒濕箱中平衡72h小時。采用氣體采樣管(大包氏管) 采集煙氣，2個串聯(lián)的氣體采樣管分別裝有5ml乙酸乙酯和5mlF12K培養(yǎng)基，乙酸乙酯端連接卷煙，F(xiàn)12K培養(yǎng)基端連接鄭州煙草研究院研制JJ-100型單通道吸煙機抽吸，提取條件為 lpuff/min(25mL/puff)。10支卷煙抽吸完成后將5ml乙酸乙酯和5mlF12K培養(yǎng)基混合，將乙酸乙酯揮發(fā)，剩余液體用F12K培養(yǎng)基定容至10ml，即為煙氣凝集物(1支煙/ml)。-80°C 保存。2、細胞染毒(用CSC處理NR8383細胞)取NR8383細胞的細胞液(含IO5細胞)，加入Iml煙氣凝集物，在37°C、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。3、吞噬功能檢測收集NR8383細胞(CSC處理后的NR8383細胞或未經(jīng)CSC處理的NR8383細胞)，室溫離心(2500rpm,5mins)取沉淀，磷酸鹽緩沖液(PBS, ρΗ7· 4)洗三次，加入0. 5mL含15% (體積百分含量)滅活胎牛血清的F12k培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)入24孔板中；然后加0. 5mLFITC標(biāo)記的大腸桿菌菌液，于在37°C、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中孵育2h ；收集24孔板的混懸液，室溫離心(2500rpm，5minS)取沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 4)洗兩次；采用流式細胞儀檢測(檢測前Imin加入臺盼藍溶液)，采集FITC熒光，計算FITC陽性細胞所占比例及細胞內(nèi)平均熒光強度，分析細胞的吞噬功能。 未經(jīng)CSC處理的NR8383細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果見圖1。CSC處理后的NR8383 細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果見圖2。CSC處理后的NR8383細胞和未經(jīng)CSC處理的NR8383 細胞FITC陽性細胞所占比例均為100%。CSC處理后的NR8383細胞內(nèi)平均熒光強度為 16. 36 士 2. 06，未經(jīng)CSC處理的NR8383細胞內(nèi)平均熒光強度為10. 02 士 0. 89。CSC處理后的 NR8383細胞與未經(jīng)CSC處理的NR8383細胞相比，熒光強度增加了 50%以上。結(jié)果表明CSC 異常激活NR8383細胞的吞噬功能，對肺臟免疫系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。
權(quán)利要求
1.一種檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的方法，是通過檢測待測煙草的煙氣凝集物對離體的肺巨噬細胞的作用確定待測煙草的煙氣對肺的損傷；所述作用體現(xiàn)為激活細胞的吞噬功能或抑制細胞生長。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述檢測待測煙草的煙氣凝集物對離體的肺巨噬細胞的作用包括如下步驟比較所述煙氣凝集物處理前后的所述離體的肺巨噬細胞對細菌的吞噬能力，確定所述煙氣凝集物是否激活所述離體的肺巨噬細胞的吞噬功能。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述細菌上具有熒光素標(biāo)記；所述方法中， 采用流式細胞儀檢測所述離體的肺巨噬細胞對所述細菌的吞噬能力；所述熒光素優(yōu)選為異硫氰酸熒光素；所述吞噬能力優(yōu)選通過細胞內(nèi)的平均熒光強度和/或異硫氰酸熒光素陽性細胞所占的比例體現(xiàn)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述細菌為大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述離體的肺巨噬細胞為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。
6.離體的肺巨噬細胞在制備檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的試劑盒中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述離體的肺巨噬細胞為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。
8.檢測待測煙草的煙氣對肺的損傷的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括離體的肺巨噬細胞和能被所述離體的肺巨噬細胞吞噬的細菌。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述細菌為大腸桿菌，優(yōu)選為FITC標(biāo)記的大腸桿菌；所述離體的肺巨噬細胞為大鼠肺泡巨噬細胞株，優(yōu)選為NR8383細胞。
10.權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，或權(quán)利要求8至9中任一所述的試劑盒在評價煙草的安全性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測煙草的煙氣對肺的損傷的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法，是通過檢測待測煙草的煙氣凝集物對離體的肺巨噬細胞吞噬功能的損傷得到待測煙草的煙氣對肺的損傷。人吸煙后，卷煙煙氣最直接的作用部位是肺，尤其肺的固有(天然)免疫系統(tǒng)首當(dāng)其沖。肺巨噬細胞是肺部免疫系統(tǒng)的重要細胞成分，在非特異性免疫防御及特異性免疫應(yīng)答中均起十分關(guān)鍵的作用。肺巨噬細胞也是沉積于肺中的煙氣積聚物的主要清除細胞，顯微鏡下觀察呼吸性細支氣管腔內(nèi)聚集了大量吞噬了煙塵顆粒的肺泡巨噬細胞。因而評價卷煙煙氣影響肺巨噬細胞吞噬功能，對全面評價卷煙煙氣的安全性及煙草生產(chǎn)的減害研究具有重要意義。
文檔編號C12Q1/02GK102220405SQ20111010167
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者劉姜瑾, 朱茂祥, 楊陟華, 潘秀頡, 胡旺順, 鐘科軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司