專利名稱：一種檢測miRNA的方法及引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測miRNA的方法及引物及其在腫瘤等重大疾病早期診斷和預(yù)后中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
microRNA (miRNA)是一類長約22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于動物，植物，線蟲等真核生物中。miRNA通過與靶mRNA3’非編碼區(qū)(3’ UTR)的特異性結(jié)合， 降解靶mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯，最終導(dǎo)致靶基因的蛋白質(zhì)合成減少。miRNAs參與了生命活動各個層次的調(diào)節(jié)，包括胚胎發(fā)育，器官形成，細胞增殖，細胞凋亡，細胞應(yīng)激應(yīng)答，干細胞分化，內(nèi)分泌調(diào)控，免疫調(diào)節(jié)和疾病的發(fā)生與發(fā)展。大量的研究結(jié)果表明，惡性腫瘤等重大疾病的發(fā)生和發(fā)展與人體內(nèi)miRNAs的異常表達有密切關(guān)系，這就意味著miRNAs將有巨大的潛力成為新的生物標志物用于癌癥等重大疾病的早期診斷并可作為新的基因藥物作用靶點。顯然，要想把miRNA用于癌癥等疾病的早期診斷，需要一種能夠快速、靈敏、特異地定量檢測miRNAs表達的方法。成熟miRNA由于片段小，沒有poly㈧尾巴，不同miRNA之間序列差異小(有些只有1個核苷酸的差別)，并且在細胞中的表達水平普遍較低，這些都給miRNA的定量檢測工作帶來了困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，科學(xué)家還是研究出了多種miRNA檢測方法，大體可以歸為兩類一類是不需要樣本擴增的探針直接雜交法；另一類是基于PCR擴增的miRNA檢測方法?；谔结橂s交技術(shù)的miRNA檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本RNA進行預(yù)擴增，主要有如下幾種=Northern blot技術(shù)、生物芯片技術(shù)和基于微球的流式細胞術(shù)。這些技術(shù)的基本原理是將探針與RNA樣品進行雜交，然后進行信號檢測。Northern blot技術(shù)作為檢測RNA的經(jīng)典方法，常用來評價其它方法的可靠性；但這種技術(shù)對樣品要求量大，操作相對費時費力，不適合高通量分析。生物芯片技術(shù)能實現(xiàn)miRNA的高通量分析，即在一塊芯片上同時檢測多個miRNA ；但缺點是結(jié)果準確性低，重復(fù)性差，實驗價格昂貴?；谖⑶虻牧魇郊毎g(shù)技術(shù)將探針固定于微球上并置于液相中，更有利于捕獲miRNA序列，因此提高了準確性；但該技術(shù)須使用特殊的流式細胞儀和微球，實驗成本高，同樣不利于推廣。相比探針直接雜交法而言，基于real-time RT-PCR技術(shù)檢測miRNA的表達是當(dāng)前miRNA研究中最為常用的技術(shù)手段之一，幾乎所有依據(jù)高通量芯片技術(shù)篩選出差異表達的miRNA都需要用real-time RT-PCR做進一步的鑒定?；趓eal-time RT-PCR的miRNA 檢測方法，主要包括 poly (A)聚合酶加尾法(Shi R，Chiang V. Biotechnique. 2005,39(4) 519-525)和蓮環(huán)引物(Stem loop)法(Chen C, Ridzon D. Nucleic Acids Res. 2005， 33(20) 1-9)兩種。poly (A)聚合酶加尾法是先用poly (A)聚合酶使miRNA的3’端帶上一段poly(A)尾巴，然后用5’端含有接頭序列的Oligo (dT)引物進行反轉(zhuǎn)錄，使第一鏈cDNA 加上一段接頭，為隨后的PCR擴增提供反向通用引物序列，然后再利用一條miRNA序列特異的正向引物就可實現(xiàn)PCR擴增。該方法的優(yōu)點是簡便、快速，反轉(zhuǎn)錄引物對miRNA具有通用
4性，因此檢測成本較低；但通用反轉(zhuǎn)錄引物的使用降低了檢測的特異性和靈敏性。莖環(huán)引物法使用3，端有6個堿基與miRNA互補配對的引物來進行miRNA的反轉(zhuǎn)錄，同時反轉(zhuǎn)錄引物的5’端含有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能增強miRNA和DNA異質(zhì)雙鏈的親合力，并防止引物與pri-或 pre-miRNA退火，因此一般來講莖環(huán)引物法的特異性比poly(A)聚合酶加尾法要好；但由于該法使用的是序列特異探針，對于高通量的miRNA分析來說過于昂貴。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測miRNA的方法及引物及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種用于定量檢測miRNA的S-Oligo (dT)引物，其中，所述S-Oligo (dT)引物從5， 端開始由PCR通用引物序列、通用探針序列、Oligo (dT)及與目的miRNA分子的3’端核苷酸互補配對的特異性序列4部分組成。所述的用于定量檢測miRNA的S-Olig0 (dT)引物，其中，所述S-Oligo (dT)引物從 5’端開始依次是14 20個堿基的PCR通用引物序列，14 20個堿基的通用探針序列， 8 30個dT及與目的miRNA分子的3’端3 8個核苷酸互補配對的特異性序列。所述的用于定量檢測miRNA的S-Olig0 (dT)引物，其中，所述引物從5’端開始依次是16個堿基的PCR通用引物序列，17個堿基的通用探針序列，11個dT及與目的miRNA 分子的3’端6個核苷酸互補配對的特異性序列。一種使用上述的用于定量檢測miRNA的引物定量檢測特定miRNA的方法，其中，包括以下步驟S100,S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物的設(shè)計根據(jù)目的miRNA的序列信息，設(shè)計S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物；S200、總RNA提取將細胞裂解，提取總RNA，并鑒定RNA純度和完整性、測定RNA的濃度；S300、RNA 加尾用 PolyA polymerase 對總 RNA 進行加尾，得到 RNA-PolyA ；S400、第一鏈 cDNA 的合成以 RNA-PolyA 為模板，用 S-Oligo (dT)引物進行 miRNA 的反轉(zhuǎn)錄；S500、miRNA 的 real-time PCR定量檢測以 miRNA 的第一鏈 cDNA 為模板，用 miRNA 特異上游引物和下游通用引物進行real-time PCR定量檢測，然后對PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。所述的定量檢測miRNA的方法，其中，所述miRNA特異上游引物是不含3，端3 8 個堿基的miRNA特異序列，所述miRNA的下游通用引物來自于S-Oligo (dT)引物的14 20 個堿基的通用引物序列。所述的定量檢測miRNA的方法，其中，步驟S500中進行real-time PCR定量檢測采用的是探針法或STOR熒光染料法；所述探針法所用探針為通用探針，其序列來自于 S-Oligo (dT)引物上的14 20個堿基的通用探針序列。一種使用上述的用于定量檢測miRNA的引物定量檢測不同的miRNA的方法，其中，包括以下步驟S100、S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物的設(shè)計根據(jù)不同的目的miRNA 的序列信息，設(shè)計不同的S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物；S200、總RNA提取將細胞裂解，提取總RNA，并鑒定RNA純度和完整性鑒定和測定 RNA的濃度；S300、RNA 加尾用 PolyA polymerase 對總 RNA 進行加尾，得到 RNA-PolyA ；S400、第一鏈cDNA的合成以RNA-PolyA為模板，將不同的S-Oligo (dT)引物組合起來進行miRNA的反轉(zhuǎn)錄；S500、miRNA的real-time PCR定量檢測以miRNA的第一鏈cDNA為模板，用各個 miRNA特異上游引物和下游通用弓I物進行real-time PCR定量檢測，然后對PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。所述的定量檢測miRNA的方法，其中，所述miRNA特異上游引物是不含3’端3 8個堿基的miRNA特異序列，所述miRNA的下游通用引物來自于S-Oligo (dT)弓丨物的14 20個堿基的通用引物序列。所述的定量檢測miRNA的方法，其中，步驟S500中進行real-time PCR定量檢測采用的是探針法或STOR熒光染料法；所述探針法所用探針為通用探針，其序列來自于 S-Oligo (dT)引物上的14 20個堿基的通用探針序列。上述的定量檢測miRNA的方法的應(yīng)用，其中，將所述的定量檢測miRNA的方法應(yīng)用在腫瘤等重大疾病的早期診斷和預(yù)后中。有益效果本方法的特點是靈敏性和特異性顯著高于傳統(tǒng)方法，可高通量分析，操作簡單、快速，成本低，可廣泛應(yīng)用于腫瘤等重大疾病的早期診斷和預(yù)后。


圖1為本發(fā)明用于miRNA定量檢測的S-Oligo (dT)法示意圖。圖2為本發(fā)明S-Oligo (dT)法對女性宮頸癌Hela細胞hsa_miR-2ImiRNA的擴增曲線圖。圖3為本發(fā)明S-Oligo (dT)法對女性宮頸癌Hela細胞hsa-miR-2ImiRNA的擴增的標準曲線圖。圖4為本發(fā)明實施例中不同real-time RT-PCR法擴增hsa_miR-21的靈敏性比較曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種檢測miRNA的方法及引物及其應(yīng)用，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明所提供的用于檢測miRNA的miRNA反轉(zhuǎn)錄引物——S-Oligo (dT)引物，從 5，端開始由PCR通用引物序列(Universal primer)、通用探針序列(Universal probe)、 Oligo (dT)及與目的miRNA分子的3’端核苷酸互補配對的特異性序列(specific bases) 4 部分組成。
所述用于定量檢測miRNA的S-Oligo (dT)引物，從5，端開始依次是14 20個堿基的PCR通用引物序列，14 20個堿基的通用探針序列，8 30個dT及與目的miRNA分子的3’端3 8個核苷酸互補配對的特異性序列。本發(fā)明還提供miRNA定量檢測的一種新方法——S-Oligo (dT)法。S_01igo(dT) 法運用S-Oligo(dT)引物進行特定miRNA的反轉(zhuǎn)錄，或者將不同S-Oligo (dT)引物組合起來對不同的miRNA樣品同時進行反轉(zhuǎn)錄，然后用各個miRNA的特異上游引物和通用下游引物對相應(yīng)的miRNA進行real-timePCR定量檢測。miRNA特異上游引物是不含3’端3 8 個堿基的miRNA特異序列，miRNA的下游通用引物來自于S-Oligo (dT)弓丨物的14 20個堿基的通用引物序列。PCR產(chǎn)物的檢測既可用熒光染料法也可用探針法。探針法使用通用探針，其序列來自于S-Oligo (dT)引物上14 20個堿基的通用探針序列。本發(fā)明實施例中所提供的S-Oligo(dT)引物，其組成為從引物5’端開始依次是 16個堿基的PCR通用引物序列，17個堿基的通用探針序列，11個dT(Oligo (dT))及與目的 miRNA分子的3’端6個核苷酸互補配對的特異性序列。miRNA特異上游引物是不含3’端 6個堿基的miRNA特異序列，miRNA的下游通用引物來自于S-Oligo (dT)引物的16個堿基的通用引物序列。所使用的通用探針，其序列來自于S-Oligo(dT)引物上17個堿基的通用探針序列。本發(fā)明所提供的miRNA定量檢測方法——S-Oligo (dT)法可以應(yīng)用在腫瘤等重大疾病的早期診斷和預(yù)測。本發(fā)明miRNA定量檢測方法的具體步驟為S100,S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物的設(shè)計根據(jù)目的miRNA的序列信息，設(shè)計S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物；S200、總RNA提取將細胞裂解，提取總RNA，并鑒定RNA純度和完整性、測定RNA的濃度；S300、RNA 加尾用 PolyA polymerase 對總 RNA 進行加尾，得到 RNA-PolyA ；S400、第一鏈 cDNA 的合成以 RNA-PolyA 為模板，用 S-Oligo (dT)引物進行 miRNA 的反轉(zhuǎn)錄；S500、miRNA 的 real-time PCR定量檢測以 miRNA 的第一鏈 cDNA 為模板，用 miRNA 特異上游引物和下游通用引物進行real-time PCR定量檢測，然后對PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。使用本發(fā)明的檢測miRNA的方法，具有以下幾大優(yōu)點1. S-Oligo (dT)法檢測miRNA的特異性顯著提高S-Oligo (dT)引物與靶miRNA互補的堿基數(shù)為17個堿基(6個特異堿基和11個 dT)，在與靶miRNA錨定力度上明顯優(yōu)于poly (A)聚合酶加尾法(只有Oligo (dT))和莖環(huán)引物法(只有6個特異堿基)。同時，只有包含“6個特異堿基-11個dT”序列的miRNA才能與S-Oligo (dT)引物互補配對，因此S-Oligo (dT)法能很好地區(qū)分成熟miRNA與pri-miRNA 禾口 pre-miRNA。2. S-Oligo (dT)法檢測 miRNA 的靈敏性高S-Oligo (dT)法擴增miRNA的最低模板量為Ipg總RNA ；擴增線性范圍寬，能覆蓋 6個數(shù)量級(Ipg-IOOng總RNA)，相關(guān)系數(shù)R值高于0.99。S-Oligo (dT)法與莖環(huán)引物法和poly(A)聚合酶加尾法相比靈敏性能提高6-10倍。3.操作簡單，能進行高通量分析S-Oligo (dT)法在cDNA合成過程中，能同時將不同miRNA的反轉(zhuǎn)錄引物混合后進行多個miRNA的cDNA合成，這樣不僅能有效降低因加樣所導(dǎo)致的誤差，而且有利于高通量分析。4.檢測成本低S-Oligo (dT)法使用通用探針，大大降低了檢測成本，因此更加適合推廣。實施例1女性宮頸癌Hela細胞hsa_miR-2ImiRNA的定量檢測(一 )材料1.材料體外培養(yǎng)的女性宮頸癌Hela細胞。2.試劑RNAiso plus (TaKaRa)，PolyA Polymerase(EPICENTRE)，PrimeScript RTreagent Kit (TaKaRa),SYBR Premix Ex Taq(Peffect Real Time) (TaKaRa),Premix Ex Taq(Perfect Real Time)(TaKaRa)。3.引物和探針
權(quán)利要求
1.一種用于定量檢測miRNA的S-Oligo (dT)引物，其特征在于，所述S-Oligo (dT)引物從5’端開始由PCR通用引物序列、通用探針序列、Oligo (dT)及與目的miRNA分子的3’端核苷酸互補配對的特異性序列4部分組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量檢測miRNA的S-Oligo(dT)引物，其特征在于，所述S-Oligo (dT)引物從5，端開始依次是14 20個堿基的PCR通用引物序列，14 20個堿基的通用探針序列，8 30個dT及與目的miRNA分子的3’端3 8個核苷酸互補配對的特異性序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量檢測miRNA的S-Oligo(dT)引物，其特征在于，所述引物從5’端開始依次是16個堿基的PCR通用引物序列，17個堿基的通用探針序列，11個 dT及與目的miRNA分子的3’端6個核苷酸互補配對的特異性序列。
4.一種使用權(quán)利要求1所述的用于定量檢測miRNA的引物定量檢測特定miRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟S100、S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物的設(shè)計根據(jù)目的miRNA的序列信息，設(shè)計S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物；S200、總RNA提取將細胞裂解，提取總RNA，并鑒定RNA純度和完整性、測定RNA的濃度；S300、RNA 加尾用 PolyA polymerase 對總 RNA 進行加尾，得到 RNA-PolyA ；S400、第一鏈cDNA的合成以RNA-PolyA為模板，用S-Oligo (dT)引物進行miRNA的反轉(zhuǎn)錄；S500、miRNA的real-time PCR定量檢測以miRNA的第一鏈cDNA為模板，用miRNA特異上游引物和下游通用弓I物進行real-time PCR定量檢測，然后對PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量檢測miRNA的方法，其特征在于，所述miRNA特異上游引物是不含3’端3 8個堿基的miRNA特異序列，所述miRNA的下游通用引物來自于 S-Oligo (dT)引物的14 20個堿基的通用引物序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的定量檢測miRNA的方法，其特征在于，步驟S500中進行 real-time PCR定量檢測采用的是探針法或STOR熒光染料法；所述探針法所用探針為通用探針，其序列來自于S-Oligo (dT)引物上的14 20個堿基的通用探針序列。
7.一種使用權(quán)利要求1所述的用于定量檢測miRNA的引物定量檢測不同的miRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟S100,S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物的設(shè)計根據(jù)不同的目的miRNA的序列信息，設(shè)計不同的S-Oligo (dT)引物和miRNA的特異上游引物；S200、總RNA提取將細胞裂解，提取總RNA，并鑒定RNA純度和完整性鑒定和測定RNA 的濃度；S300、RNA 加尾用 PolyA polymerase 對總 RNA 進行加尾，得到 RNA-PolyA ；S400、第一鏈cDNA的合成以RNA-PolyA為模板，將不同的S-Oligo (dT)引物組合起來進行miRNA的反轉(zhuǎn)錄；S500、miRNA的real-time PCR定量檢測以miRNA的第一鏈eDNA為模板，用各個miRNA 特異上游引物和下游通用引物進行real-time PCR定量檢測，然后對PCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量檢測miRNA的方法，其特征在于，所述miRNA特異上游引物是不含3’端3 8個堿基的miRNA特異序列，所述miRNA的下游通用引物來自于 S-Oligo (dT)引物的14 20個堿基的通用引物序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的定量檢測miRNA的方法，其特征在于，步驟S500中進行 real-time PCR定量檢測采用的是探針法或STOR熒光染料法；所述探針法所用探針為通用探針，其序列來自于S-Oligo (dT)引物上的14 20個堿基的通用探針序列。
10.一種權(quán)利要求4或7所述的定量檢測miRNA的方法的應(yīng)用，其特征在于，將所述的定量檢測miRNA的方法應(yīng)用在腫瘤等重大疾病的早期診斷和預(yù)后中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測miRNA的方法及引物及其應(yīng)用，使用由特異堿基和Oligo(dT)組成的反轉(zhuǎn)錄引物對樣品中miRNA進行反轉(zhuǎn)錄，然后用特異上游引物、通用下游引物和通用探針對miRNA進行real-time PCR定量檢測。本發(fā)明的特點是靈敏性和特異性顯著高于傳統(tǒng)方法，可高通量分析，操作簡單、快速，成本低，可廣泛應(yīng)用于腫瘤等重大疾病的早期診斷和預(yù)啟。
文檔編號C12N15/11GK102154505SQ201110101438
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者康康, 茍德明 申請人:康康, 茍德明