專利名稱：一種檢測植物中目標基因的方法及其專用spr生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測植物中目標基因的方法及其專用 SPR生物傳感器。
背景技術(shù)：
表面等離子共振(Surface ρlasmon resonance, SPR)生物傳感器是近年來國際上迅速發(fā)展的光學生物化學檢測技術(shù)。SPR生物傳感器是將探針或配體固定于傳感器芯片的金膜表面形成單分子層，當含有能與之作用的分析物的液體流經(jīng)傳感片表面時，分子間發(fā)生特異性結(jié)合并可引起傳感片表面折射率的改變，通過檢測SI^R信號改變而監(jiān)測分子間的相互作用。SI^R生物傳感器具有無需標記、靈敏準確、快速、能夠?qū)崿F(xiàn)在線連續(xù)以及高通量等檢測特點，特別適合于生物分子之間相互作用，通過傳感器芯片實時監(jiān)測各類生物分子如多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、寡聚糖和小分子信號物質(zhì)之間相互作用的整個過程，并通過分析軟件可以測定溶液中與固定相作用的物質(zhì)的量。
隨著轉(zhuǎn)基因植物以及產(chǎn)品的安全性問題日益受到關(guān)注，建立準確、可靠、便捷的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和檢測平臺對轉(zhuǎn)基因植物商品化的檢測非常重要。目前在核酸水平上鑒定轉(zhuǎn)基因植物的方法中，應用最廣泛的是PCR方法以及基于PCR的一系列改進技術(shù)，如提高定量PCR的測量限度和定性PCR的檢測限度。PCR檢測具有快速、簡便、靈敏度高等特點， 已經(jīng)廣泛應用在檢測各種轉(zhuǎn)基因作物及其加工產(chǎn)品方面(Forte V Τ, DiPinto A, Martino C, et al. A general multiplex—PCR assay for the general detectionof genetically modified sya and maize. Food Control,2005,16:535-539 ；BerdalK. G, Hoist-Jensen A. , Rouddup Ready soybean event-specific real—timequantitative PCR assay and estimation of the practical detection andquantification limits in GMO analyses. Eur Food Res Technol，2001，213 :432-438 ；朱文斯，朱水芳，黃茜華，等，實時熒光PCR技術(shù)在快速檢測植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成份中的應用.中國醫(yī)藥導刊，2003,5(1) :31.)。 但PCR方法也存在相應的缺點，首先，PCR產(chǎn)物中若出現(xiàn)非特異性帶，不能確定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分；其次，不能確定PCR產(chǎn)物中的特異性帶是否為目的條帶，目前僅能通過測序來確定，成本高且費時，而Sra基于PCR的優(yōu)點，彌補其不足，具有快速，高通量地檢測PCR 產(chǎn)物中是否含有轉(zhuǎn)基因成分的優(yōu)點。
Bt基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應用最廣泛，最具潛力和應用前景的抗蟲基因。目前國內(nèi)外利用修飾、改造、部分合成及全合成Cry基因轉(zhuǎn)化植物，已成功地將 Bt殺蟲基因?qū)氩@得表達的有煙草、棉花、玉米、水稻、甘蔗、小麥、大豆、馬鈴薯、番茄、甘藍、楊樹和落葉松等60多種植物，其中CrylAc是轉(zhuǎn)基因植物中常用的殺蟲蛋白基因，因此將其作為研究對象對其進行特異性檢測。
例Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在我國的栽植面積逐年增加，有數(shù)據(jù)顯示，河北省今年栽植的棉花中90%為抗蟲棉品種，然而抗蟲棉可能會像其他的轉(zhuǎn)基因作物一樣帶來一些問題， 諸如昆蟲抗蟲性增強，天敵數(shù)量減少，基因漂流，生物多樣性被破壞等等，實現(xiàn)對Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的長期監(jiān)測是目前研究的趨勢。
據(jù)粗略統(tǒng)計，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 60群Bt殺蟲晶體蛋白基因，根據(jù)它們殺蟲范圍和基因序列的同源性不同可粗分為六大類(Cry I、Cry II、Cry III、Cry IV、Cry V、Cyt)每一類中又可分為許多亞類，目前轉(zhuǎn)入棉花的有CrylAc、CryIAb、CryIAc和CryIAb融合基因等幾種對鱗翅目害蟲有較強的抗性的Bt殺蟲晶體蛋白基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種輔助檢測或檢測待測生物中目標基因的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟 1)提取待測生物的基因組DNA作為模板，以如下所述試劑中的所述引物對作為引物，進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物； 2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物變性為單鏈DNA分子； 3)將步驟2)得到的單鏈DNA分子流經(jīng)如下所述的Sra生物傳感器的傳感芯片，若檢測的RU值發(fā)生改變，則所述待測植物中候選含有或含有目標基因，若檢測的RU值未發(fā)生變化，則所述待測植物中候選不含有或不含有目標基因。
所述生物為植物；所述目標基因為抗蟲蛋白的編碼基因。
所述植物為轉(zhuǎn)入所述目標基因的植物； 所述抗蟲蛋白的編碼基因為CrylAc ； 所述CrylAc的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
在所述步驟1)后和所述步驟2、前，還依次包括純化所述PCR產(chǎn)物和緩沖處理所述PCR產(chǎn)物的步驟； 所述緩沖處理PCR產(chǎn)物包括如下步驟將所述純化得到的純化后PCR產(chǎn)物與PH值為7. 4的PBM緩沖液混勻，得到緩沖處理后PCR產(chǎn)物； 步驟2)中，所述變性采用的溫度為100°C，所述變性采用的時間為5min ； 步驟幻中，所述流經(jīng)的速度為5 μ Ι/min，所述流經(jīng)的溫度為25°C，所述流經(jīng)的時間為4min。
PBM緩沖液按照如下配方制備137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4, 15mM MgCl2，其 PH 為 7.4。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于輔助檢測待測生物中目標基因的試劑。
本發(fā)明提供的試劑，由探針和用于擴增所述探針的引物對組成， 所述探針為滿足如下1)和2)條件的單鏈DNA分子 1)不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體； 2)與所述目標基因的核苷酸序列的同一性大于90%。
所述探針的大小為25nt ； 所述探針的5'端標記生物素； 所述探針的核苷酸序列為序列表中序列1 ； 所述用于擴增所述探針的引物對中的一條引物為序列表中的序列2，另一條引物為序列表中的序列3。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于輔助檢測待測生物中目標基因的sra生物傳感器。
本發(fā)明提供的sra生物傳感器，為將所述試劑中的所述探針以共價結(jié)合的方式偶聯(lián)到傳感芯片上，得到sra生物傳感器； 所述傳感芯片為SA芯片； 所述目標基因為Cry IAc基因； 所述偶聯(lián)包括如下步驟將所述單鏈DNA分子的溶液流經(jīng)活化后的SA芯片，使其與SA芯片表面結(jié)合，得到sra生物傳感器 所述傳感芯片為SA芯片； 所述目標基因為Cry IAc基因； 所述偶聯(lián)包括如下步驟將含有所述探針的溶液流經(jīng)活化后的SA芯片，使其與SA 芯片表面結(jié)合，得到sra生物傳感器 所述含有所述探針的溶液為將所述探針和PH為7. 4的PBM緩沖液混合，得到的溶液，所述探針在所述含有所述探針的溶液中的濃度為ι μ M ； 所述流經(jīng)的流速為10 μ 1/min ； 所述流經(jīng)的時間為128s ； 所述生物為植物，所述植物具體為棉花。
上述sra生物傳感器在輔助檢測生物中目標基因中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
所述生物為植物；所述目標基因為抗蟲蛋白的編碼基因； 所述植物為轉(zhuǎn)入所述目標基因的植物； 所述抗蟲蛋白的編碼基因為CrylAc ； 所述CrylAc的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明構(gòu)建了包被探針的sra生物傳感器，可以通過其來檢測轉(zhuǎn)基因棉花中是否含有CrylAc基因，其具有高靈敏度、高通量、自動化的優(yōu)點，而且操作簡單。


圖1為野生型棉花DP5415和轉(zhuǎn)基因棉花NuCotn33B的生長 圖2為野生型棉花DP5415和轉(zhuǎn)基因棉花Nucotn33B的PCR擴增 圖3為SPR生物傳感器的制備的檢測圖 圖4為單鏈DNA互補序列樣品Com-Btl的SI3R檢測 圖5為非互補序列樣品Non-Btl的SI3R檢測 圖6為PCR產(chǎn)物SPR檢測流程圖 圖7為Nucotn33B棉花PCR產(chǎn)物SPR檢測 圖8為SI3R檢測經(jīng)PBM緩沖液調(diào)節(jié)PCR產(chǎn)物的結(jié)果圖 圖9為SI3R檢測未經(jīng)PBM緩沖液調(diào)節(jié)PCR產(chǎn)物的結(jié)果圖 圖10為SI3R檢測經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物的結(jié)果圖 圖11為轉(zhuǎn)基因棉花Nucotn33B的PCR產(chǎn)物的SI3R檢測 圖12為野生型棉花DP5415的PCR產(chǎn)物的SI3R檢測 圖13為對照PCR產(chǎn)物的SPR檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、SI3R生物傳感器的制備及驗證 Bt蛋白的編碼基因CrylAc的SI3R檢測的原理使用基于表面等離子共振(SPR) 原理設計的BIACore3000 (GE公司)來檢測樣品中是否含有CrylAc基因，選用的芯片為SA 芯片，其特點是在羧基化的葡聚糖表面覆蓋了一層鏈霉親合素(str印tavidin)，非常適合用于捕獲生物素標記的DNA片段，因此設計探針時，可在其5'端標記上生物素。由于鏈霉親合素和生物素之間結(jié)合的高親合力，當探針流進芯片表面時將結(jié)合到芯片表面作為配體 (ligand)，樣品以恒定的流速和濃度流過芯片表面，如果樣品中的待分析物(analyte)和偶聯(lián)在芯片上的配體發(fā)生堿基互補配對，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量將發(fā)生改變，儀器記錄下對應的響應值(RU)的改變；如果樣品中的待分析物沒有與配體發(fā)生結(jié)合，儀器將不會有響應值的改變。
一、sra生物傳感器的制備 1、探針的選擇 在探針的選擇上主要參考兩個標準1)、探針本身要求不能存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體，錯配盡可能少；2)、探針的特異性與CrylAc基因的同一性高(不低于90%)，與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。根據(jù)這兩個標準，合成了一個探針(上海英駿生物技術(shù)有限公司)，探針的5'端用生物素進行了標記(表1)。
根據(jù)CrylAc基因序列，在探針兩端分別設計了正反引物(表2)， 表1為生物素標記的探針 探針名稱探針序列 Biot-Btl5' Biotin-TAAACAGCGGATGGCAAGTTAGAAG 3' 表2為生物素標記的探針兩端的引物 探針名稱引物名稱引物序列 BtFffl5' CTCTCTATGGAACTATGGGAAACGC 3'(序列 2) Biot-Btl BtRVl5' ATTGTTGTTCTGTGGTGGGATTTCG 3'(序列 3) 從孟山都公司購買野生型棉花DPM15種子和轉(zhuǎn)基因棉花Nuc0tn33B(其為轉(zhuǎn)入 CrylAc基因)種子，溫水(30°C左右)浸種他，在25°C下保溫催芽12h，當種子露出白芽到芽長達種子長的1/2時播入土中，在溫室中25°C條件下培養(yǎng)一個月，得到野生型棉花DPM15 和轉(zhuǎn)基因棉花Nucotn33B (見圖1)。
以野生型棉花DPM15和轉(zhuǎn)基因棉花NuCotn33B的基因組為模板，以BtFWl和 BtRVl 為引物，進行 PCR 擴增，PCR 程序為94°C for 3min,94°C for 30s, 54°C for 30s, 72°C for 45s, 35 cycles ；72°C for 5min ； 10 °C for ever，結(jié)果如圖 2 所示，轉(zhuǎn)基因棉花 Nucotn33B(Bt棉花基因組)得到251bp的片段，野生型棉花(WT棉花基因組)未擴增出目的片段，經(jīng)過測序，該251bp的片段中含有與探針Biot-Btl相同或互補的核苷酸序列。
2、sra生物傳感器的制備 用50mM NaOH (含IM NaCl)的溶液以10 μ 1/min的流速沖洗SA芯片(GE公司， BR-1000-32)三次，每次 lmin。用 PBM 緩沖液(137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,15mM MgCl2, PH = 7. 4)稀釋探針 Biot-Btl 至 1 μ M(取 2 μ 1 無菌水稀釋的 100 μ M 的探針溶液加入198 μ 1 PBM緩沖液)，以10 μ 1/min的流速流經(jīng)SA芯片，分兩次流入，與芯片表面的鏈霉親和素結(jié)合，探針注入時間U8s，得到sra生物傳感器。結(jié)果如圖3所示，總結(jié)合量為1990RU(結(jié)合前是1163RU，結(jié)合后是3153RU)(圖3雙向箭頭所對應的縱坐標)。
二、sra生物傳感器的特異性驗證 1、單鏈DNA的合成 使用BIACore3000檢測DNA問的互作，需要進行試驗條件的摸索，比如探針是否可用，樣品流速，緩沖液的選擇，解離條件的摸索等等。為了建立基因sra檢測系統(tǒng)，合成了探針 Biot-Btl 的互補序列 Com-Btl :5' CTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTA 3'和非互補序列 Non-Btl 5' GTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCA3 ‘。試驗首先選用單鏈 DNA 摸索了檢測條件， 此后用PCR產(chǎn)物進行了相關(guān)的試驗。
2、單鏈DNA的SPR檢測 用PBM緩沖液稀釋上述合成的探針Biot-Btl的互補序列樣品Com-Btl和非互補序列樣品Non-Btl至IOnM (取0. 2 μ 1無菌水稀釋的10 μ M的樣品溶液加入199. 8 μ 1 PBM 緩沖液)，得到兩種樣品，在25°C的條件下以5 μ 1/min的流速流經(jīng)上述獲得的SI5R生物傳感器的芯片表面，總上樣量為25 μ 1 (時間為5min)，然后用PBM緩沖液解離aiiin。
互補序列樣品Com-Btl的結(jié)果如圖4所示，構(gòu)建的SPR生物傳感器檢測出互補序列樣品Com-Btl與探針發(fā)生了相互作用，由進樣前的2766RU(進緩沖液)，增大到 3084RU(用PBM解離^iiin后的值)，響應值增大了 318RU，且它們的結(jié)合很牢固，進樣結(jié)束后，PBM緩沖液流經(jīng)芯片表面時，基本上沒有解離，嘗試了用ImM HCl進行芯片的再生，但效果不太理想，最終確定用50mM NaOH以30 μ 1/min的流速再生芯片，每次用5 μ 1即可； 而非互補序列樣品Non-Btl的結(jié)果如圖5所示，非互補序列樣品Non-Btl沒有與Sra生物傳感器的芯片表面的探針發(fā)生互作，進樣前為^47RU (進緩沖液)，用PBM解離 aiiin后為沈50冊，RU值基本上沒有改變，這表明包被好的芯片的特異性很好，可以用來進行CrylAc基因的檢測。
三、SPR生物傳感器檢測PCR產(chǎn)物的條件驗證 1、SPR檢測PCR產(chǎn)物的緩沖液條件摸索 PCR產(chǎn)物為雙鏈結(jié)構(gòu)，因此在檢測前必須使其變性成單鏈，采用的方法是將上述 PCR產(chǎn)物分別金屬浴上100°C加熱5min，迅速轉(zhuǎn)移到冰水中，使樣品保持單鏈狀態(tài)，檢測時從冰水中取出在25°C的條件下以5μ 1/min的流速流經(jīng)芯片表面，如果分析物中存在可以與生物素標記的探針互補的序列，在芯片表面發(fā)將會發(fā)生雜交，從而引起RU值的變化(檢測流程圖如圖6所示)。
樣品檢測時，緩沖液非常關(guān)鍵，緩沖條件合適時，互作信號很明顯；但是如果沒有注意到樣品的緩沖條件，往往檢測不到互作信號。
提取NUCOtn3;3B棉花葉片的基因組DNA，并以此為模板，用目標基因的特異性引物BtFW和BtRV (表3)，采用高保真DNA聚合酶經(jīng)過聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增得到PCR產(chǎn)物，PCR 擴增程序:94°C for 3min，94°C for 30s，54°C for 30s, 72°C for45s, 35cycles ； 72°C for 5min ； 10°C for ever。結(jié)果如圖 7 所示，得到 1780bp 片段。
將該PCR產(chǎn)物送去測序，結(jié)果為該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸， 與已報道的轉(zhuǎn)CrylAc基因棉花中的CrylAc基因堿基序列(GenBank :Y09787)同源性達 96. 18%。
將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III酶切后回收片段，與經(jīng)過同樣酶切的原核表達載體PGEX-KG(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，MCV030)載體大片段連接，得到連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為將序列表中序列1插入pGEX-KG的Xho I和Hind III酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為 pGEX-KG-CrylAc。
表3為目標基因的特異性引物
基因名稱引物名稱引物序列酶切位點CrylAcBtFW5 ‘ AACCTCGAGATGGACAACAACCCAAACATCMC 3 ‘Xho IBtRV5' ACCAAGCTTCGCTGAMTTCCTAACACCCACGAT 3'Hind III 以pGEX-KG-CryIAc質(zhì)粒為模板，用引物BtFWl和BtRVl進行PCR擴增，純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物用無菌水回收，取30 μ 1加入等體積的PBM緩沖液調(diào)節(jié)緩沖條件(是先加緩沖液再進行單鏈處理)，再在金屬浴上100°C加熱5min，迅速轉(zhuǎn)移到冰水中，使樣品保持單鏈狀態(tài)，從冰水中取出樣品在25°C的條件下以5μ Ι/min的流速流經(jīng)芯片表面，上樣量為20 μ 1 (時間為4min)，然后用PBM緩沖液解離2min，結(jié)果如圖8所示，可以看到分析物與探針發(fā)生了互作，由進樣前的1828RU (進緩沖液)，增大到1866RU (用PBM解離2min后的值)，響應值增大了約38RU。
而直接取無菌水回收的同樣的PCR產(chǎn)物(沒有進行緩沖處理)進行檢測時，結(jié)果如圖9所示，由進樣前的1821RU(進緩沖液)，用PBM解離2min后1810RU，沒有檢測到互作。
2、SI3R檢測PCR產(chǎn)物的純度條件摸索 如果PCR產(chǎn)物直接拿來檢測，結(jié)果往往出現(xiàn)異?，F(xiàn)象。
以pGEX-KG-CryIAc質(zhì)粒為模板，用引物BtFWl和BtRVl進行PCR擴增(未純化 PCR產(chǎn)物)，PCR產(chǎn)物取10 μ 1力卩入90 μ 1 PBM緩沖液調(diào)節(jié)緩沖條件，再在金屬浴上100°C 加熱5min，迅速轉(zhuǎn)移到冰水中，使樣品保持單鏈狀態(tài)，從冰水中取出樣品在25°C的條件下以5 μ 1/min的流速流經(jīng)芯片表面，上樣量為20 μ 1 (時間為4min)，然后用PBM緩沖液解離 2min，結(jié)果如圖10所示，Sra檢測時檢測到了互作信號，由進樣前的1911RU(進緩沖液)，增大到2136RU(用PBM解離2min后的值)，響應值增大了約225RU，但曲線不同于常見的互作曲線(解離時RU值逐漸降低或不變)，它在解離時RU值有個增大的過程，隨后才慢慢減小。
結(jié)果的異?？赡茉谟赑CR產(chǎn)物中的成分過于復雜，有大量的酶，鹽離子等干擾成分，在Sra檢測時影響了分析物與探針的結(jié)合，因此，建議PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒做一個快速簡單的純化，去除干擾因素后再檢測，此時結(jié)果非常穩(wěn)定且準確。
實施例2、SPR生物傳感器檢測目的基因 1、樣品制備 上述試驗從各個方面探討了 sra檢測時需要注意的問題，為接下來的轉(zhuǎn)基因檢測提供了依據(jù)。
實驗使用植物基因組快速提取試劑盒(Novascience，Dg05020)提取了野生型棉花DPM15和轉(zhuǎn)基因棉花NuCotn33B的基因組，以它們?yōu)槟０?，用引物BtFWl和BtRVl分別進行PCR擴增；分別得到野生型棉花DPM15的PCR產(chǎn)物和轉(zhuǎn)基因棉花NuCOtn3;3B的PCR產(chǎn)物。
此外，為了分析芯片在檢測PCR產(chǎn)物時是否具有特異性，設計了一個負對照，艮口用弓I 物 BtFW2 禾口 BtRV2(BtFW2 5 ‘ CGGTTACACTCCCATCGACATCTCC 3 ‘ ；BtRV2 5' TTGAATTGAATACGCATTTCCTCGC 3')以轉(zhuǎn)基因棉花Nucotn3;3B的基因組為模板進行PCR 擴增，得到對照PCR產(chǎn)物。
將上述三種PCR產(chǎn)物分別經(jīng)過純化試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司， EP101-01)純化后用BIACOre3000進行檢測，具體如下的步驟2。
2、檢測 分別將上述純化后的三種PCR產(chǎn)物取10 μ 1加入90 μ 1 PBM緩沖液進行緩沖條件的調(diào)節(jié)(將純化后PCR產(chǎn)物與PH值為7. 4的PBM緩沖液混勻(室溫25°C下用移液槍吹打混勻)，再在金屬浴上100°C加熱5min，迅速轉(zhuǎn)移到冰水中，使樣品保持單鏈狀態(tài)，從冰水中取出樣品在25°C的條件下以5 μ 1/min的流速進樣，總進樣量20 μ 1 (時間為^iin)，然后用 PBM緩沖液解離anin。
轉(zhuǎn)基因棉花NUCOtn33B的PCR產(chǎn)物的結(jié)果如圖11所示，能檢測到很明顯的互作信號，RU值隨著樣品的流入逐漸增大，表明樣品與探針正在發(fā)生互作，通入PBM緩沖液時發(fā)生了緩慢解離，能檢測到很明顯的互作信號，RU值隨著樣品的流入逐漸增大，表明樣品與探針正在發(fā)生互作，通入PBM緩沖液時發(fā)生了緩慢解離，響應值由進樣前的1909RU，增大到1930RU(用PBM解離^iiin后的值)，解離結(jié)束后響應值增大了 21RU，說明轉(zhuǎn)基因棉花 Nucotn33B中含有目的基因CryIAc。
野生型棉花DPM15的PCR產(chǎn)物的結(jié)果如圖12所示，沒有檢測到與探針的互作，進樣前的響應值為1843RU (進緩沖液)，用PBM解離^iin后響應值減小為1^6RU，RU值沒有增加，說明野生型棉花DPM15中不含有目的基因CrylAc。
對照PCR產(chǎn)物的結(jié)果如圖13所示，同樣沒有檢測到與探針的互作，進樣前的響應值為1851RU (進緩沖液)，用PBM解離^iin后為1843RU，進樣后RU值沒有增加，說明對照 PCR產(chǎn)物里沒有目的基因Cry IAc。
本發(fā)明對目的基因CrylAc的定性檢測，上述三種樣品，每種樣品至少重復了 5次 (從采樣到PCR到純化到檢測均獨立進行)，每次的結(jié)果均和上述無顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種輔助檢測或檢測待測生物中目標基因的方法，包括如下步驟1)提取待測生物的基因組DNA作為模板，以如下權(quán)利要求5或6所述試劑中的所述引物對作為引物，進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物變性為單鏈DNA分子；3)將步驟2)得到的單鏈DNA分子流經(jīng)如下權(quán)利要求7或8所述的SI3R生物傳感器的傳感芯片，若檢測的RU值發(fā)生改變，則所述待測植物中候選含有或含有目標基因，若檢測的RU值未發(fā)生變化，則所述待測植物中候選不含有或不含有目標基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述生物為植物；所述目標基因為抗蟲蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述植物為轉(zhuǎn)入所述目標基因的植物；所述抗蟲蛋白的編碼基因為CrylAc ；所述CrylAc的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在所述步驟1)后和所述步驟幻前，還依次包括純化所述PCR產(chǎn)物和緩沖處理所述PCR 產(chǎn)物的步驟；所述緩沖處理PCR產(chǎn)物包括如下步驟將所述純化得到的純化后PCR產(chǎn)物與PH值為 7. 4的PBM緩沖液混勻，得到緩沖處理后PCR產(chǎn)物；步驟2)中，所述變性采用的溫度為100°C，所述變性采用的時間為5min ； 步驟3)中，所述流經(jīng)的速度為5 μ Ι/min，所述流經(jīng)的溫度為25°C，所述流經(jīng)的時間為 4min。
5.一種用于輔助檢測待測生物中目標基因的試劑，由探針和用于擴增所述探針的引物對組成，所述探針為滿足如下1)和2)條件的單鏈DNA分子1)不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體；2)與所述目標基因的核苷酸序列的同一性大于90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于 所述探針的大小為25nt ；所述探針的5'端標記生物素； 所述探針的核苷酸序列為序列表中序列1 ；所述用于擴增所述探針的引物對中的一條引物為序列表中的序列2，另一條引物為序列表中的序列3。
7.一種用于輔助檢測待測生物中目標基因的SPR生物傳感器，為將權(quán)利要求5或6所述試劑中的所述探針以共價結(jié)合的方式偶聯(lián)到傳感芯片上，得到SPR生物傳感器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物傳感器，其特征在于 所述傳感芯片為SA芯片；所述目標基因為CrylAc基因；所述偶聯(lián)包括如下步驟將含有所述探針的溶液流經(jīng)活化后的SA芯片，使其與SA芯片表面結(jié)合，得到sra生物傳感器所述含有所述探針的溶液為將所述探針和PH為7. 4的PBM緩沖液混合，得到的溶液， 所述探針在所述含有所述探針的溶液中的濃度為1 μ M ； 所述流經(jīng)的流速為10μ Ι/min ； 所述流經(jīng)的時間為128s ； 所述生物為植物，所述植物具體為棉花。
9.權(quán)利要求7或8所述SPR生物傳感器在輔助檢測生物中目標基因中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于所述生物為植物；所述目標基因為抗蟲蛋白的編碼基因；所述植物為轉(zhuǎn)入所述目標基因的植物；所述抗蟲蛋白的編碼基因為CrylAc ；所述CrylAc的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測植物中目標基因的方法及其專用SPR生物傳感器。本發(fā)明提供檢測待測植物中目標基因的方法，包括如下步驟1)提取待測生物的基因組DNA作為模板，以如下試劑中的所述引物對作為引物，進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物變性為單鏈DNA分子；3)將含有步驟2)得到的單鏈DNA分子的溶液流經(jīng)所述的SPR生物傳感器，檢測的RU值發(fā)生改變，則所述待測植物中含有目標基因，若檢測的RU值未發(fā)生變化，則所述待測植物中不含有目標基因。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明構(gòu)建了包被探針的SPR生物傳感器，可以通過其來檢測轉(zhuǎn)基因棉花中是否含有Cry1Ac基因，其具有高靈敏度、高通量、自動化的優(yōu)點，而且操作簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102181555SQ201110100899
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者麻密, 趙卓亞, 徐文忠, 何振艷, 陳焱山 申請人:中國科學院植物研究所