專利名稱：檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
豬肉是我國居民最主要的動物蛋白質(zhì)食物來源，養(yǎng)豬業(yè)在畜牧生產(chǎn)鏈中占有舉足輕重的地位。數(shù)十年來，現(xiàn)代育種技術(shù)使豬的生產(chǎn)性能得到顯著提高，但主要針對的是生產(chǎn)性狀(生長性狀與繁殖性狀)。相對于生產(chǎn)性狀，針對豬健康及抗病能力的研究卻較為薄弱。以高瘦肉型豬為導向的育種目標造成等位基因的丟失或頻率降低從而導致現(xiàn)代商業(yè)品種的體質(zhì)和抵抗力的下降，并且隨著集約化飼養(yǎng)方式的普及，豬病特別是一些反復發(fā)生的傳染病給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來了重大損失。豬瘟(Classical swine fever,CSF)是一種由豬瘟病毒引起的高度傳染性和致死率的疫病，給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。受限于疫苗質(zhì)量、免疫程序不嚴格，以及攜帶病毒的野豬群體傳播等因素，豬瘟一直威脅著養(yǎng)豬業(yè)的安全。目前豬抗病育種研究主要是尋找控制抗病力主效基因或QTL。通過候選基因、比較基因組和基因組掃描等方法已鑒定出包括K88和/或F18受體、FUT、干擾素及其受體、 MHC、Mxl基因在內(nèi)的影響豬抗腹瀉和水腫病、抗口蹄疫、抗豬瘟和抗流感病毒等多個功能基因和QTL。其中(1)K88或F18受體缺陷型可以阻斷大腸桿菌Κ88或F18菌株的細胞表面抗原附著于小腸粘膜上皮細胞表面受體，從而對相應大腸桿菌所致腹瀉或水腫病產(chǎn)生抗性(Bertschinger, H. and Pohlenz, J. (1983)Bacterial colonization andmorphology of the intestine in porcine Escherichia coli enterotoxemia(edema disease). Veterinary pathology. 20，99.)。 V0geli 等(Vogeli5 P. ，Meijerink，Ε. ，F(xiàn)ries，R.， Neuenschwander, S.，Vorl nder，N.，Stranzinger，G. and Bertschinger，H. (1997) Amolecular test for the detection of E.coli F18 receptors :a breakthrough in the struggleagainst edema disease and post-weaning diarrhea in swine. Schweizer Archiv fUrTierheilkunde. 139，479.)還通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)定位于 6qll 區(qū)段的鹽藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUTl與FUT2可作為控制F18粘附的1個候選基因。美國ARS利用該標記于1999年7月宣布在大約克中育成該病的抗性豬。(2)豬的干擾素被證明對繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒等多種重大傳染病病毒均具有廣譜防御和抑制作用(Buddaert, W.，Van Reeth，K. and Pensaert，Μ. (1998) In vivo and in vitro interferon (IFN) studies with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Coronaviruses and arteriviruses. 440,461.)，因而干擾素及其受體基因是品種選育的重要候選基因。C3)MHC作為抗病育種分子標記已被證明與多種抗原的應答、細菌的噬菌作用、對旋毛蟲、弓形體的感染以及黑色素瘤和腫瘤發(fā)生等性狀相關(guān)，是非特異性抗病力的重要選擇位點。(4)研究證明，轉(zhuǎn)小鼠MXl基因的轉(zhuǎn)基因豬增 ^7Wift^liJ (Muller, M. ， Brenig, B. ， ffinnacker, E. L. and Brem, G. (1992) Transgenic pigscarrying cDNA copies encoding the murine Mxl protein whichconfers resistance toinfluenza virus infection. Gene. 121，263-270.)。Nakajima 等 (Nakajima，E.，Morozumi, Τ.，Tsukamoto, K.，Watanabe, Τ.，Plastow, G. and Mitsuhashi, Τ. (2007)A naturally occurringvariant of porcine Mxl associated with increased susceptibility to influenza virus in vitro. Biochemical Genetics. 45,11-24.)體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬MXl基因的一個自然變異可能增加了患流感的敏感性。 SLC11A1 (又稱NRAMP1)是最近研究較多的一個抗病基因。最早報道SLC11A1與結(jié)核病、肉狀瘤病的發(fā)生有關(guān)系(Bellamy, R.，Ruwende, C.，Corrah, T.，McAdam, K. P. W. J.，Whittle, H. C. and Hill,Α. V. S. (1998)Variaions in theNRAMPl gene and susceptibility to tuberculosis in West Africans. New England Journal ofMedicine. 338，640—644.)。該基因在 Toll-like受體7配基誘導的信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控中發(fā)揮作用(Moisan，J.，Thuraisingam, Τ.， Henault, J. ， Sanctis, J. D. and Radzioch, D. (2006)Role ofSLClIAl(formerly NRAMP1) in regulation of signal transduction induced by Toll-Iikereceptor 7 ligands. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 47，138-147.)，因而可能涉及了廣泛的非特異性免疫應答。已有研究發(fā)現(xiàn)，SLClIAl基因是與豬免疫性狀、生產(chǎn)性能等相關(guān)的重要分子標記(ffu, H. , Cheng, D. and Wang, L. (2008)Association ofpolymorphisms of Nramp1 gene with immune function and production performance of largewhite pig. Journal of Genetics and Genomics. 35，91-95.)。進一步深入開展抗病性狀的候選基因研究仍將是今后豬抗病育種研究的重要內(nèi)容。 全基因組分析發(fā)現(xiàn)在哺乳動物基因組轉(zhuǎn)錄了很多非編碼RNA，越來越多的證據(jù)顯示這些非編碼RNA并非只是轉(zhuǎn)錄的“噪聲”，而是可以作為結(jié)構(gòu)RNA或小RNA的前體參與 $1 白勺(Pouting， C. P. ， Oliver, P. L. and Reik, W. (2009)Evolution and functions oflong noncoding RNAs. Cell. 136,629-641·)。NEATl 是 Peyman 等(Peyman, J. A. (1999) Repression of major histocompatibility complex genes by a human trophoblast ribonucleicacid. Biology of reproduction. 60,23.)發(fā)現(xiàn)的主要在滋養(yǎng)層細胞中表達的一種潛在的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物。人NEATl基因能夠抑制II類反式激活因子啟動子從而抑制主要組織相容性復合體的表達，并且顯著抑制B細胞的同種異體反應(Geirsson， Α.，Bothwell，A. L.Μ. and Hammond，G. L. (2004)Inhibition of alloresponse by a human trophoblastnon-coding RNA suppressing class II transactivator promoter III and majorhistocompatibility class II expression in murine B-lymphocytes. The Journal of heart andlung transplantation· 23，1077—1081·)。 NEATl 可以與 paraspeckle protein (P54nrb)結(jié)合(Murthy，U. and Rangarajan, P. N. Identification of protein interaction regions οfVINC/NEAT1/Men epsilon RNA. FEBS letters. 584， 1531.)，對paraspeckle的形成以及mRNA核滯留起關(guān)鍵作用，其表達抑制是人源胚胎干細胞中不存在mRNA核滯留的主要原因。HeLa細胞敲減NEATl后可導致paraspeckle的丟失，以及攜帶反向Alu序列的mRNA的胞核胞質(zhì)間輸出增強(Chen，L. L. md Carmichael, G. G. (2009)Altered nuclearretention of mRNAs containing inverted repeats in human embryonic stem cells :functionalrole of a nuclear noncoding RNA. Molecular cell. 35,467-478.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的特異性引物對。本發(fā)明所提供的輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的特異性引物對，為如下a)或b)所不a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對。所述特異性引物對在輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述特異性引物對在制備輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的試劑盒。本發(fā)明所提供的輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的試劑盒，含有如下a)或b)所示的特異性引物對a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對。本發(fā)明的又一個目的是提供輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法，為如下1)或2、所示1)檢測待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述CC基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA片段中自5'末端起第112位的核苷酸為C的純合體；所述GG基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA片段中自5'末端起第 112位的核苷酸為G的純合體；所述CG基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA 片段中自5 ’末端起第112位的核苷酸為C和G的雜合體；所述CC基因型和CG基因型的豬與GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力；2)檢測待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述CC基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA片段中自5'末端起第451位的核苷酸為C的純合體；所述GG基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA片段中自5'末端起第 451位的核苷酸為G的純合體；所述CG基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA 片段中自5 ’末端起第451位的核苷酸為C和G的雜合體；所述CC基因型和CG基因型的豬與GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力。所述檢測待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型的方法包括如下步驟1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；所述特異性引物對為如下a)或b)所示a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；
b)由序列表的序列3所 示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對；2)將所述PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果確定所述待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述將所述PCR擴增產(chǎn)物進行檢測的方法為如下A)或B)所示A)將所述PCR擴增產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果確定所述待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；B)用BfaI限制性內(nèi)切酶對所述PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，檢測酶切產(chǎn)物；若酶切產(chǎn)物為112bp和IOSbp的兩個片段，則確定所述待測豬的基因型為CC基因型；若酶切產(chǎn)物為 220bp的一個片段，則確定所述待測豬的基因型為GG基因型；若酶切產(chǎn)物為112bp、IOSbp 和220bp的三個片段，則確定所述待測豬的基因型為CG基因型。所述步驟2)中所述酶切產(chǎn)物是通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；若所述酶切產(chǎn)物在凝膠上顯示為100bp-200bp和100bp-200bp的兩個條帶，則確定所述待測豬的基因型為CC基因型；若酶切產(chǎn)物為在凝膠上顯示為200bp-300bp的一個條帶，則確定所述待測豬的基因型為GG基因型；若酶切產(chǎn)物為在凝膠上顯示為100bp-200bp、100bp-200bp和 200bp-300bp的三個條帶，則確定所述待測豬的基因型為CG基因型。所述豬瘟病是由豬瘟病毒引起的；所述CC基因型和CG基因型的豬與GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力為所述CC基因型和CG基因型的豬的血液中的豬瘟病毒的抗體效價高于GG基因型的豬。所述特異性引物對、所述試盒和/或所述方法在豬的育種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的又一個目的是提供一種豬的育種方法。本發(fā)明所提供的豬的育種方法，是選擇所述方法檢測出CC基因型或CG基因型的豬進行育種。本發(fā)明的方法是在豬NEATl同源序列保守區(qū)設(shè)計引物擴增不同品種豬基因組DNA 片段，獲得的片段含有一處C/G突變，并利用該突變位點引起的BfaI酶切位點的多態(tài)性檢測豬免疫性狀——豬瘟病毒抗體水平。實驗證明該突變位點與豬瘟病毒抗體水平存在顯著相關(guān)，表明本發(fā)明利用該突變位點來評估豬瘟病毒抗體水平的方法是準確可行的方法。本發(fā)明的方法可用于評估豬瘟病毒抗體效價，從而為豬的分子育種提供了一個新的檢測其遺傳性狀的方法，并將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。


圖1為三種基因型的樣本的電泳結(jié)果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、豬NEATl基因RFLP多態(tài)性檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法一、豬NEAT 1基因RFLP多態(tài)性位點的識別
根據(jù)豬NEATl基因保守區(qū)序列設(shè)計引物，引物序列如下Neatla 5' -GGAGGTGGACAAAATTGACC-3‘(序列表中序列 3)，Neatlb 5' -GACACGGGACATTGGAGAAC-3‘(序列表中序列 4)。分別以通城豬、大白豬、長白豬、五指山豬、萊蕪豬、巴馬香豬各3只的基因組DNA 為模板，以Neatla和Neatlb為引物進行PCR擴增，PCR反應總體積為20yL，其中模板 DNA 為 50ng，含 IXBuffer, 1. 5mmol/L 的 MgCl2, dNTP 終濃度為 200 μ mol/L，引物終濃度為 0. 2 μ mol/L, 1. OU Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴增程序為95°C 5min預變性，接著是 950C 30s, 600C 30s, 72°C 30s，循環(huán)；35 次，最后 72°C延伸 5min。該引物擴增片段長559bp，即序列表中序列1。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收和克隆測序， 用DNAstar7. 0軟件中的kqMan模塊對序列進行比對和分析可能的多態(tài)位點。分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，序列表中序列1自5'末端起第451位存在C或G的突變，當?shù)?51位核苷酸為C 時，存在1個BfaI酶切位點(C丨TAG)，可造成序列表中序列1內(nèi)BfaI酶切片段多態(tài)。二、豬NEATl基因RFLP多態(tài)性檢測方法的建立1、引物設(shè)計在這個多態(tài)位點兩側(cè)設(shè)計引物，引物序列如下BfaIa 5' -GTACCCGCTGAAAGCTACGC-3‘(序列表中序列 5)，BfaIb 5' -GGCCTAGACACGGGACATTG-3‘(序列表中序列 6)。2、實驗材料用于基因多態(tài)性檢測的DNA樣品來自7個豬群(表1)。采用酚氯仿方法提取豬血液基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆?。表IRFLP多態(tài)性檢測的群體和樣品數(shù)
權(quán)利要求
1.輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的特異性引物對，為如下a)或b)所示a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對。
2.權(quán)利要求2所述的特異性引物對在輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀中的應用。
3.權(quán)利要求1所述的特異性引物對在制備輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的試劑盒中的應用。
4.一種輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的試劑盒，含有如下a)或b)所示的特異性引物對a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對。
5.輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法，為如下1)或2)所示1)檢測待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述CC基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA片段中自5'末端起第112位的核苷酸為C的純合體；所述GG基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA片段中自5'末端起第112 位的核苷酸為G的純合體；所述CG基因型為基因組DNA中的序列表中序列2所示DNA片段中自5 ‘末端起第112位的核苷酸為C和G的雜合體；所述CC基因型和CG基因型的豬與 GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力；2)檢測待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述CC基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA片段中自5'末端起第451位的核苷酸為C的純合體；所述GG基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA片段中自5'末端起第451 位的核苷酸為G的純合體；所述CG基因型為基因組DNA中的序列表中序列1所示DNA片段中自5 ‘末端起第451位的核苷酸為C和G的雜合體；所述CC基因型和CG基因型的豬與 GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述檢測待測豬的基因型為CC基因型、 GG基因型還是CG基因型的方法包括如下步驟 1)將待測豬的基因組DNA作為模板，用特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；所述特異性引物對為如下a)或b)所示a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對；2)將所述PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果確定所述待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；所述將所述PCR擴增產(chǎn)物進行檢測的方法為如下A)或B)所示A)將所述PCR擴增產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果確定所述待測豬的基因型為CC基因型、GG基因型還是CG基因型；B)用BfaI限制性內(nèi)切酶對所述PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，檢測酶切產(chǎn)物；若酶切產(chǎn)物為112bp和IOSbp的兩個片段，則確定所述待測豬的基因型為CC基因型；若酶切產(chǎn)物為 220bp的一個片段，則確定所述待測豬的基因型為GG基因型；若酶切產(chǎn)物為112bp、IOSbp 和220bp的三個片段，則確定所述待測豬的基因型為CG基因型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟幻中所述酶切產(chǎn)物是通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；若所述酶切產(chǎn)物在凝膠上顯示為100bp-200bp和100bp-200bp的兩個條帶，則確定所述待測豬的基因型為CC基因型；若酶切產(chǎn)物為在凝膠上顯示為200bp-300bp的一個條帶，則確定所述待測豬的基因型為GG基因型；若酶切產(chǎn)物為在凝膠上顯示為100bp-200bp、100bp-200bp和200bp-300bp 的三個條帶，則確定所述待測豬的基因型為CG基因型。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述豬瘟病是由豬瘟病毒引起的；所述CC基因型和CG基因型的豬與GG基因型的豬相比，具有更強的抗豬瘟病能力為 所述CC基因型和CG基因型的豬的血液中的豬瘟病毒的抗體效價高于GG基因型的豬。
9.權(quán)利要求1所述特異性引物對、權(quán)利要求4所述試盒和/或權(quán)利要求5-8中任一所述的方法在豬的育種中的應用。
10.一種豬的育種方法，是選擇權(quán)利要求5-8中任一所述的方法檢測出CC基因型或CG 基因型的豬進行育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測豬的抗豬瘟病性狀的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明所提供的輔助檢測豬的抗豬瘟病性狀的特異性引物對，為如下a)或b)所示a)由序列表的序列5所示的DNA片段和序列表的序列6所示的DNA片段組成的引物對；b)由序列表的序列3所示的DNA片段和序列表的序列4所示的DNA片段組成的引物對。本發(fā)明的方法是在豬NEAT1同源序列保守區(qū)設(shè)計引物擴增不同品種豬基因組DNA片段，獲得的片段含有一處C/G突變，并利用該突變位點引起的BfaI酶切位點的多態(tài)性檢測豬的豬瘟病毒抗體水平。實驗證明該突變位點與豬瘟病毒抗體水平存在顯著相關(guān)，表明本發(fā)明利用該突變位點來評估豬瘟病毒抗體水平的方法是準確可行的方法。
文檔編號C12Q1/70GK102181582SQ201110100750
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者儲明星, 唐中林, 張寧波, 敖紅, 李勇, 李奎, 楊述林 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所