專利名稱：一種抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物及其制劑領(lǐng)域，更具體地說，是涉及一種抗豬瘟轉(zhuǎn)移 因子的制備方法。
背景技術(shù)：
豬瘟是由豬瘟病毒感染引起的豬急性、熱性、高致死性傳染病，也是
一種毀滅性傳染病，遍及全世界。巴黎國際獸醫(yī)局(OIE)的國際衛(wèi)生法規(guī) 已將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，目前有20多個國家宣布消滅豬 瘟，我國尚未消滅。
豬瘟臨床癥狀主要有一下幾種
1、 急性豬瘟。病豬體溫升高至40—42。C，精神沉郁、怕冷、嗜睡；病 初便秘，隨后出現(xiàn)糊狀或水樣并混有血液的腹瀉，大便惡臭；結(jié)膜炎、口 腔粘膜不潔、齒齦和唇內(nèi)以及舌體上可見有潰瘍或出血斑；后期鼻端、唇、 耳、四腳、腹下及腹內(nèi)側(cè)等處皮膚上有出血點或斑。常繼發(fā)細菌感染，以 肺炎或壞死性腸炎多見。
2、 慢性豬瘟。病豬體溫升高不明顯；貧血、消痩和全身衰弱， 一般病 程超過一個月；食欲時好時壞，便秘和腹瀉交替發(fā)生;耳尖、尾根和四肢 皮膚壞死或脫落。慢性豬瘟存活者嚴(yán)重發(fā)育不良，成為僵豬。
3、 非典型豬瘟。又稱亞臨床豬瘟。臨床癥狀與解剖病變不典型，發(fā)病 率與死亡率顯著降低，病程明顯延長，新生仔豬感染死亡率較高，大豬一 般能耐過；懷孕母豬感染出現(xiàn)流產(chǎn)，出現(xiàn)胎兒干尸，死胎及畸形胎。
4、 遲發(fā)型豬瘟。是先天感染的后遺癥，感染豬出生后一段時間內(nèi)不表 現(xiàn)癥狀，數(shù)月后出現(xiàn)輕度厭食、不活潑、結(jié)膜炎、后軀麻痹，但體溫正常，可存活半年左右后死亡。懷孕母豬感染低毒力豬瘟病毒可表現(xiàn)群發(fā)性流產(chǎn)、 死產(chǎn)、胎兒干尸化、畸形和產(chǎn)出震顫的弱仔豬或外觀健康實際已感染的仔 豬。
盡管目前市場上有一些抗豬瘟的臨床用藥，但是現(xiàn)有藥劑的爭對性不 強，療效有限，而且，治療性制劑多是發(fā)病后采用的，不能起到預(yù)防的作 用。對于易感染豬瘟的豬群。每年定期的對豬接種豬瘟病毒疫苗是預(yù)防豬 瘟的有效方法，其次應(yīng)增強營養(yǎng)或藥物干預(yù)，提高自身免疫力，通過藥物 提高機體抵抗力或免疫力也是一種預(yù)防豬瘟的有效方法。
轉(zhuǎn)移因子(TF， Transfer Factor)是從淋巴細胞中提取的一類低分子肽 與核苷酸復(fù)合物，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、 增強機體非特異性細胞免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發(fā)劑，細 胞免疫的增強劑、細胞免疫調(diào)節(jié)劑及干擾素產(chǎn)生啟動劑。轉(zhuǎn)移因子分子量 小、無毒、無抗原性、不起過敏反應(yīng)，不產(chǎn)生對抗抗體且可超越種系界限 應(yīng)用等優(yōu)點。自美國著名的免疫學(xué)專家Lawrence發(fā)現(xiàn)和研究轉(zhuǎn)移因子以來， 世界各國不但進行了許多理論研究，而且進行了大量的臨床應(yīng)用研究，使 得轉(zhuǎn)移因子成為目前應(yīng)用廣泛的增強免疫制劑。
目前已報道的提取的轉(zhuǎn)移因子大多數(shù)都是關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制 備方法。本發(fā)明采用特殊病毒株病毒免疫抗原的方法提取特異性的轉(zhuǎn)移因 子，提取方法在已報道的傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上加以改進，縮短生產(chǎn)時間，簡化 生產(chǎn)工藝。
采用特殊病毒株免疫抗原提取抗豬瘟病毒的轉(zhuǎn)移因子，具有重要的理 論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天然高效的抗豬瘟病病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種簡單有效的抗豬瘟病轉(zhuǎn)移因子的制備 方法，步驟包括
(1) 先用注射用水洗凈用豬瘟病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面 的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1 2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用 高速組織搗碎機1000 3000rpm搗碎3~5次，每次3 5min，制得豬脾勻漿 液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理5 10min;
(4) 將步驟(3)中得到的勻漿液用HC1調(diào)pH5.0~6.0或者加入0.1 0.3% 擰檬酸，4"C， 3000 8000rpm離心10 30min，收集上清液；
(5) 上清液用0.2pm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000 道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；
(6) 將超濾得到的濾液用0.22|am濾膜進行無菌過濾，即得到抗豬瘟 病病毒轉(zhuǎn)移因子原液，4"C保存。
在具體實施方案中，實施上述步驟之前，步驟還包括制備病毒抗原、 提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬的步驟。這些步驟，可選用常規(guī)技術(shù)實施。 其中，所述的制備病毒抗原步驟，優(yōu)選將豬瘟病病毒接種于9 11日齡雞 胚尿囊液30-40。C培養(yǎng)24~72h。取雞胚尿囊液，-20卩反復(fù)凍融4 8次， 3000~8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清液。其中，所述的豬瘟病 病毒株來自病毒株E2或CSFV39株或BVDV株等。在一個優(yōu)選實施方案中， 豬瘟病病毒株選自本申請人保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358) 和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)。
所述的提取病毒抗原步驟，優(yōu)選上清液用蔗糖密度梯度離心純化提 取病毒，蔗糖濃度為10% 80%， 150000 200000rpm離心2 4小時，根據(jù)豬
6瘟病病毒分子量確定豬瘟病病毒所在離心管的位置，吸出備用；
所述的病毒抗原免疫豬步驟，優(yōu)選挑選健康免疫豬，將上述提取的 病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3~5次。每次免疫間隔一周，最后 一次免疫7~10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的 特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保 存，備用。
本發(fā)明的第二個目的在于提供通過上述方法所制備的轉(zhuǎn)移因子。 在一個優(yōu)選實施方案中，上述方法使用的豬瘟病病毒株選自本申請人
保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank
accession NO. U63479)。
由于轉(zhuǎn)移因子是從淋巴細胞中提取的一類低分子肽與核苷酸復(fù)合物， 目前并沒有明確的組分或結(jié)構(gòu)，制備方法或所用病毒株的不同，所得的轉(zhuǎn) 移因子也會差異，因此通常在生產(chǎn)過程中是通過限定制備方法和所用病毒 株來明確轉(zhuǎn)移因子。在本發(fā)明中，由于限定了具體的制備方法和特異的病 毒株，因此所得到的轉(zhuǎn)移因子具有組分穩(wěn)定、純度高、活性好等特點，具 有很好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具有以下優(yōu)點
1、 豬脾臟屬于屠宰場的下腳料，原料來源容易；
2、 組織經(jīng)組織搗碎機搗碎后，采用大功率的超聲波設(shè)備處理，縮短反 復(fù)凍融時間，而且也避免了因高壓均質(zhì)機破壁處理時由于筋膜的存在而 堵塞高壓均質(zhì)機；
3、 離心前用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH，使大部分蛋白絮凝，使得離心后的上清液 的澄清度明顯好于以前的方法；而且有利用后續(xù)的微濾、超濾操作；4、 在勻漿液中加入0.1~0.3%檸檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，簡化后 面的離心處理；
5、 本發(fā)明既可基于前期的常規(guī)病毒抗原免疫步驟，又可優(yōu)選本發(fā)明的 免疫步驟，具有靈活高效的優(yōu)點。
6、 所述轉(zhuǎn)移因子的提取方法，顯著地縮短了生產(chǎn)時間，簡化了生產(chǎn)工 藝。
7、 提取物經(jīng)體外生物活性試驗及藥理、毒性試驗等證明，具有純度高、 免疫活性起效快而維持時間長、易吸收、無任何不良反應(yīng)等特點，其療 效確切，安全可靠，既可治療又可增強抗病能力。該提取物可做成口服、 注射、噴霧等劑型，便于使用。
8、 本發(fā)明所用的病毒株，屬于申請人保藏的CSFV39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479),與常規(guī)豬瘟病 毒株相比，具有更高的免疫原性，因而采用該病毒株免疫抗原的方法所 提取的轉(zhuǎn)移因子，包含特異性好和純度高的低分子肽與核苷酸復(fù)合物， 其活性水平明顯優(yōu)于常規(guī)方法和常規(guī)病毒株所制備的轉(zhuǎn)移因子。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。 實施例l:抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子的制備
1、 將豬瘟病毒株CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)接種于9~11日齡雞胚尿囊液37*€培養(yǎng) 48h。取雞胚尿囊液，-20"反復(fù)凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉
淀收集上清液；
2、 取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%, 150000rpm離心4小
時，根據(jù)豬瘟病毒分子量確定豬瘟病毒所在離心管的位置，吸出備用；
3、 得到的豬瘟病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒 抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次 免疫7天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特異 性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保存，
4、 從得到的豬脾臟提取抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子
(1) 先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生 理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高 速組織搗碎機2000rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻漿液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理5min;
(4) 將(3)中得到的勻漿液用HC1調(diào)pH5.0， 4°C， 5000rpm離心30min，
收集上清液；
(5) 上清液用0.2nm中空纖維柱微濾，收集濾出液；
(6) 濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集 濾出液；
(7) 將超濾得到的濾液用0.22pm濾膜進行無菌過濾；
(8) 分裝，4"C保存，即得到抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)移因子原液。
實施例2:抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子的制備
1、 將豬瘟病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液37'C培養(yǎng)72h。取雞胚尿囊 液，-20°(:反復(fù)凍融5次，5000rpm離心30min，棄去沉淀收集上清液；
2、 取上清液，上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為15%、 30%、 45%、 60%、 75%， 180000rpm離心3小時，根據(jù)豬瘟病毒 分子量確定豬瘟病毒所在離心管的位置，吸出備用； 3、 得到的豬瘟病毒抗原免疫豬，挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒 抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫4次。每次免疫間隔一周，最后一次 免疫10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或ELISA法檢測上述病毒的特 異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺豬，取脾臟于-2(TC保 存，備用；
4 、 從得到的豬脾臟提取抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子
(1) 先用注射用水洗凈脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生 理鹽水沖洗；
(2) 將洗凈的豬脾臟剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS緩沖液，用高 速組織搗碎機1500rpm搗碎3次，每次5min，制得豬脾勻漿液；
(3) 豬脾勻漿液用超聲波(4KW、 3KHz)處理10min;
(4) 將(3)中得到的勻衆(zhòng)液用加入0.1%檸檬酸，混勻，4°C， 6000rpm 離心30min，收集上清液；
(5) 上清液用0.2nm中空纖維柱微濾，收集濾出液；
(6) 濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集 濾出液；
(7) 將超濾得到的濾液用0.22pm濾膜進行無菌過濾；
(8) 分裝，fC保存，即得到抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)移因子原液。
實施例3:對本發(fā)明所述工藝制備的抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子的檢測
對實施例1、 2所述工藝制備的抗豬瘟轉(zhuǎn)移因子進行以下檢測
1、紫外分光光度測定上述所得樣品在252±2nm處有一吸收峰，且
ABS260/ABS280〉2.0。2、 標(biāo)準(zhǔn)液為淡黃色，pH值在6.0-8.0之間。
3、 細菌學(xué)檢驗上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
4、 20%磺基水楊酸檢測上述所得樣品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白
反應(yīng)均成陰性，其不含大分子蛋白質(zhì)。
5、 核酸含量測定上述所得樣品經(jīng)地衣酚法測定核酸含量分別為 578.53|Lig/mL、 521.68|ig/mL。
6、 多肽含量測定上述所得樣品經(jīng)Lowry法測定多肽含量分別為-6.89mg/mL、 6.45 mg/mL。
7、 轉(zhuǎn)移因子活性測定根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細胞恢 復(fù)其受體功能，從而反應(yīng)轉(zhuǎn)移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰 花結(jié)的百分率分別為28.6%、 26.9°/。，比對照組分別增加18.5%、 16.8%
(PS0.01)。
8、 過敏性、毒性試驗取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品濃
縮液，相當(dāng)于正?？诜┝康?00倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結(jié)
果無任何過敏、毒性反應(yīng)，也無任何死亡出現(xiàn)，說明本品是安全的，無 任何毒性和副作用。
9、 用豬瘟抗原做皮試檢測，有弱的陽性反應(yīng)，說明本品具有良好的轉(zhuǎn) 移活性和特異性。
通過上述實施例，我們發(fā)現(xiàn)所提取的抗豬瘟病轉(zhuǎn)移因子可以全面抑制 豬瘟病病毒，能保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒的感染。因此使用本發(fā) 明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防豬瘟病、保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒侵 害的作用，從而降低發(fā)病率。同時對于遭受到豬瘟病病毒感染的豬使用該 轉(zhuǎn)移因子進行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
權(quán)利要求
1、一種抗豬瘟病轉(zhuǎn)移因子的制備方法，步驟包括(1)先用注射用水洗凈用豬瘟病病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再用生理鹽水沖洗；(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS緩沖液，用高速組織搗碎機1000～3000rpm搗碎3～5次，每次3～5min，制得豬脾勻漿液；(3)豬脾勻漿液用超聲波(4KW、3KHz)處理5～10min；(4)將步驟(3)中得到的勻漿液用HCl調(diào)pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％檸檬酸，4℃，3000～8000rpm離心10～30min，收集上清液；(5)上清液用0. 2μm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；(6)將超濾得到的濾液用0.22μm濾膜進行無菌過濾，即得到抗豬瘟病病毒轉(zhuǎn)移因子原液，4℃保存。
2、 權(quán)利要求1所述的方法，其中在實施上述步驟之前，還包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬等步驟。
3、 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的制備病毒抗原步驟，包括將豬瘟病病毒接種于9 11日齡雞胚尿囊液30 4(TC培養(yǎng)24 72h。取雞胚尿囊液，-20。C反復(fù)凍融4~8次，3000~8000rpm離心10 30min，棄去沉淀收集上清液。
4、 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的提取病毒抗原步驟，包括上清液用蔗糖密度梯度離心純化提取病毒，蔗糖濃度為10%~80%，150000 200000rpm離心2 4小時，根據(jù)豬瘟病病毒分子量確定豬瘟病病毒所在離心管的位置，吸出備用。
5、 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的病毒抗原免疫豬步驟，包括挑選健康免疫豬，將上述提取的病毒抗原皮下多點注射免疫豬，共免疫3 5次。 每次免疫間隔一周，最后一次免疫7 10天后取豬靜脈血，以免疫熒光法或 ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后， 宰殺豬，取脾臟于-2(TC保存，備用。
6、權(quán)利要求1或2所述的方法，其中豬瘟病毒株選自本申請人保藏的CSFV 39(Genbank accession NO. J04358)和/或BVDV (Genbank accession NO. U63479)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天然高效抗豬瘟病轉(zhuǎn)移因子的制備方法，包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬、從免疫豬的脾臟中提取抗豬瘟病轉(zhuǎn)移因子等步驟。使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防豬瘟病、保護正常機體細胞免受豬瘟病病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時對于遭受到豬瘟病病毒感染的豬使用該轉(zhuǎn)移因子進行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
文檔編號C07K1/34GK101475627SQ20081015399
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者李旭東, 管于平, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司