專利名稱：利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用β-葡聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵，特別是一種利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用β-葡聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
葡聚糖屬一種非淀粉多糖，是由β_1，3葡萄糖苷鍵與β _1，4糖苷鍵連接而成的多糖，存在于大麥、燕麥、小麥等的糊粉層和胚乳植物細(xì)胞壁中，在水溶液中具有較高粘性。 單胃動(dòng)物由于自身不具備合成β -葡聚糖酶的微生物及分解葡聚糖的酶系，使食糜在腸道中具有較高的粘度，而阻止蛋白質(zhì)和脂肪營(yíng)養(yǎng)的吸收，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)作用，降低飼料的轉(zhuǎn)化率，抑制畜禽生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)出成本的增加。飼用葡聚糖酶應(yīng)用于飼料工業(yè)中降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子葡聚糖，使其失去親水性和粘性、改變單胃動(dòng)物腸道內(nèi)容物的粘度及消化酶的活性，提高飼料利用率、畜禽的生長(zhǎng)性能及整齊度。產(chǎn)生β-葡聚糖酶的主要以下途徑在植物萌芽早期過程中產(chǎn)生，大麥等谷類種子發(fā)芽過程中產(chǎn)生葡聚糖酶催化水解胚乳細(xì)胞壁中的葡聚糖，解除其對(duì)胚乳中其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的抗性作用，可以降低浸提物的粘度，其催化時(shí)表現(xiàn)出對(duì)底物的糖苷鍵極強(qiáng)的專一性。另一途徑主要來源為微生物發(fā)酵產(chǎn)生葡聚糖酶，有關(guān)產(chǎn)葡聚糖酶的微生物來源主要有細(xì)菌、真菌和瘤胃微生物。目前國(guó)內(nèi)外主要利用微生物法生產(chǎn)葡聚糖酶。利用細(xì)菌如枯草芽孢桿菌生產(chǎn)葡聚糖酶一般采用液態(tài)發(fā)酵工藝；利用曲霉菌發(fā)酵生產(chǎn)葡聚糖酶通常采用固態(tài)發(fā)酵工藝，也有的采用液態(tài)發(fā)酵工藝。飼用葡聚糖酶的生產(chǎn)一般采用固態(tài)發(fā)酵工藝，微生物在產(chǎn)生葡聚糖酶的同時(shí)，還產(chǎn)生蛋白酶等其它酶類，其它的酶蛋白有助于提高和保護(hù)葡聚糖酶的酶活性。飼料用酶制劑的生產(chǎn)，國(guó)外企業(yè)多采用單菌種純種液態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)出單項(xiàng)酶制劑，此法投入大，酶成本高，由于我國(guó)飼料工業(yè)產(chǎn)品附加值低，不適合我國(guó)飼料養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀。因此，難以有效推廣應(yīng)用，滿足不了養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)上的需要，其創(chuàng)新勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用β-葡聚糖酶的方法，可有效解決飼用β-葡聚糖酶的制備，以滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)的需要。制備方法包括菌種制備、飼用β -葡聚糖酶的生產(chǎn)、檢測(cè)復(fù)合等工藝步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明針對(duì)我國(guó)飼料養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀，可應(yīng)用在飼料工業(yè)。本發(fā)明是由以下步驟實(shí)現(xiàn)Α.菌種制備，方法是1.菌種活化，采用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，將黑曲霉菌株接入試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基的斜面上，28-30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)黑色菌落，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)斜面上挑取黑色孢子轉(zhuǎn)接入另一試管培養(yǎng)基斜面上，出現(xiàn)黑色菌落后重復(fù)以上操作，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，成為活性菌種，即菌種活化；2. 一級(jí)種子培殖，方法是，首先配制一級(jí)種子用培養(yǎng)基，將麩皮IOOgdK IOOml混配成培養(yǎng)基，裝入培養(yǎng)皿中，每500ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基30g，進(jìn)行高壓滅菌，在0. IMpa 滅菌30min，滅菌后冷卻至35°C待用；然后，將步驟1得到的活化菌株接種于已滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為每500ml的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的0. 2-0. 6%，于培養(yǎng) 65-72h,得到一級(jí)種子，一級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)為不低于90億個(gè)/g ；3. 二級(jí)種子培殖，方法是，將每IOOOml的容積內(nèi)裝入與一級(jí)種子培養(yǎng)基相同的二級(jí)種子培養(yǎng)基50g，將一級(jí)種子按培養(yǎng)基重量的0. 3% -0. 5%的比例接入培養(yǎng)基中，于
培養(yǎng)65-7池，得二級(jí)種子，二級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)為不低于60億個(gè)/g，得擴(kuò)殖的二級(jí)種子，備用；B.制備培養(yǎng)基飼用β-葡聚糖酶，方法是1.制備發(fā)酵培養(yǎng)基花生殼粉15g、麩皮70g、豆粕粉10g、大麥粉5g、(NH4) 2S042g, MgSO4 · 7H20 0. 5g、K2HPO4Ig, NaNO3Ig^jC 100ml，其中，豆粕粉、大麥粉用部分水潤(rùn)濕 2_4h， (NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20、K2HP04g、NaNO3首先溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生殼粉、麩皮及已潤(rùn)濕的豆粕粉、大麥粉中，混合均勻后裝入滅菌鍋中，滅菌1. 得滅菌后的固體發(fā)
酵培養(yǎng)基，備用；2.冷卻接種，將滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至35°C后，接入步驟A中擴(kuò)殖的二級(jí)種子，接種比例為固體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 3-0. 5%，入發(fā)酵床培養(yǎng)；3.發(fā)酵培養(yǎng)，將接種后的培養(yǎng)基置于發(fā)酵床，在室溫30°C，濕度90%，培養(yǎng)基料溫度不超過37°C，發(fā)酵37h ；發(fā)酵物為淡黃色或淺褐色，有發(fā)酵物的天然風(fēng)味；4.烘干，在溫度35-50°C下烘干，粉碎過0. 42mm孔徑篩，分裝即可。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要為普通農(nóng)副產(chǎn)物花生殼粉、麩皮等價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單易得；2.培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵周期大大縮短，只有37h;3.能產(chǎn)生飼用β-葡聚糖酶制劑；4.飼用β-葡聚糖酶酶活力高，耐熱性好，應(yīng)用效果好，經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益顯著；5.采用我國(guó)農(nóng)業(yè)部許可微生物菌株黑曲霉菌進(jìn)行發(fā)酵，安全性高，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，是綠色飼用添加劑。
四

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
五具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。由附圖給出，本發(fā)明在具體實(shí)施中是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的Α.菌種制備1.菌種活化，所采用的發(fā)酵菌株為黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，將保藏的黑曲霉菌株接入試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基的斜面上，^rc培養(yǎng)至出現(xiàn)黑色菌落，然后從試管斜面上挑取黑色孢子轉(zhuǎn)接入另一試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基的斜面上，出現(xiàn)黑色菌落后再接入第三試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基的斜面上，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，成為活性菌種；
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2. 一級(jí)種子培殖，首先制備一級(jí)種子用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由麩皮IOOgdK IOOml混勻制成，將一級(jí)種子用培養(yǎng)基裝入500ml三角瓶中，每個(gè)500ml三角瓶接入一級(jí)種子培養(yǎng)基30g，在0. IMpa下滅菌30min，滅菌后冷卻至35°C待用；將活性菌種接種于已滅菌冷卻后的一級(jí)種子培養(yǎng)基中，每個(gè)500ml的三角瓶?jī)?nèi)接入一級(jí)種子培養(yǎng)基重量的0. 4%的種子，于 ^TC培養(yǎng)68h，得到一級(jí)種子，一級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)不低于90億個(gè)/g ；3. 二級(jí)種子培殖，將與一級(jí)種子的培養(yǎng)基相同的二級(jí)種子培養(yǎng)基裝入IOOOml的三角瓶中，每個(gè)IOOOml的三角瓶裝入二級(jí)種子的培養(yǎng)基50g，一級(jí)種子按0. 4%的比例接入二級(jí)種子用培養(yǎng)基中，在^TC培養(yǎng)68h，得到二級(jí)種子，二級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)不低于60億個(gè) /g;B.飼用β -葡聚糖酶的制備1.首先制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由花生殼粉15g、麩皮70g、豆粕粉10g、 大麥粉 5g、(NH4)2S042g、MgSO4 ·7Η20 0. 5g、K2HP04lg、NaN03lg、7jC 100ml 制成，其中，豆粕粉、 大麥粉用部分水潤(rùn)濕3h，無機(jī)鹽(NH4) 2S04、MgSO4 · 7H20、K2HPO4g, NaNO3溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生殼粉、麩皮及已潤(rùn)濕的豆粕粉、大麥粉中，混合均勻后裝入滅菌鍋中，常壓滅菌1. ，成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；2.冷卻接種，將滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至35°C，接入二級(jí)種子，接種比例為0.4%，置入發(fā)酵床培養(yǎng)；3.發(fā)酵床培養(yǎng)，室溫30°C，濕度90%，培養(yǎng)基料溫度36°C，發(fā)酵37h，成淡黃色或淺褐色的發(fā)酵物；4.發(fā)酵物處理，首先在48°C下烘干，再粉碎，過0. 42mm孔徑篩，經(jīng)檢測(cè)合格后為成品，分裝。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于生產(chǎn)，費(fèi)用低，生產(chǎn)周期短，應(yīng)用效果好，是綠色的飼用添加劑，并經(jīng)試驗(yàn)取得了滿意的效果，有關(guān)試驗(yàn)資料如下1. β -葡聚糖酶耐受飼料加工的能力飼料加工包括顆粒料加工、粉料加工。表1高溫對(duì)加酶飼料酶活力的影響
權(quán)利要求
1.一種利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用葡聚糖酶的方法，其特征在于由以下步驟實(shí)現(xiàn)Α.菌種制備，方法是(1)菌種活化，采用黑曲霉菌株，將黑曲霉菌株接入試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上，28-30°C培養(yǎng)至出現(xiàn)黑色菌落，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)斜面上挑取黑色孢子轉(zhuǎn)接入另一試管培養(yǎng)基斜面上，出現(xiàn)黑色菌落后重復(fù)以上操作，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，成為活性菌種，即菌種活化；(2)一級(jí)種子培殖，方法是，首先配制一級(jí)種子用培養(yǎng)基，將麩皮IOOgdK 100 ml混配成培養(yǎng)基，裝入培養(yǎng)皿中，每500 ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基30 g，進(jìn)行高壓滅菌，在0. IMpa 滅菌30min，滅菌后冷卻至35°C待用；然后，將步驟1得到的活化菌株接種于已滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為每500 ml的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的0. 2-0. 6%，于培養(yǎng) 65-7池，得到一級(jí)種子，一級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)為不低于90億個(gè)/g ；(3)二級(jí)種子培殖，方法是，將每1000 ml的容積內(nèi)裝入與一級(jí)種子培養(yǎng)基相同的二級(jí)種子培養(yǎng)基50 g，將一級(jí)種子按培養(yǎng)基重量的0. 3%-0. 5%的比例接入培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)65-7池，得二級(jí)種子，二級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)為不低于60億個(gè)/g，得擴(kuò)殖的二級(jí)種子，備用；B.制備培養(yǎng)基飼用葡聚糖酶，方法是(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基花生殼粉15g、麩皮70g、豆粕粉10 g、大麥粉5g、(NH4)2 SO4 2 g、 MgSO4'7H20 0. 5g,K2HPO4 1 g,NaNO3 lg、水100ml，其中，豆粕粉、大麥粉用部分水潤(rùn)濕2_4h， (NH4) 2 S04、MgS04*7H20、K2HP04 g,NaNO3首先溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生殼粉、麩皮及已潤(rùn)濕的豆粕粉、大麥粉中，混合均勻后裝入滅菌鍋中，滅菌1. 得滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；(2)冷卻接種，將滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至35°C后，接入步驟A中擴(kuò)殖的二級(jí)種子，接種比例為固體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的0. 3-0. 5%，入發(fā)酵床培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)，將接種后的培養(yǎng)基置于發(fā)酵床，在室溫30°C，濕度90%，培養(yǎng)基料溫度不超過37°C，發(fā)酵37h ；發(fā)酵物為淡黃色或淺褐色，有發(fā)酵物的天然風(fēng)味；(4)烘干，在溫度35-50°C下烘干，粉碎過0.42mm孔徑篩，分裝即可。
2.利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用葡聚糖酶的方法，其特征在于，由所述的以下步驟實(shí)現(xiàn)Α.菌種制備(1)菌種活化，所采用的發(fā)酵菌株為黑曲霉菌株，將保藏的黑曲霉菌株接入試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上，^rc培養(yǎng)至出現(xiàn)黑色菌落，然后從試管斜面上挑取黑色孢子轉(zhuǎn)接入另一試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上，出現(xiàn)黑色菌落后再接入第三試管內(nèi)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的斜面上，連續(xù)轉(zhuǎn)接三次，成為活性菌種；(2)一級(jí)種子培殖，首先制備一級(jí)種子用培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由麩皮100g、水IOOml混勻制成，將一級(jí)種子用培養(yǎng)基裝入500ml三角瓶中，每個(gè)500ml三角瓶接入一級(jí)種子培養(yǎng)基 30g，在0. IMpa下滅菌30min，滅菌后冷卻至35°C待用；將活性菌種接種于已滅菌冷卻后的一級(jí)種子培養(yǎng)基中，每個(gè)500ml的三角瓶?jī)?nèi)接入一級(jí)種子培養(yǎng)基重量的0. 4%的種子，于培養(yǎng)68h，得到一級(jí)種子，一級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)不低于90億個(gè)/g ；(3)二級(jí)種子培殖，將與一級(jí)種子的培養(yǎng)基相同的二級(jí)種子培養(yǎng)基裝入IOOOml的三角瓶中，每個(gè)IOOOml的三角瓶裝入二級(jí)種子的培養(yǎng)基50g，一級(jí)種子按0. 4%的比例接入二級(jí)種子用培養(yǎng)基中，在^TC培養(yǎng)68h，得到二級(jí)種子，二級(jí)種子鏡檢孢子數(shù)不低于60億個(gè)/g ；B.飼用β -葡聚糖酶的制備(1)首先制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是由花生殼粉15g、麩皮70g、豆粕粉10 g、大麥粉 5g、(NH4) 2 SO4 2 g, MgSO4·7Η20 0. 5g、K2HPO4 1 g、NaNO3 lg、水 100ml 制成，其中，豆粕粉、大麥粉用部分水潤(rùn)濕池，無機(jī)鹽(NH4) 2 SO4, MgSO4-7H20, K2HPO4 g、NaNO3溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生殼粉、麩皮及已潤(rùn)濕的豆粕粉、大麥粉中，混合均勻后裝入滅菌鍋中，常壓滅菌1. ，成固體發(fā)酵培養(yǎng)基，備用；(2)冷卻接種，將滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至35°C，接入二級(jí)種子，接種比例為 0.4%，置入發(fā)酵床培養(yǎng)；(3)發(fā)酵床培養(yǎng)，室溫30°C，濕度90%，培養(yǎng)基料溫度36°C，發(fā)酵37h，成淡黃色或淺褐色的發(fā)酵物；(4)發(fā)酵物處理，首先在48°C下烘干，再粉碎，過0. 42mm孔徑篩，經(jīng)檢測(cè)合格后為成品， 分裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用花生殼粉固態(tài)發(fā)酵制備飼用β-葡聚糖酶的方法，可有效解決飼用β-葡聚糖酶的制備，以滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)的需要，其制備方法是A.菌種制備，方法是先菌種活化，再進(jìn)行一級(jí)種子培殖、二級(jí)種子培殖；B.制備培養(yǎng)基飼用β-葡聚糖酶，方法是先制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后冷卻接種，接入步驟A中擴(kuò)殖的二級(jí)種子，入發(fā)酵床培養(yǎng)，發(fā)酵，發(fā)酵物為淡黃色或淺褐色，有發(fā)酵物的天然風(fēng)味，再烘干，粉碎，分裝即可。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要為普通農(nóng)副產(chǎn)物花生殼粉、麩皮等；培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵周期大大縮短，只有37h；能產(chǎn)生飼用β-葡聚糖酶制劑；飼用β-葡聚糖酶酶活力高，耐熱性好，應(yīng)用效果好；采用微生物菌株黑曲霉菌進(jìn)行發(fā)酵，安全性高，不產(chǎn)生有害物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12R1/685GK102242091SQ20111010104
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者劉德海, 龐向宇, 王紅云, 胡宜亮, 陳國(guó)參 申請(qǐng)人:河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司