專利名稱：一種大豆myc類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在當(dāng)今的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蟲害是嚴(yán)重制約農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)高效的重要原因之一。蟲害不單單影響作物的生長發(fā)育，甚至在作物收獲存儲運輸過程當(dāng)中，都會遭遇到不同害蟲程度不同的傷害。大豆[Glycine max (L. )Merr.]作為一種重要的糧食及經(jīng)濟作物，多種害蟲能夠嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)防治方法就是使用化學(xué)藥劑農(nóng)藥或者施用生物方面的殺蟲劑，在殺死害蟲的同時也會對有益動物以及害蟲的天敵產(chǎn)生傷害嚴(yán)重時也會殺死它們，一定程度上對生態(tài)平衡造成了破壞，同時對人、畜禽等也會有毒害。目前，提高作物抗蟲性的重要方法之一是通過基因工程技術(shù)。研究表明茉莉酸能激活植物體內(nèi)與抗蟲相關(guān)的防御基因，使植物產(chǎn)生蛋白酶抑制劑、次生化合物以及釋放揮發(fā)物等(Ryan and Pearce，1998)。在茉莉酸信號途徑中MYC家族轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用(Boter M et al. ,2004 ；Liechti R et al.，2006)。轉(zhuǎn)錄因子 MYC 基因隨后在水稻、矮牽牛、金魚草、擬南芥等植物中克隆出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的另一目的是提供該大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因。本發(fā)明的又一目的是提供該大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。編碼所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl的基因GmMYCl。該基因的開放閱讀框具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。含有所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體優(yōu)選將SEQ ID NO. 1所示的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl 利用gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體pMDC83得到的植物過量表達(dá)載體pMDC83_GmMYCl。使用GmMYCl構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(⑶S基因、螢光素酶基因等)或抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等)的抗性基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。含有所述大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl的工程菌。所述的工程菌優(yōu)選將所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105所得。
擴增所述大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl的引物，正向引物序列為SEQ ID NO. 3，反向引物序列為SEQ ID NO. 4。所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。所述的大 豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。攜帶有本發(fā)明GmMYCl的植物表達(dá)載體可通過使用Ri質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、直接DNA轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、電導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是玉米、水稻、小麥等單子葉植物，也可以是煙草、大豆、苜蓿、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草等雙子葉植物。有益效果本發(fā)明首次從大豆基因組中克隆得到一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因 GmMYCl。并驗證了該基因的功能。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmMYCl基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。過量表達(dá)本發(fā)明GmMYCl基因的煙草與空載煙草相比，其抗蟲性顯著提高，說明GmMYCl基因在提高植物抗蟲性方面起著重要作用。本發(fā)明的GmMYCl對培育抗蟲農(nóng)作物，減少蟲害對農(nóng)作物產(chǎn)量的影響特別是對大豆產(chǎn)量的影響具有重要意義。


圖lpMDC83的質(zhì)粒圖譜。圖2含有GmMYCl的植物表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖。圖3轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定電泳圖。泳道1 =Marker ；泳道2 以H2O為模板(陰性對照)；泳道3 以轉(zhuǎn)入空載的煙草 DNA為模板；泳道4 以植物表達(dá)載體pMDC83-GmMYCl質(zhì)粒為模板(陽性對照)；泳道5_19 以各個轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板。圖4轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR鑒定電泳圖。圖5轉(zhuǎn)GmMYCl煙草株系與空載煙草的葉片分別飼喂斜紋夜蛾24小時相對生長率結(jié)果示意圖，*，P彡0. 05 ；**，P彡0. 01。圖6轉(zhuǎn)GmMYCl煙草株系與空載煙草的葉片分別飼喂斜紋夜蛾24小時前后斜紋夜蛾體態(tài)，A飼喂前的斜紋夜蛾，B飼喂轉(zhuǎn)基因煙草葉片喂養(yǎng)蟲子24小時之后的斜紋夜蛾，C 飼喂空載煙草葉片喂養(yǎng)蟲子24小時之后的斜紋夜蛾。圖7轉(zhuǎn)GmMYCl煙草株系與空載煙草的葉片分別飼喂斜紋夜蛾24小時后煙草葉片情況，A 轉(zhuǎn)入空載煙草葉片喂養(yǎng)蟲子24小時之后的葉面情況；B 轉(zhuǎn)基因煙草葉片喂養(yǎng)蟲子 24小時之后的葉面情況。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實施例和應(yīng)用實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 GmMYCl基因的克隆大 豆GmMYCl及其編碼基因GmMYCl的cDNA克隆與鑒定大豆(Glycine max(L.) Merr.)材料黃皮小青豆(juanjuan ffu, et al. Constitutive overexpression of AOS-Iike gene from soybean enhanced tolerance to insect attack in transgenic tobacco. Biotechnology letters，2008)，材料種植于網(wǎng)室，常規(guī)田間管理。根據(jù)擬南芥中已克隆的轉(zhuǎn)錄因子AtMYC2 (NM-102998. 3)序列和大豆EST數(shù)據(jù)庫， 利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，設(shè)計GmMYCl基因開放閱讀框(ORF)正向和反向引物，應(yīng)用RT-PCR方法，以大豆嫩葉的cDNA為模板進(jìn)行克隆GmMYCl的開放閱讀框，具體方法如下GmMYCl 基因 ORF 正向引物5 ‘-GTGCACTGAATGACCGAGTA-3，(SEQ ID N0. 3)GmMYCl 基因 ORF 反向引物5 ‘-CTACAGCTACAGAACGAACTATC-3，(SEQ ID N0. 4)；取黃皮小青豆嫩葉片，置于液氮中研碎，RNA提取依據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒 RNA Plant Extraction kit DP417 進(jìn)行。cDNA 第一鏈合成依據(jù) TaKaRa 試劑公司 cDNA 第一鏈合成試劑盒 TaKaR a PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具體詳見操作說明。以得到的cDNA片段為模板，用上述引物對進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。20μ1 PCR 反應(yīng)體系為0. 8μ IcDNA 第一鏈(0. 05μβ)、1.6μ 1 引物(SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4, 5μΜ)、2μ1 10XPCR 緩沖液、1· 6μ 1 Mg2\l. 6 μ 1 dNTP 和 0· 5U ExTaq DNA 聚合酶，用超純水補足20 μ 1。反應(yīng)在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，其程序為95°C變性5min ；再 940C 30sec,53°C 40sec,72°C 2min，共 30 個循環(huán)；然后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。PCR 產(chǎn)物回收后經(jīng)連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α、藍(lán)白斑篩選、搖菌、測序、序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物具有序列表中SEQID NO. 1的核苷酸序列，命名為GmMYCl。實施例2轉(zhuǎn)GmMYCl基因煙草的獲得禾I」M Invitrogen &司的 Gateway Technology with Clonase II i式齊[J i， GmMYCl正向插入到表達(dá)載體pMDC83(圖1)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化液涂布于含50mg/ L潮霉素+50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。經(jīng)測序驗證后，提取質(zhì)粒，得到pMDC83-GmMYCl植物過量表達(dá)載體(圖2)。用凍融法分別將pMDC83_GmMYCl和空載質(zhì)粒 PMDC83 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105 (Biovector Co. , LTD)中。pMDC83_GmMYCl 和 pMDC83 分別通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，提取轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA作為模板，以水為陰性對照，pMDC83-GmMYCl質(zhì)粒為陽性對照，分別用4對引物進(jìn)行PCR初步鑒定陽性轉(zhuǎn)基因煙草，方法如下A 設(shè)計目的基因內(nèi)部引物SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6進(jìn)行PCR擴增，10 μ 1 PCR 反應(yīng)體系為5yLmix，上、下游引物(5pmol)各1 μ L，模板2μ L(大約含0. 03yg)，加ddH20 1 μ L。其程序為 95°C變性 4min ；再 94°C 40sec，49. 7V 30sec, 72°C lmin,共 30 個循環(huán)；然后72°C延伸IOmin ;4°C保存。B 用 35S 上、下游引物 SEQ ID N0. 7 和 SEQ ID N0. 8 進(jìn)行 PCR 擴增，10 μ 1 PCR 反應(yīng)體系為5yLmix，引物(5pmol)各1 μ L，模板2 μ L (大約含0. 03 μ g)，加ddH20 1 μ L。其程序為 95°C變性 5min ；再 94°C 50sec,60°C 59sec，72°C 30sec，共 38 個循環(huán)；然后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。C 用 GFP 上、下游引物 SEQ ID N0. 9 和 SEQ ID NO. 10 進(jìn)行 PCR 擴增。10 μ 1 PCR反應(yīng)體系為5yLmix，上、下游引物(5pmol)各1 μ L，模板2μ L(大約含0. 03yg)，加ddH20 1 μ L。其程序為 95°C變性 5min ；再 94°C 20sec, 55°C 20sec, 72°C 30sec，共 33 個循環(huán)；然后 72°C 延伸 IOmin ；4°C 保存。 D 用35S上游引物SEQ ID NO. 7和目的基因下游引物SEQ ID NO. 6進(jìn)行PCR擴增。 10 μ 1 PCR反應(yīng)體系為:5μ Lmix，35S上游引物SEQ ID NO. 7(5pmol)和目的基因下游引物 SEQ ID NO. 6(5pmol)各 1 μ L，模板 2 μ L (大約含 0· 03 μ g)，加 ddH201 μ L。其程序為 95°C變性 4min ；再 94°C 40sec，54. 3°C 30sec，72°C lmin，共 34 個循環(huán)；然后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。上述PCR鑒定結(jié)果見圖3，經(jīng)PCR鑒定呈陽性的轉(zhuǎn)基因苗隨意挑取5株提取RNA， 反轉(zhuǎn)進(jìn)行RT-PCR，用目的基因內(nèi)部引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID N0. 6進(jìn)一步鑒定，結(jié)果見圖4。實施例3 GmMYCl基因的功能驗證用陽性轉(zhuǎn)GmMYCl基因煙草株系和轉(zhuǎn)pMDC83的空載煙草的葉片同時飼喂斜紋夜蛾 (購于江蘇省農(nóng)科院)，將不同轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片和轉(zhuǎn)空載的煙草葉片分別放在各個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放5頭蟲子，喂養(yǎng)前稱下5頭蟲子的總重量為Wl，24小時之后，再稱下 5頭蟲子的重量為W2.計算蟲子的相對生長率RGR = (W2-W1)/W1，結(jié)果見圖5。轉(zhuǎn)GmMYCl 煙草株系與空載煙草的葉片分別飼喂斜紋夜蛾24小時前后斜紋夜蛾體態(tài)見圖6，轉(zhuǎn)GmMYCl 煙草株系與空載煙草的葉片同時飼喂斜紋夜蛾24小時后葉片情況見圖7。結(jié)果可見用轉(zhuǎn)基因煙草葉片飼養(yǎng)的斜紋夜蛾生長率顯著低于用空載煙草葉片飼養(yǎng)斜紋夜蛾生長率，說明轉(zhuǎn)基因株系與空載煙草相比抗蟲性顯著提高，過量表達(dá)GmMYCl基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲性。
權(quán)利要求
1.一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl的基因GmMYCl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl的基因GmMYCl，其特征在于該基因具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因GmMYCl的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有基因GmMYCl的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是將SEQ ID NO. 1所示的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl利用gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體PMDC83得到的植物過量表達(dá)載體pMDC83-GmMYCl。
6.含有權(quán)利要求2或3所述大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl編碼基因GmMYCl的工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述的工程菌是將所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105所得。
8.擴增權(quán)利要求3所述基因的引物，其特征在于正向引物序列為SEQID N0.3，反向引物序列為SEQ ID NO. 4。
9.權(quán)利要求1所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYCl在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或3所述的大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因GmMYCl在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子GmMYC1，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。該基因的開放閱讀框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。本發(fā)明首次從大豆基因組中克隆得到一種大豆MYC類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因GmMYC1。并驗證了該基因的功能。利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的GmMYC1基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。過量表達(dá)本發(fā)明GmMYC1基因的煙草與空載煙草相比，其抗蟲性顯著提高，說明GmMYC1基因在提高植物抗蟲性方面起著重要作用。
文檔編號C12R1/01GK102219838SQ20111010136
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者丁長文, 喻德躍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)