專利名稱：：新的磷脂酶及其用途的制作方法新的磷脂酶及其用途本申請是根據(jù)2003年5月21日提交的申請?zhí)枮?3813517.5的分案申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸序列，它包含分離自黑曲霉(Aspergi1lusniger)的新磷脂酶的編碼基因。本發(fā)明以新基因的全長核苷酸序列、包含新磷脂酶全長編碼序列的cDNA序列及功能蛋白質(zhì)和它的功能等價物的全長氨基酸序列為特征.本發(fā)明也涉及這些酶在工業(yè)流程中的使用方法和診斷真菌感染的方法。本發(fā)明還包括用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞和經(jīng)遺傳修飾后增加或降低本發(fā)明磷脂酶活力和/或表達水平的細胞。
背景技術(shù)：
：磷脂由甘油骨架組成，該甘油骨架具有兩條分別位于外部(sn-l)和中間(sn-2)位置的酯化脂肪酸，而甘油的第三個羥基被磷酸酯化。磷酸可以依次例如與氨基醇酯化，如與乙醇胺酯化形成磷脂酯乙醇胺，與膽堿酯化形成磷脂酰膽堿。除了與磷酸酯化，第三個羥基也可以與糖殘基結(jié)合，如半乳糖或它的二聚體(如雙半乳糖甘油二酯)。這里定義的磷脂酶是指參與磷脂(包括以上描述的雙半乳糖甘油二酯)中的一個或多個鍵的水解的酶。一些水解連接脂肪酰部分和甘油骨架之間的酯鍵的磷脂酶活力類型可以被區(qū)分。o磷脂酶A"EC3.1.1.32)和A2(EC3.1.1.4)分別催化從二酰甘油磷脂sn-l和sn-2位置脫去脂肪酰基，產(chǎn)生溶血磷脂。o溶血磷脂酶(EC3.1.1.5,也被生物化學與分子生物學國際聯(lián)合命名委員會命名為磷月旨酶B(EnzymeNomenclature,AcademicPress,NewYork,1992))o催化溶血磷脂中剩余脂肪?；乃?。已報道的一種來自點青霉(Penicilliumnotatum)的磷月旨酶B(Saito等人，1991，MethodsinEnzymology197:446-456)從二酰甘油磷脂上催化兩個脂肪酸的脫酰，本質(zhì)上具有溶血磷脂酶的活力。o半乳糖脂酶(galactolipase)(EC3.1.4.3)從雙半乳糖甘油二酯上分別催化位于sn-1和sn-2位置的一個或兩個脂肪酰基的水解。磷脂酶C(EC3.1.4.3)水解甘油骨架和磷酸基之間的磷酸酯鍵，例如磷脂酰膽堿+H20=1，2二酰甘油+磷酸膽堿。磷脂酶D(EC3.1.4.4)水解磷酸基和氨基醇之間的磷酸酯鍵，如磷脂酰膽堿+H20=膽堿+礴酸。磷脂酶可以方便的在微生物中生產(chǎn)?？梢詮母鞣N資源獲得微生物磷脂酶；芽孢桿菌是細菌酶的通常資源，而真菌酶通常產(chǎn)生自曲霉。已從各種資源中報道了具有磷脂酶活力的真菌酶，包括Cryptococcusneoformans(Chen等人，1997，InfectionandImmunity65:405-411)，壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)(Fifis等人，1996，VeterinaryMicrobiology49:219-233)，點青霉(也稱為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum);Kawasaki,1975，JournalofBiochemistry77:1233-1244;Masuda等人，1991，EuropeanJournalofBiochemistry202:783-787)，圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)(Mustranta等人，1995,ProcessBiochemistry30:393-401)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(Ichimasa等人1985，Agric.Biol.Chem.49:1083-1089;Paultauf等人，1994，J.Biol.Chem.269:19725-19730)，戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)(原名羅茜糖酵母(Saccharomycesrosei)，K畫bara，1988，Agric.Biol.Chem.52:2451-2458;Watanabe等人，1994,REMSMicrobiologicalLetters124:29-34)，粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(Chakravarti等人，1981，ArchivesofBiochemistryandBiophysics206:393-402)，黑曲霉(Aspergi1lusniger)(TechnicalBulletin,G-zymeTMG6999,EnzymeBio-SystemsLtd.;Mustranta等人，1995，同上)，離心伏革菌(Corticiumcentrifugum)(Uehara等人，1979，Agric.Biol.Chem.43:517-525)，尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)(WO98/26057)，和癡病鐮孢(Fusariumsolani)(Tsung-Che等人，1968,PhytopathologicalNotes58:1437-38).已從若干資源中克隆了真菌磷脂酶基因，包括點青霉(Masuda等人，1991，同上)，戴爾凱氏有孢圓酵母(Watanabe等人，1994，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters124:29-34)，啤酒糖酵母(Lee等人，1994,JournalofBiologicalChemistry269:19725-19730)，曲霉(JP10155493)，粗糙鏈孢霉(EMBL042791),和栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)(EMBL013857)。磷脂酶在工業(yè)中有多種應用，包括修飾磷脂乳化劑。磷脂乳化劑的一個例子是卵磷脂，它是極性和中性脂質(zhì)的混合物，其中極性脂質(zhì)含量不低于60%。磷脂乳化劑在食品和非食品中具有多種應用，例如雞蛋卵磷脂被用作例如奶制品(特別是蛋黃醬、敷料劑、面餅等)的乳化劑，大豆卵磷脂被用作(低熱量)沙司、面包、人造黃油、化妝品等的乳化劑，其它卵磷脂被用于例如巧克力、小牛飼料。磷脂酶對磷脂乳化劑的修飾可以增加油/水混合物的乳化。磷脂酶對磷脂乳化劑的修飾增加了乳狀液的穩(wěn)定性，這是通過添加適于更寬或不同pH和/或溫度范圍的修飾的磷脂乳化劑而實現(xiàn)的。鱗脂酶對磷脂乳化劑的修飾可增加乳狀液的穩(wěn)定性，這是通過在Ca"或Mg"存在的情況下添加修^飾的磷脂乳化劑而實現(xiàn)的。磷脂酶在工業(yè)應用的另一個例子是它可以被用于在加工植物油過程中的對植物油的脫膠。在典型的脫膠過程中，通過用水洗滌油相，植物油(如大豆油、菜子(油菜)油、亞麻子油、向日葵油)中的卵磷脂被除去以增加植物油的穩(wěn)定性，其中在高剪切力條件下混合油水迫使大量的卵磷脂進入水相，隨后再在分離器中被除去。在所謂的水脫膠相中，只有能迅速水合的磷脂才易于被除去，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺。不可水合的磷脂/phosphatide，多數(shù)是磷脂，由50%鎂鹽和/或鈣鹽組成，它們不易在水脫膠步驟中被除去。將不可水合的磷脂/phosphatide暴露于磷脂酶&使這些磷脂更易溶6于水，因此易于進入水脫膠相。磷脂酶在工業(yè)應用的另一個例子是它們被用于除去在糖化面筋或小麥淀粉(在a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的幫助下)以產(chǎn)生葡萄糖漿的過程中產(chǎn)生的沉淀。沉淀的去除能夠有效的加速產(chǎn)生的葡萄糖漿的隨后過濾。以上提到的磷脂酶的工業(yè)應用只是一些例子，這些列舉并不意味著限制。而磷脂酶在食品工業(yè)應用的另一例子是磷脂酶在烘焙應用中對于提高生面團或烘焙產(chǎn)品質(zhì)量特別有用。小麥面粉含有約2.2-2.9%的脂質(zhì)。面粉脂質(zhì)可以被分成淀粉脂質(zhì)(0.8-0.9%)和非淀粉脂質(zhì)(1.4-2.0%)。而淀粉脂質(zhì)主要由極性溶血磷脂組成，非淀粉脂質(zhì)由約40%的中性甘油三脂和40%的極性磷脂和糖脂組成。為了優(yōu)化面粉脂質(zhì)部分，可以通過加入磷脂酶A，原位水解生面團中的磷脂。例如EP-A-109244和W098/26057描述在制作面包中4吏用磷脂酶A。在捷克斯洛伐克專利A0190264中磷脂酸(磷脂酶D的水解產(chǎn)物)被用作生面團和面包改進劑。在EP-A-075463中磷脂酶A和D被聯(lián)合應用以產(chǎn)生作為生面團調(diào)節(jié)劑的溶血磷脂酸。W000/32758描述了通過改變脂質(zhì)分解酶(lipolyticenzyme)的氨基酸序列從而產(chǎn)生脂質(zhì)分解酶變異體，以提高目的活力的水平。發(fā)現(xiàn)來自Humicula科或Zygomycete科的脂質(zhì)分解酶變體在烘焙應用上特別有用，因為它具有磷脂酶和/或雙半乳糖甘油二酯活力。W098/45453描述了一來自塔賓曲霉(Aspergillustubigensis)的具有脂肪酶活力的多肽也表現(xiàn)出很高的水解雙半乳糖甘油二酯的活力。然而這些酶具有較低的活性專一性。在上述方法中，使用來自重組DM技術(shù)的磷酸酶是有利的。與它們傳統(tǒng)純化的對應物相比，這些酶具有一些優(yōu)勢。重組酶可以低的成本、高的得率生產(chǎn)，并免除了細菌或病毒之類的污染劑，也免除了細菌毒素或其它酶活力污染。本發(fā)明解決了至少一種(如果不是全部的話)上述難題。本發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供編碼具有改進特性的新磷脂酶的新多核苷酸序列。進一步的目的是提供天然和重組產(chǎn)生的磷脂酶，以及產(chǎn)生它們的重組菌林。融合多肽以及制造和使用本發(fā)明多核普酸和多肽的方法也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的一特別的目的是提供同時具有半乳糖脂酶活力的磷脂酶。本發(fā)明還有的目的是提供至少解決一項上述提及難題的新磷脂酶，或提供具有一項或多項改進特性的新磷脂酶(如果是用于生面團和/或烘焙產(chǎn)品)，或具有較寬底物特異性的新磷脂酶，其中所述改進的特性選自增加生面團的強度、彈性、穩(wěn)定性、降低粘性、提高延展性、可加工性、增加烘焙產(chǎn)品的體積、改善烘焙產(chǎn)品的面包心結(jié)構(gòu)、增加烘焙產(chǎn)品的柔軟性、改善烘焙產(chǎn)品的滋味、改善烘焙產(chǎn)品的抗陳腐能力、改善烘焙產(chǎn)品的顏色、改善烘焙產(chǎn)品的外皮。發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼新磷脂酶的新多核苷酸序列。更特別的是本發(fā)明提供其核苷酸序列與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列雜交的多核苷酸，優(yōu)選的是在高度嚴緊的條件下雜交的多核苷酸。因此本發(fā)明提供與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的一條或多條序列同源性高于40%的核酸，如同源性為約60%，優(yōu)選的為65%，更優(yōu)選的為70%，甚至為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98線99%。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供來自絲狀真菌的分離的多核苷酸，特別優(yōu)選的是來自黑曲霉。在一實施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸，它含有的核酸序列編碼具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15或其功能等價物的氨基酸序列的多肽。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苦酸，它至少編碼具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15或其功能等價物的氨基酸序列的多肽的一個功能結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供具有選自SEQIDNO:1、4、7、10和13的核苷酸序列的磷脂酶基因。在另一方面本發(fā)明提供多核苷酸，優(yōu)選的是編碼其氨基酸序列選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的黑曲霉磷脂酶或此多肽的變異體或片段的cDNA。在優(yōu)選的實施方案中該cDNA具有選自SEQIDNO:2、5、8、11和14或其功能等價物的序列。甚至在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明多肽編碼序列的多核苷酸，優(yōu)選的為選自SEQIDNO:2、5、8、11和14的多核苷酸序列。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明多核苷酸序列的載體和可以被用來擴增或檢測本發(fā)明DNA的引物、探針和片段。在進一步優(yōu)選的實施方案中，提供栽體，其中本發(fā)明多核苦酸與適合在合適的宿主細胞(如黑曲霉或米曲霉(A.oryzea))中表達編碼的氨基酸序列的調(diào)控序列進行了功能性連接。本發(fā)明也提供制備本發(fā)明多核苷酸和栽體的方法。本發(fā)明也涉及重組產(chǎn)生的含有本發(fā)明異源或同源多核苷酸的宿主細胞。在一實施方案中，本發(fā)明提供重組宿主細胞，其中本發(fā)明磷脂酶的表達被顯著增加或磷脂酶的活力被顯著提高。在另一實施方案中本發(fā)明提供含有本發(fā)明異源或同源多核苷酸的重組產(chǎn)生的宿主細胞，此細胞能產(chǎn)生本發(fā)明的功能性磷脂酶，優(yōu)選的是能過表達本發(fā)明磷脂酶的細胞，例如含有增加的拷貝數(shù)的本發(fā)明基因或cDNA的曲霉菌林。而本發(fā)明的另一方面提供純化的多肽。本發(fā)明的多肽包括由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽。特別優(yōu)選的是具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15或其功能等價物的氨基酸序列的多肽。含有本發(fā)明多肽的融合蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明也提供制造本發(fā)明多肽的方法。本發(fā)明也涉及本發(fā)明磷脂酶在這里所描述的任何工業(yè)程序中的使用。發(fā)明詳述多核苷酸本發(fā)明提供編碼磷脂酶的多核苷酸，這些磷脂酶具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15或其功能等價序列的氨基酸序列。對來自黑曲霉的相應基因組克隆進行測序而確定了分別編碼磷脂酶PLP03、PLP06、PLP15、PLP26和PLP34的5個基因。本發(fā)明提供包含分別編碼PLP03和PLP06和PLP15和PLP26和PLP34磷脂酶的基因的多核普酸序列以及它們的完整cDM序列和它們的編碼序列。因此，本發(fā)明涉及分離的多核普酸，這些多核苷酸包含選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等價物的核苷酸序列。更特別的是，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，此多核普酸可與包含選自SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等價物的核苷酸序列的多核苷酸在嚴謹條件下(優(yōu)選的為在高度嚴謹條件下)雜交。有利的是這類多核苷酸可以從絲狀真菌(特別是從黑曲霉)中獲得。更特別的是，本發(fā)明涉及具有選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列的分離的多核苷酸。本發(fā)明也涉及分離的多核苷酸，該多核苦酸至少編碼具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15或功能等價物的氨基酸序列的多肽的一個功能結(jié)構(gòu)域。這里使用的術(shù)語"基因"和"重組基因"是指可從染色體DNA中分離的、包含編碼蛋白質(zhì)(如黑曲霉磷脂酶)的開放閱讀框的核酸分子。基因可能包括編碼序列、非編碼序列、內(nèi)舍子和調(diào)控序列。此外，基因還指如這里所定義的分離的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子，如具有選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等價物的核苷酸序列的核酸分子，可以使用標準的分子生物學技術(shù)和此處提供的序列信息而分離。例如，使用選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的全長或部分作為雜交探針，可以使用標準的雜交和克隆技術(shù)(如Sambrook,J.，F(xiàn)ritsh,E.F.和Maniatis，T.在MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989所描述的)分離本發(fā)明核酸分子，此外，使用基于SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14所含的序列信息設計的合成寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)可以分離包含選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的全長或部分的核酸分子。本發(fā)明核酸可以通過使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，適當?shù)墓押塑账嶙鳛橐?，按照標準PCR技術(shù)進行擴增。如此擴增的核酸可以被克隆到載體，并通過DNA序列分析了解其特征。此外，可以使用標準的合成技術(shù)(如使用自動DM合成儀)制備相應于本發(fā)明核苷酸序列或可與其雜交的寡核苷酸。在一優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子含有表示于SEQIDNO:2的核苷酸序列。SEQIDNO:2序列相應于提供于SEQIDNO:1的黑曲霉PLP03磷脂酶基因的編碼區(qū)。這一cDNA包含編碼SEQIDNO:3的黑曲霉PLP03多肽的序列。在第二個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子含有表示于SEQIDNO:5的核苷酸序列。SEQIDNO:5序列相應于提供于SEQIDNO:4的黑曲霉PLP06磷脂酶基因的編碼區(qū)。這一cDNA包含編碼SEQIDNO:6的黑曲霉PLP06多肽的序列。在第三個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子含有表示于SEQIDNO:8的核苷酸序列。SEQIDNO:8序列相應于提供于SEQIDNO:7的黑曲霉PLP15磷脂酶基因的編碼區(qū)。這一cDNA包含編碼SEQIDNO:9的黑曲霉PLP15多肽的序列。在第四個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子含有表示于SEQIDNO:ll的核苷酸序列。SEQIDNO:11序列相應于提供于SEQIDNO:10的黑曲霉PLP26磷脂酶基因的編碼區(qū)。這一cDNA包含編碼SEQIDNO:12的黑曲霉PLP26多肽的序列。在第五個優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子含有表示于SEQIDNO:14的核香酸序列。SEQIDNO:14序列相應于提供于SEQIDNO:13的黑曲霉PLP34磷脂酶基因的編碼區(qū)。這一cDNA包含編碼SEQIDNO:15的黑曲霉PLP34多肽的序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，分離的本發(fā)明核酸分子包含與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或它們的功能等價物的核苷酸序列互補的核酸分子。與另外的核苷酸序列互補的核酸分子是能夠與其它核苷酸序列充分互補以至于能與其它核苷酸序列雜交形成穩(wěn)定的雙體的分子。本發(fā)明的一個方面涉及編碼本發(fā)明多肽或它的功能等價物(如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域)的核酸分子，以及足以用作探針以鑒定編碼本發(fā)明多肽的核酸分子的核酸分子，和適合用作擴增或突變核酸分子的PCR引物的這類核酸分子的片段。"分離的多核苷酸"或"分離的核酸"是DNA或RNA，它們不與在它們所源自的生物體天然基因組中直接毗鄰的兩編碼序列(一個在5，端，一個在3，端)直接毗鄰。因此，在一實施方案中，分離的核酸包括直接毗鄰編碼序列的部分或全部5，端非編碼序列(如啟動子)。因此，此術(shù)語包括重組DNA，例如整合入載體、自主復制質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA，或整合入原核或真核基因組DNA的重組DNA，或以獨立于其它序列的獨立分子(如cDNA或通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段)存在的重組DNA。也包括編碼完全不含細胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)、培養(yǎng)基(當通過重組DM技術(shù)生產(chǎn)時)或化學前體或其它化學物品(當化學合成時)的額外多肽的雜合基因之一部分的重組DNA。此外，"分離的核酸片段"并不是作為片段而自然產(chǎn)生并在自然狀態(tài)下不可能被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。這里使用的術(shù)語"多核苷酸"或"核酸分子，，包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(如mRNA)和用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但是優(yōu)選的是雙鏈DNA。可以使用寡核苷酸類似物或衍生物(如肌苷或硫代磷酸核苷酸)12合成核酸。這類衍生物可以被用來例如制備具有改變的堿基配對能力的核酸或增加對核酸酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明另一實施方案提供與本發(fā)明核酸分子反義的分離的核酸分子。在本發(fā)明的范圍也包括這里描述的核酸分子的互補鏈。測序錯誤這里提供的序列信息不應該被狹義的理解為需要包含錯誤鑒定的堿基。這里公開的特定序列易于用來從絲狀真菌(特別是黑曲霉)中分離完整基因，該完整基因也容易被進一步進行序列分析，由此鑒定測序錯誤。除非另有說明，這里所有通過對DNA分子測序而測定的核苷酸序列都是通過使用DNA序列自動測定儀來測定，這里對所有DNA分子編碼的多肽氨基酸序列的確定都是通過對如上測定的DM序列的翻譯來預測。因此，如本領(lǐng)域已知的關(guān)于任何由這種自動方法測定的DM序列，這里所測定的任何核苷酸序列可能含有一定的錯誤。通過自動測定的核酸序列與所測序DNA分子的真實核苷酸序列一般至少具有90o/。的一致性，更一般的則至少具有約95%到99%的一致性。通過包括本領(lǐng)域熟知的手工DM測序法在內(nèi)的其它方法可以更精確的測定真實的序列。也如本領(lǐng)域所知，測定的核苷酸序列相對于真實序列的一個插入或缺失會導致核苷酸序列的翻譯框架移位，以至于預測的被所測定核苷酸序列編碼的氨基酸序列從此插入或缺失的點開始完全不同于由被測序DNA分子事實上所編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠鑒定這類錯誤測定的堿基，并知道如何糾正這類錯誤。核酸片段、探針和引物本發(fā)明核酸分子可能包含選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的部分或片段，如可能被用作引物或探針的片段或編碼部分本發(fā)明蛋白質(zhì)的片段。從磷脂酶基因和cDNA克隆測定的核苷酸序列允許產(chǎn)生設計用來鑒定和/或克隆其它磷脂酶家族成員以及其它物種的磷脂酶同源物的探針和引物。典型的探針/引物包含基本純化的寡核苦酸，通常這種寡核苷酸含有能與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等價物的核苷酸序列中至少約12或15個連續(xù)的核苷酸雜交(優(yōu)選為在嚴謹條件下雜交)的核苦酸序列，優(yōu)選的與約18或20，優(yōu)選的約22或25，更優(yōu)選的約30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多的連續(xù)核苷酸雜交。為mRNA)或編碼相同或同源蛋白質(zhì)的基因組序列，例如在其它生物中。在優(yōu)選的實施方案中，探針進一步包含附于其上的標記基團，如標記基團可能是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。這類探針也可以被用作鑒定表達磷脂酶的細胞的診斷試劑盒的一部分。一致性&同源性術(shù)語"同源性"或"一致性百分數(shù)"在這里可互換使用。為了本發(fā)明的目的，這里定義為了確定兩氨基酸序列或兩核酸序列的一致性百分數(shù)，序列以最有利于比較的目的被排列(如可以在第一條氨基酸或核酸序列中引入缺口以達到與另一條氨基酸或核酸序列的最佳比對)。由此比較位于相應氨基酸位點或核苷酸位點的氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝粭l序列的位點與第二條序列的相應位點被同樣的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，那么兩分子在這一位置具有一致性。兩序列的一致性百分數(shù)是該序列所共有的一致性位點數(shù)目的函數(shù)(即％—致性-一致性位點數(shù)/位點總數(shù)(即相重疊的位點)x100)。優(yōu)選的是，兩序列具有相同的長度。技術(shù)人員知道一些不同的計算機程序可以被用來測定兩序列的同源性。例如，使用數(shù)學算法可以完成兩序列的序列比較和一致性百分數(shù)測定。在一優(yōu)選的實施方案中，使用在GCG軟件包(可從http:〃www.gcg.com獲得)中已被整合進GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法,使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口加4又和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)測定兩氨基酸序列的一致性百分數(shù)。技術(shù)人員將領(lǐng)略到當使用不同的算法時，所有這些不同的參數(shù)將產(chǎn)生輕微不同的結(jié)果，但是兩序列的整體一致性百分數(shù)不會有顯著改變。而在另一實施方案中，使用GCG軟件包(可從http:〃www.gcg.com獲得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的缺口加權(quán)和1、2、3、4、5或6的長度加權(quán)測定兩核苷酸序列的一致性百分數(shù)。在另一實施方案中，使用被整合到ALIGN程序(2.0版)(可從http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)的E.Meyers和W.Mi1ler算法(CABIOS，4:11-17(1989)，并使用PAM120加權(quán)殘基表，12的缺口長度罰分和4的缺口罰分測定兩氨基酸或核苷酸序列的一致性百分數(shù)。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以被進一步用作"查詢序列"以對公共數(shù)據(jù)庫進行搜尋，例如鑒定其它家族的成員或相關(guān)序列?？墒褂肁ltschul等人(1990)(J.Mol.Biol.215:403-10)的BLASTN和BLASTX程序完成這些搜尋?？墒褂肂LASTN程序，分數(shù)=100、字長=12完成BLAST核苷酸搜尋，以獲得與本發(fā)明PLP03核酸分子同源的核苷酸序列?？墒褂肂LASTX程序，分數(shù)=50，字長=3完成BLAST蛋白質(zhì)搜尋，以獲得與本發(fā)明PLP03蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列?？墒褂萌鏏ltschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402描述的帶缺口BLAST,以獲得為了比較目的的缺口比對。當使用BLAST和帶缺口BLAST程序時，可使用各自程序(如BLASTX和BLASTN)的默認參數(shù)。見http:〃www.ncbi.nim.nih.gov.雜交如這里所使用的，術(shù)語"雜交"傾向于描述彼此至少具有約50%、至少約60%、至少約70%，更優(yōu)選的是至少約80%,甚至更優(yōu)選的是至少約85-90%,更優(yōu)選的是至少95%同源性的核酸序列保持彼此雜交的雜交和洗滌條件。這種雜交條件的一個優(yōu)選的非限制性的例子是于約45'C在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后于50'C、優(yōu)選的為55'C、60。C，甚至更優(yōu)選的為65。C,在lxSSC、0.1%SDS中洗滌一次或多次。高度嚴謹條件包括，例如在68r、5xSSC/5xDenhardt's溶液/1.0%SDS中雜交，并于室溫下在0.2xSSC/0.1%SDS中洗滌?？闪磉x的是，可以在42'C完成洗滌。技術(shù)人員知道使用哪種條件作為嚴謹條件和高度嚴謹條件。本領(lǐng)域易于獲得關(guān)于這些條件的附加指導，例如Sambrook等人，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;和Ausubel等人(eds,)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。當然，僅與多聚腺苷酸序列(如mRNA的3，端多聚腺苷酸片段)或T(或U)殘基的互補片段雜交的多核苷酸，將不會被包含在用于與本發(fā)明核酸的一部分進行特異雜交的本發(fā)明多核普酸中，因為這種多核苷酸將與含有多聚腺苷酸片段或它的互補序列的任何核酸分子(如事實上任何的雙鏈cDNA克隆)雜交。從其它生物體中獲得全長DM分子在一典型的方法中，可以篩選構(gòu)建自其它生物的cDM文庫，如絲狀真菌，特別是曲霉菌。例如可以通過Northern印跡分析篩選曲霉菌林的同源多核苷酸?；趯Ρ景l(fā)明多核苷酸的同源轉(zhuǎn)錄物的檢測，可以利用本領(lǐng)域^t術(shù)人員所熟知的標準技術(shù)，以適當菌林中分離的RNA構(gòu)建cDNA文庫?？闪磉x的是，使用與本發(fā)明多核普酸雜交的探針篩選總基因組DM文庫。如通過使用基于這里提供的核苷酸序列所設計的兩個簡并寡核苦酸引物工具來進行PCR，可以分離同源基因。反應的模板可以是對已知或懷疑表達本發(fā)明多核苷酸的菌林中制備的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA。PCR產(chǎn)物可以被亞克隆并#_測序，以確保擴增序列代表新的PLP03核酸序列，或它的功能等價物。然后，PCR片段可以通過各種已知的方法被用來分離全長cDNA克隆。例如，擴增的片段可以被標記并用來篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。16另選的是，標記的片段可以被用來篩選基因組文庫。PCR技術(shù)也可以被用來從其它生物體中分離全長cDNA序列。例如，按照標準操作可以從適當?shù)募毎蚪M織資源中分離RNA。使用專一于多數(shù)擴增片段的5，端的寡核苷酸引物，完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應以引導第一條鏈合成。產(chǎn)生的RNA/DNA雜合體可以通過標準末端轉(zhuǎn)移酶反應被加上"尾"(如使用鳥嘌呤)，可使RNaseH消化雜合體，并隨后引導第二條鏈的合成(如使用多聚胞嗜啶引物)。因此擴增片段上游的cDNA序列可以容易的被分離。對于有用的克隆戰(zhàn)略，見例如Sambrook等人(前述)和Ausubel等人(前述)。載體本發(fā)明的另一方面涉及載體，優(yōu)選的為表達載體，其包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或它的功能等價物的核酸。如這里所使用的，術(shù)語"載體"指能夠運送已與之連接的其它核酸的核酸分子。一種載體是"質(zhì)粒"，它指能夠連接進額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體，其中額外的DM片段能夠被連接進病毒基因組。一些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主復制(如具有細菌復制起點的細菌載體和游離的哺乳動物載體)。其它栽體(如非游離哺乳動物栽體)在引入宿主細胞后整合到宿主細胞的基因組上，因此隨宿主基因組復制。此外，有些栽體能指導與它們有效連接的基因的表達。這里涉及的這類載體稱為"表達載體"。通常，在重組DM技術(shù)中使用的表達載體常常是質(zhì)粒的形式。因為質(zhì)粒是最常使用的載體形式，因此這里使用的術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"可以被互換使用。然而本發(fā)明趨向包括其它形式的具有相同功能的表達載體，如病毒載體(如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。本發(fā)明重組表達載體含有以適合在宿主細胞中表達核酸的形式存在的本發(fā)明核酸，這意味著重組表達載體含有一種或多種基于用來表達的宿主細胞而選擇的調(diào)控序列，它們與要被表達的核酸序列有效的連接起來。在重組表達載體中"有效的連接"趨向于指目的序列以允系統(tǒng)中或當載體被引入宿主細胞后的宿主細胞中)。術(shù)語"調(diào)控序列"傾向于包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(如多聚腺苷酸信號)。這類調(diào)控序歹寸的描述見例^口Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)。調(diào)控序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列組成性或可誘導表達的序列，以及只在特定的宿主細胞中指導核普酸序列表達的序列(如組織專一性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將領(lǐng)略到表達載體的設計依賴于被轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需的目的蛋白質(zhì)的表達等之類的因素。本發(fā)明表達載體可以被引入宿主細胞，由此產(chǎn)生由這里描迷的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽(如磷脂酶、突變磷脂酶、它們的片段、它們的變異體或功能等價物、融合蛋白質(zhì)等等)。本發(fā)明重組表達載體可以被設計來在原核或真核細胞中表達磷脂酶。例如，本發(fā)明蛋白質(zhì)可以在細菌(如大腸桿菌和芽孢桿菌)、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳細胞中被表達。在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中進一步討論了合適的宿主細胞。另選的是，可在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯重組表達載體，例如使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。對本發(fā)明有用的表達載體包括染色體載體、游離載體和病毒來源的栽體，如來自細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母游離基因、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳突病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，以及來自其組合的載體，例如來自質(zhì)粒和噬菌體基因元件的載體(如粘粒和噬粒)。插入的DNA應該與適當?shù)膯幼佑行нB接，例如lambda嗟菌體PL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和LTRs逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它合適的啟動子。在一特定的實施方案中，優(yōu)選的啟動子能夠在絲狀真菌中指導磷脂酶的高水平表達。在本領(lǐng)域中已知這類啟動子。表達構(gòu)件體可以含有轉(zhuǎn)錄起始點、終止點，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)具有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。構(gòu)件體表達的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分將包括開始的轉(zhuǎn)錄起始點AUG和位于將被翻譯的多肽末端恰當位置的終止密碼子。如這里所使用-的術(shù)語"轉(zhuǎn)化:，和-轉(zhuǎn)""用于指各種將^源核^(如DNA)導入宿主細胞的本領(lǐng)域已知技術(shù)，包括磷酸鉀和氯化鉀共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介導的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染或電穿孔。適當?shù)霓D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法可見Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd，ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)，Davis等人，BasicMethodsinMolecularBiology(1986)和其它實驗室手冊。已知對于哺乳細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，只有小部分的細胞可以將外源DM整合到它們的基因組(依賴于使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù))。為了鑒定和篩選這些整合體，編碼選擇性標記(如抗生素抗性)的基因通常與目的基因被一起引入宿主細胞。優(yōu)選的選擇性標記包括賦于抗藥性的那些，如G418、潮霉素、methatrexate。優(yōu)選的，被引入宿主細胞的編碼選擇性標記的核酸與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸位于同一載體，或者可以在一獨立的載體上被引入。被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以通過藥物篩選來鑒定(如已經(jīng)整合入選擇性標記基因的細胞將存活，而其它細胞將死亡)。蛋白質(zhì)在原核細胞中的表達常常在大腸桿菌中進行，利用含有組成性或可誘導啟動子的載體指導融合或非融合蛋白質(zhì)的表達。融合載體對所攜帶編碼的蛋白質(zhì)(如重組蛋白質(zhì)的氨基末端)增加若干氨基酸。這類融合載體主要服務于三個目的1)增加重組蛋白質(zhì)的表達；2)增加重組蛋白質(zhì)的可溶性；3)通過作為親和純化中的配體幫助純化重組蛋白質(zhì)。在融合表達載體中，通常在融合部分與重組蛋白質(zhì)的連接處引入蛋白水解切割位點，使純化融合蛋白之后重組蛋白質(zhì)與融合蛋白質(zhì)能夠分離。這些酶(以及它們的相關(guān)識別位點)包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。如所指出的，優(yōu)選的表達栽體含有選擇性標記。這類標記包括用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性和用于大腸桿菌和其它細菌培養(yǎng)的四環(huán)素或氨卡青霉素抗性。適當宿主的代表性例子包括細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium);真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾Sf9;動物細胞，如CH0、C0S和Bowes黑色素瘤；及植物細胞。本領(lǐng)域已知上述宿主細胞的適當培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。優(yōu)選的用于細菌的栽體有pQE70、pQE60和PQE-9(可從QUgen獲得);pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(可從Stratagene獲得);和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(可從Pharmacia獲得)。優(yōu)選的用于真核細胞的載體有PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZTl和pSG(可從Stratagene獲得)；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(可從Pharmacia獲得)。對于技術(shù)人員而言獲知其它合適的載體是很容易的。已知的用于本發(fā)明的細菌啟動子包括大腸桿菌lacl和lacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、lambdaPR、PL啟動子和trp啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs啟動子，如Rous肉瘤病毒("RSV")啟動子和金屬疏蛋白啟動子(如小鼠金屬硫蛋白-1啟動子)。向載體中插入增強子序列可以通過更高級的真核細胞增加編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA順式作用元件，通常從約10到300bp,作用是在一既定的宿主細胞類型中增加啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。增強子的例子包括定位于復制起始點后側(cè)100至700bp的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復制起始點后側(cè)的多形瘤增強子和腺病毒增強子。為了翻譯的蛋白質(zhì)能夠分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、壁膜間隙或胞外環(huán)境，適當?shù)姆置谛盘柨梢员灰氡磉_的多肽。此信號對于多肽而言可以是內(nèi)多肽可以以修飾的形式(如融合蛋白質(zhì))被表達，也可以既包含分泌信號也包含額外的異源功能區(qū)域。因此，例如，附加的氨基酸區(qū)域(特別是帶電荷的氨基酸)可以被加入到多肽的N末端，以便在純化或隨后的操作和儲存中提高多肽在宿主細胞中的穩(wěn)定性并延長持續(xù)時間。也可以向多肽增加肽部分以利于純化。本發(fā)明多肽本發(fā)明提供分離的多肽，該多肽具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列或通過選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的多核苷酸序列在適當?shù)乃拗髦斜磉_而獲得的氨基酸序列。含有上述多肽的功能等價物的肽或多肽也包含于本發(fā)明。上述多肽都包含于術(shù)語"本發(fā)明多肽"。術(shù)語"肽"和"寡肽"被認為是同義的(如通常所認為的)，兩術(shù)語可以按上下文的需要互換使用，表示至少含有兩個以肽鍵連接的氨基酸的鏈。這里使用的詞"多肽"代表含有超過7個氨基酸殘基的鏈。這里所有的寡肽和多肽分子式或序列都是從左到右以氨基端到羧基端的方向書寫。這里使用的單字母氨基酸代碼是本領(lǐng)域所共知的，并可見于Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)。"分離的"多肽或蛋白質(zhì)是指從其天然環(huán)境中分離的多肽或蛋白質(zhì)。例如，為本發(fā)明目的，重組產(chǎn)生的多肽和在宿主細胞中表達的蛋白質(zhì)裙j人為是分離的，正如已經(jīng)通過4壬何適合的4支術(shù)(如Smith和Johnson公布的一步純化法，Gene67:31-40(1988))基本純化的天然或重組多肽。本發(fā)明磷脂酶可以通過眾所周知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選的是使用高效液相色鐠("HPLC")進行純化。本發(fā)明多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學合成產(chǎn)物和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括如細菌、酵母、真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)產(chǎn)生的產(chǎn)物。依賴于在重組生產(chǎn)方法中所使用的宿主，本發(fā)明的多肽可能被糖基化或非糖基化。另外，本發(fā)明多肽有可能包括修飾的起始甲硫氨酸殘基，在一些情況下是宿主介導過程的結(jié)果。蛋白質(zhì)片段本發(fā)明也以本發(fā)明多肽的生物活性片段為特征。本發(fā)明多肽的生物活性片段包括含有與磷脂酶氨基酸序列(如選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列)足夠一致性或來自磷脂酶氨基酸序列的氨基酸序列，它們含有比全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并至少表現(xiàn)出一種相應全長蛋白質(zhì)的生物活性。通常生物活性片段含有至少具有相應全長蛋白質(zhì)一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明蛋白質(zhì)生物活性片段可能是在長度上具有如10、25、50、IOO或更多氨基酸的多肽。此外，可以通過重組技術(shù)制備其它的生物活性部分(其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域被缺失了)，并評估本發(fā)明多肽天然形式的一種或多種生物活力。本發(fā)明也以編碼上述磷脂酶生物活性片段的核酸片段為特征。融合蛋白質(zhì)本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物(如其生物活性部分)可與非磷脂酶多肽(如異源氨基酸序列)有效連接，以形成融合蛋白。如這里所使用的，磷脂酶"嵌合蛋白質(zhì)"或"融合蛋白質(zhì)"含有與非磷脂酶多肽有效連接的磷脂酶多肽。在一優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白至少包含一個本發(fā)明磷脂酶生物活性片段。在另一優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白至少包含兩個本發(fā)明磷脂酶生物活性部分。在融合蛋白質(zhì)中，術(shù)語"有效的連接"指磷脂22的N端或C端彼此融合在一起。例如，在一實施方案中，融合蛋白質(zhì)為GST-磷脂酶融合蛋白質(zhì)，其中磷脂酶序列融合到GST序列的C端。這類融合蛋白質(zhì)便于重組磷脂酶的純化。在另一實施方案中，融合蛋白質(zhì)是在N端含有異源信號序列的磷脂酶蛋白質(zhì)。在一定的宿主細胞(如哺乳動物和酵母宿主細胞)中，可以通過使用異源信號序列增加磷脂酶的表達和/或分泌。在另一例子中，桿狀病毒包膜蛋白質(zhì)的gp67分泌序列可以被用作異源寸言號序歹寸(CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人，eds.，JohnWiley&Sons,1992)。其它真核異源信號序列的例子包括蜂毒素和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列(Stratagene;LaJolla，California)。而在另一例子中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等人，前述)和蛋白質(zhì)A分泌信號(PharmaciaBiotech;Piscataway，NewJersey)。信號序列可以被用來為本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的分泌和分離提供方便。信號序列一般的特征是具有疏水氨基酸核心，并通常在分泌過程中通過一次或多次切割事件從成熟蛋白質(zhì)中切除。這類信號肽含有經(jīng)過分泌途徑時允許將信號肽從成熟蛋白質(zhì)中切除的加工位點。信號序列指導蛋白質(zhì)的分泌，如從表達載體所轉(zhuǎn)化的真核宿主中分泌，信號序列隨后或同時被切除。通過本領(lǐng)域所知的方法可以容易的從胞外基質(zhì)中純化蛋白質(zhì)?？闪磉x的是，可使用利于純化的序列(如GST結(jié)構(gòu)域)連接信號序列和目的蛋白質(zhì)。因此，例如，編碼多肽的序列可以融合標記序列，如編碼利于此融合多肽純化的肽的序列。在本發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選的實施方案中，標記序列是六個組氨酸的肽，如pQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的標簽，許多是商業(yè)可獲得的。如Gentz等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)的描述，例如為了便于純化融合蛋白質(zhì)提供了六-組氨酸。例如，HA標簽是另一種用于純化的肽，它相應于已被Wilson等人(Cell37:767(1984))描述的來自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位。優(yōu)選的是，通過重組DM技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明嵌合或融合蛋白質(zhì)。例如，23使用傳統(tǒng)技術(shù)按讀碼框?qū)⒕幋a不同多肽序列的DM片段連接起來，例如使用平末端或粘末端連接，限制性酶消化提供適當?shù)哪┒?，適當?shù)靥畛湔承阅┒耍脡A性磷酸酶處理避免不必要的連接，以及進行酶連接。在另一實施方案中，可通過包括自動DNA合成儀在內(nèi)的傳統(tǒng)技術(shù)合成融合基因。另選的是，可使用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，錨定引物產(chǎn)生兩連續(xù)的基因片段之間互補的突出端，使它們隨后可以被退火，并通過再擴增產(chǎn)生嵌合基因序列(見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubel等人，JohnWiley&Sons:1992)。此外，許多可商業(yè)獲得的表達載體已經(jīng)編碼了融合部分(如GST多肽)。本發(fā)明的核酸可以被克隆到這類表達載體，以便兩融合部分按讀碼框連接，以表達含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。功能等價物術(shù)語"功能等價物"和"功能變異體"在這里被互換使用。編碼磷脂酶DNA的功能等價物是編碼表現(xiàn)出這里所定義的黑曲霉磷脂酶特定功能的多肽的分離DNA片段。本發(fā)明磷脂酶多肽的功能等價物是表現(xiàn)出至少一種這里所定義的黑曲霉磷脂酶功能的多肽。功能等價物因此也包括生物活性片段。蛋白質(zhì)或多肽功能等價物可能只是在選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列中含有一個或多個保守性氨基酸取代，或取代、插入或缺失非必需的氨基酸。因此，非必需氨基酸是在選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列中能夠被更改而又不實質(zhì)性改變生物功能的殘基。例如，預測在本發(fā)明磷脂酶蛋白質(zhì)中的保守氨基酸殘基特別不適合被更改。此外，在本發(fā)明磷脂酶蛋白質(zhì)和其它磷脂酶中保守的氨基酸也不適合更改。術(shù)語"保守性取代"指用具有相似氨基酸側(cè)鏈的殘基替換氨基酸殘基的取代。這些家族在本領(lǐng)域是已知的，包括具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天門冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、P分支的側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。功能核酸等價物一般含有沉默突變或并不改變編碼多肽生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供編碼含有改變氨基酸殘基的磷脂酶的核酸分子，其中發(fā)生改變的氨基酸殘基對于特定生物活性是非必需的。這類蛋白質(zhì)不同于選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列，但是它們保留了至少一種生物活性。在一實施方案中，分離的核酸分子含有編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)含有與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/"97%、98%、99%同源性或更高同源性的氨基酸序列。例如，Bowie,J.U.等人Science247:1306-1310(1990)提供了關(guān)于如何制備表型沉默氨基酸取代的指導，其中作者表明有兩種研究氨基酸序列容忍改變的主要方法。第一種方法依賴于進化的過程，其中通過自然選擇來接受或拒絕突變。第二種方法使用遺傳工程在克隆基因的特定位點引入氨基酸變化，通過選擇或篩選來鑒定保持功能的序列。如作者所陳述的，蛋白質(zhì)對于氨基酸取代具有驚人的耐受性。作者進一步指出了在蛋白質(zhì)的某一位置可能允許哪些改變。例如，許多隱藏的氨基酸需要非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺満苌儆斜Ｊ氐奶卣?。其它這類表型沉默的取代被描述于Bowie等人(前述)和這里引用的參考。通過分別向選自SEQIDNO:1和2、4和5、7和8、10和11、13和14的核苷酸編碼序列引入一個或多個核苷酸取代、加入或缺失，以至于向被編碼的蛋白質(zhì)引入一個或多個氨基酸取代、缺失或插入，從而可以創(chuàng)造編碼與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)的分離核酸分子。這類突變可以通過如定點誘變或PCR介導的誘變之類的標準技術(shù)被引入。25里提供的黑曲霉磷脂酶的直向同源物。黑曲霉磷脂酶直向同源物是能夠從其它菌林或物種中分離的蛋白質(zhì)，并與黑曲霉磷脂酶具有相似或一致的生物活性。這類直向同源物由于含有與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列而易于被鑒定。如這里所定義的，術(shù)語"基本上同源"指笫一條氨基酸或核苷酸序列含有相對于第二條氨基酸或核苷酸序列足夠或最少數(shù)量的一致或等價的(如具有相似的側(cè)鏈)氨基酸或核苷酸，以至第一和第二條氨基酸或核苷酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)域。例如，含有某一共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列在此處被定義為具有足夠的一致性，其中所述共同結(jié)構(gòu)域具有約60%,優(yōu)選的為65%，更優(yōu)選的為70%,甚至更優(yōu)選的為75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的一致性。編碼其它磷脂酶家族成員，因而具有不同于選自SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列的核酸也屬于本發(fā)明的范圍。此外，編碼不同物種磷脂酶蛋白質(zhì)，因而具有不同于選自SEQIDN0:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苦酸序列的核酸也屬于本發(fā)明的范圍?；谂c這里所公開的核酸的同源性，使用這里所公開的cDM或它們的合適片段作為雜交探針，按照標準雜交技術(shù)(優(yōu)選的是在高度嚴謹?shù)碾s交條件下)能夠分離相應于本發(fā)明DNA的變異體(如天然等位基因變異體)和同源物的核酸分子。除了這里提供的黑曲霉序列的天然發(fā)生的等位基因變異體外，技術(shù)人員知道可以通過突變選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列來引入改變，從而導致不基本改變蛋白質(zhì)功能的磷脂酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變。在本發(fā)明的另一方面提供改進的磷脂酶。改進的磷脂酶是至少改進了一種生物活性的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)可以通過向整個或部分編碼序列隨機引入突變獲得(如飽和誘變)，產(chǎn)生的突變體可以重組表達，并篩選生物活性。例如，本領(lǐng)域提供測量磷脂酶酶活力的標準方法，因此改進的蛋白質(zhì)可以容易的被挑選。26在優(yōu)選的實施方案中，磷脂酶具有選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列。在另一實施方案中，磷脂酶與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列基本同源，并至少保持了一種分別選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的磷脂酶的生物活力，但由于天然的變異或以上描述的誘變而在氨基酸序列上不同。在進一步優(yōu)選的實施方案中，磷脂酶具有能與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列雜交(優(yōu)選的是在高度嚴謹?shù)碾s交條件下)的分離的核酸片段所編碼的氨基酸序列。因此，磷脂酶是含有與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。特別是，磷脂酶是含有與SEQIDNO:3表示的氨基酸序列具有至少約50%、55%、60°/。、65%、70%、75°/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或是含有與SEQIDNO:6表示的氨基酸序列具有至少約55%、60%、65%、70%、75°/。、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或是含有與SEQIDNO:9表示的氨基酸序列具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或是含有與SEQIDNO:12表示的氨基酸序列具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、亂85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或是含有與SEQIDNO:15表示的氨基酸序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%、99°/或更高同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能等價物也可以通過如從本發(fā)明蛋白質(zhì)突變體(如截短突變體)組合文庫中篩選具有磷脂酶活力的突變體而被鑒定。在一實施方案中，通過在核酸水平的組合誘變產(chǎn)生變異體的多樣化文庫。變異體的多樣化文庫可如下生成，例如，用酶將合成的寡核苷酸混合物連接成基因序列以便一套簡并的潛在的蛋白質(zhì)序列作為單個多肽或作為一套更大的融合蛋白質(zhì)(如用噬菌體展示)被表達。有各種方法可以被用來從簡并寡核苷酸序列中產(chǎn)生本發(fā)明多肽潛在變異體文庫。本領(lǐng)域已知合成簡并寡核苷酸的方法(例如，見Narang(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等人(1984)A畫.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人(1984)Science198:1056;Ike等人(1983)NucleicAcidRes.11:477)。另外，本發(fā)明多肽編碼序列的片段文庫可以被用來產(chǎn)生多肽多樣群體，用于隨后的變異體篩選。例如，可以通過在僅對每一分子造成一次切割的條件下使用核酸酶處理目的編碼序列的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA，復性DM形成雙鏈(此雙鏈DNA可能包括來自不同切割產(chǎn)物的正義/反義配對)，使用SI核酸酶處理重新形成的雙倍體，以除去單鏈部分，并將產(chǎn)生的片段文庫連接到表達載體中，由此產(chǎn)生編碼序列的片段文庫。通過這種方法，可以獲得編碼目的蛋白質(zhì)N端和各種長度的內(nèi)部片段的表達文庫。本領(lǐng)域已知一些由點突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物的篩選方法，以及從cDNA文庫中篩選具有所選特性的基因產(chǎn)物的方法。最廣泛使用的能夠承受高通量分析的篩選大基因文庫的技術(shù)通常包括將基因文庫克隆到可復制的表達載體中，用所產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞，在所需活力的檢測便于編碼基因(其產(chǎn)物被檢測)的栽體被分離的條件下表達組合基因。Recursiveensemblemutagenesis(REM)是一種在文庫中增加功能突變體頻率的技術(shù)，它可以結(jié)合篩選分析被用來鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7811-7815;Delgrave等人(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在既定的群體中可能存在導致磷脂酶氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性是顯而易見的。這類遺傳多態(tài)性可存在于來自不同種群的細胞或天然等位基因變異的種群。等位基因變異體也可能包括功能等價物。本發(fā)明多核苷酸的片段也可能包含不編碼功能多肽的多核苷酸。這類多核苷酸可能具有作為探針或PCR反應引物的功能。本發(fā)明核酸可以被用作雜交探針或聚合酶鏈式反應(PCR)引物(不管它們編碼功能或非功能多肽)。不編碼具有磷脂酶活力多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(除了其它)(l)從cDM文庫(如從黑曲霉以外的其它生物)中分離編碼本發(fā)明磷脂酶的基因或它的等位基因變異體，(2)如Verma等人在HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)中描述的，與中期染色體原位雜交，以提供PLP03基因的精確染色體位置；(3)Northern印跡分析以在特定組織和/或細胞中檢測磷脂酶mRNA表達以及4)作為探針和引物，可以被用作在給定的生物(如組織)樣品中分析可與磷脂酶探針雜交的核酸存在的診斷工具。本發(fā)明也包括編碼磷脂酶的基因或cDNA的功能等價物的獲得方法。此方法需要有一標記的探針，該探針包括編碼選自SEQIDN0:3、6、9、12和15序列或它們的變異體的全長或部分的分離核酸；在允許探針與文庫中核酸片段雜交的條件下用標記的探針篩選核酸片段文庫，由此形成核酸二倍體，從任何標記的二倍體核酸片段中制備全長基因序列，以獲得與磷脂酶基因有關(guān)的基因。在一實施方案中，本發(fā)明的核酸與選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列或它們的互補序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65°/"70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明多肽與選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92°/"93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。宿主細胞在另一實施方案中，本發(fā)明以細胞為特征，如含有本發(fā)明包括的核29酸的轉(zhuǎn)化宿主細胞或重組宿主細胞。"轉(zhuǎn)化細胞"或"重組細胞"是通過重組DNA技術(shù)已引入本發(fā)明核酸的細胞(或這種細胞的后代)。包括原核和真核細胞，如細菌、真菌、酵母等等，特別優(yōu)選的細胞是絲狀真菌，尤其是黑曲霉。調(diào)節(jié)插入序列的表達或以專門的、需要的方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細胞可以被選擇。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)品的修飾(如糖基化)和加工(如切割)可以便于蛋白質(zhì)功能的最優(yōu)化。各種宿主細胞具有特有和專門的翻譯后加工和修飾蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的機制?？梢赃x擇分子生物學和/或微生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的適當?shù)募毎祷蛩拗飨到y(tǒng)，以確保表達的外源蛋白質(zhì)按目的進行正確的修飾和加工。為此，可以選擇具有適當加工原初轉(zhuǎn)錄物、具有基因產(chǎn)物糖基化和磷酸化的細胞機制的真核細胞。這類宿主細胞在本領(lǐng)域是眾所周知的。宿主細胞也包括(但不限于)哺乳動物細胞系(如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38)和脈絡叢細胞系。如果需要的話，可以通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系生產(chǎn)本發(fā)明多肽。公眾可以獲得一些適合穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系的載體，構(gòu)建這類細胞系的方法也已公諸于眾，如Ausubel等人的描述(前述)?？贵w本發(fā)明進一步以抗體為特征，如與本發(fā)明磷脂酶特異結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。如這里所使用的術(shù)語"抗體"(Ab)或"單克隆抗體"(Mab)意欲包括完整的分子和能夠與PLP03蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體片段(如Fab和F(ab')2片段)。Fab和F(abO2片段缺乏完整抗體的Fc片段，在循環(huán)中被更快的清除，并且可能具有比完整抗體更低的非組織專一性結(jié)合(Wahl等人J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。因此，這些片段是優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^任何各種方法制備本發(fā)明抗體。例如，可以向動物注射表達磷脂酶或它的抗原片段的細胞，以誘導產(chǎn)生含有多克隆抗體的血清。在優(yōu)選的方法中，制備并純化了基本不含天然污染物的磷脂酶制品。這一制品被引入動物以產(chǎn)生具有更高專一性活力的多克隆抗血清。在最優(yōu)選的方法中，本發(fā)明抗體是單克隆抗體(或其結(jié)合磷脂酶的片段)?？梢允褂秒s交瘤技術(shù)制備這類單克隆抗體(Kohler等人，Nature256:495(1975);Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511(1976);Hammerling等人，In:MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas，Elsevier,N.Y.，pp.563-681(1981))?？傮w而言，這類方法涉及用本發(fā)明蛋白質(zhì)或表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的細胞免疫動物(優(yōu)選的為小鼠)。提取被免疫小鼠的脾細胞并與適當?shù)墓撬枇黾毎等诤?。根?jù)本發(fā)明，任何合適的骨髓瘤細胞系都可以被使用；優(yōu)選的是親本骨髓瘤細胞系(SP20)，可從AmericanTypeCultureCollection:Rockville，Maryland獲得。融合之后，產(chǎn)生的雜交瘤細胞凈皮選擇性的保持在HAT培養(yǎng)基中，并如Wands等人(Gastro-enterology80:225-232(1981))所描述的，通過有限稀釋來克隆。然后分析通過這種選擇而獲得的雜交瘤細胞，以鑒定能夠分泌與PLP03蛋白質(zhì)抗原結(jié)合的抗體的克隆。通常，多肽可以與Ausubel等人描述的(前述)KLH之類的載體蛋白質(zhì)耦聯(lián)，并與佐劑混合，注射入宿主哺乳動物。特別是，通過注射目的多肽可以免疫各種宿主動物。合適的宿主動物的例子包括兔子、小鼠、荷蘭豬和大鼠。依賴于宿主的種類，可以使用各種佐劑來增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物膠佐劑(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳化物、鑰孔血藍蛋白、二硝基酚、BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。多克隆抗體是來自被免疫動物血清的抗體分子雜合群體。這種抗體可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD在內(nèi)的各種免疫球蛋白類別和它們的任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAbs的雜交瘤可以在體內(nèi)或體外培養(yǎng)。多克隆或單克隆抗體一旦被產(chǎn)生，則在免疫分析(如使用標準技術(shù)31的Western印跡或免疫沉淀分析，如Ausubel等人的描述，前述)中測試其對本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物的專一性識別。與本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物專一性結(jié)合的抗體在本發(fā)明是有用的。例如，這類抗體可以被用于免疫分析，以檢測病原或非病原曲霉菌抹中(如曲霉提取物中)的本發(fā)明蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，使用可能具有抗原性的本發(fā)明蛋白質(zhì)片段(通過如高頻率的電荷殘基之類的標準)生產(chǎn)本發(fā)明抗體。例如，可通過標準PCR技術(shù)產(chǎn)生這類片段，然后被克隆進pGEX表達載體(Ausubel等人，前述)。然后可以在大腸桿菌中表達融合蛋白質(zhì)，并使用如Ausubel等人描述(前述)的谷胱甘肽瓊脂糖親和介質(zhì)純化。如果需要的話，對于每個蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生幾個(如兩個或三個)融合體，每一個融合體可以被注射入至少兩只兔子。通過一系列的注射可以產(chǎn)生抗血清，一般包括至少三次加強注射。通常，要檢測抗血清免疫沉淀重組PLP03多肽或其功能等價物的能力，而不相關(guān)的蛋白質(zhì)可以被用作免疫反應專一性的對照?？闪磉x的是，描述的用來產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)OJ.S.專利4,946，778和4，704，692)可以被用來產(chǎn)生針對本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物的單鏈抗體。產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是可商業(yè)獲得的(如從Pharmacia)。另外，特別適合用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫的方法和試劑可見于如U.S.PatentNo.5，223，409;PCTPublicationNo.WO92/18619;PCTPublicationNo.WO91/17271;PCTPublicationNo.WO20791;PCTPublicationNo.W092/20791;PCTPublicationNo.W092/15679;PCTPublicationNo.W093/01288;PCTPublicationNo.WO92/01047;PCTPublicationNo.W092/09690;PCTPublicationNo.W090/02809;Fuchs等人(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等人(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85;Huse等人(198卩)Science246;1275-1281;Griffiths等人(1993)EMB0J.12:725-734.與本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物特異結(jié)合的多克隆和單克隆抗體32可以被用于如檢測編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)或其功能等價物的基因的表達(如在另一種曲霉菌林中)。例如，用傳統(tǒng)的對曲霉細胞或提取物的免疫分析將容易地檢查本發(fā)明蛋白質(zhì)。合適的分析例子包括(不限于)Western印跡、ELISA分析、放射免疫分析(RIA's)等等。"特異結(jié)合"意指抗體識別并結(jié)合特定抗原(如本發(fā)明蛋白質(zhì))，但基本上不識別和結(jié)合樣品中其它無關(guān)分子?？贵w可以被純化，如通過將多肽抗原固定在樹脂上的親和層析方法。針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體(如單克隆抗體)可以被用于通過標準技術(shù)分離蛋白質(zhì)，如親和層析或免疫沉淀。此外，此類抗體可以被用于檢測蛋白質(zhì)(如在細胞裂解物或細胞上清中)，以便評估蛋白質(zhì)表達的模式和豐度?？贵w也可以作為臨床測試方法的一部分，被用于診斷檢測細胞或組織的蛋白質(zhì)水平，如測定一種既定的治療方案的效率或?qū)η沟脑\斷。將抗體與可檢測的物質(zhì)耦聯(lián)將促進檢測?？蓹z測的物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。適當?shù)拿傅睦影ɡ备^氧化物酶、堿性砩酸酶、半乳糖普酶或乙酰膽堿酯酶；合適的熒光材料的例子包括傘形花內(nèi)酯、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白，合適的放射材料的例子包括1251、1311、"S或3H。優(yōu)選的抗原肽所包含的表位是位于蛋白質(zhì)表面的區(qū)域，如親水區(qū)域。蛋白質(zhì)的疏水圖(HydrophobicUyplots)可以,皮用于鑒定親水區(qū)域。本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗原肽至少包含選自SEQIDNO:3、6、9、12和15的氨基酸序列的7個優(yōu)選10、15、20或30個連續(xù)的氨基酸殘基，并包含該蛋白質(zhì)的表位，以致于所引起的針對此肽的抗體與蛋白質(zhì)形成特異樣免疫復合體。優(yōu)選的抗原肽所包含的表位是位于本發(fā)明蛋白質(zhì)表面的區(qū)域，如親水區(qū)域、疏水區(qū)域、含有Ct-螺旋的區(qū)域、含有P-鏈或折疊的區(qū)域、巻曲區(qū)域、回轉(zhuǎn)區(qū)域和柔性區(qū)域。免疫分析可使用任何本領(lǐng)域已知的方法進行生物樣品中本發(fā)明蛋白質(zhì)的定性或定量測定?；诳贵w的技術(shù)在分析生物樣品中特定的多肽水平上具有特殊的優(yōu)勢。在這種技術(shù)中，初級抗體(多抗或單抗)提供特異性識別，而二級檢測系統(tǒng)可以利用熒光、酶或其它耦聯(lián)的二級抗體。結(jié)果是得到免疫復合體。因此，本發(fā)明提供診斷生物是否感染曲霉菌的方法，包括步驟從所述被懷疑感染曲霉的生物中分離生物樣品，將所述生物樣品與本發(fā)明抗體反應，測定是否形成免疫復合體。也可以抽提組織(如使用尿素和中性去污劑)，以釋放用于Western-雜交或斑點/狹線分析的蛋白質(zhì)。此技術(shù)也可以被用于體液。其它對于檢測本發(fā)明蛋白質(zhì)有用的基于抗體的技術(shù)包括免疫分析，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。例如，針對和定量本發(fā)明蛋白質(zhì)。存在^樣品中的特定^白質(zhì)的量可以通過參考標準制品中的量，使用線性回歸計算機運算法則計算。在另一ELISA分析中，兩種截然不同的特異性單克隆抗體可以被用來檢測生物液體中的本發(fā)明蛋白質(zhì)。在這種分析中，一種抗體被用作免疫吸附劑，另一種被用作酶標探針。以上技術(shù)可以主要按"一步"或"兩步"分析操作。"一步"分析涉及將本發(fā)明蛋白質(zhì)與固定的抗體接觸，并(不經(jīng)洗滌)將混合物與標記的抗體接觸。"兩步"法涉及在混合物與標記抗體接觸以前進行洗滌。其它傳統(tǒng)方法也可以被適當使用。通常需要將分析系統(tǒng)的一種成分固定在支持物上，由此允許將系統(tǒng)的其它成分與此成分接觸，并易于從樣品中除掉。合適的酶標記包括，例如，那些來自氧化酶類別的酶，它們催化與底物反應產(chǎn)生過氧化氬。氧化酶標記的活性可以通過測量酶標抗體/底物反應產(chǎn)生的過氧化氫的濃度來分析。除了酶以外，其它合適的標記物包括放射性同位素(如碘(1251、1311)、碳("C)、硫("S)、氮(311)、銦rin)和锝(""Tc))和熒光標記物(如熒光素、羅丹明)和生物素。測試化合物與本發(fā)明蛋白質(zhì)的特異結(jié)合可以被檢測，如通過體外將本發(fā)明蛋白質(zhì)可逆或不可逆的固定在基質(zhì)(如96孔聚苯乙烯微量滴定板的孔表面)上。本領(lǐng)域熟知固定多肽和其它小分子的方法。例如，可以通過向每個孔加入蛋白質(zhì)溶液(通常濃度為0.05到1mg/ml，體積為1-100u1)，并且在室溫至37。C孵育平板0.1到36小時，使微量滴定板被本發(fā)明蛋白質(zhì)所覆蓋。通過從平板中倒出過量的溶液，然后用水或緩沖液洗滌平板(一次或反復進行)，可以除去未與平板結(jié)合的蛋白質(zhì)。通常，多肽保持在水或緩沖液中。然后用不含有被結(jié)合多肽的緩沖液洗滌平板。用與被結(jié)合多肽無關(guān)的蛋白質(zhì)封閉平板，以除去平板上空余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。例如，合適的有300ul溶于Tris-HCl的濃度為2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)。合適的基質(zhì)包括能進行明確交聯(lián)化學反應的基質(zhì)(如塑料基質(zhì)，如聚苯乙烯、苯乙烯或來自CorningCostarCorp.(Cambridge,MA)的聚丙烯基質(zhì))。如果需要的話，珠狀顆粒(如beadedagarose或beadedsepharose)可以被用作基質(zhì)。測試化合物與本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)合可以被本領(lǐng)域已知的各種方法所檢測。例如，特定的抗體可以被用于免疫分析。如果需要的話，抗體可以被標記(如用熒光或放射性同位素)，并被直接檢測(例如，見West和McMahon，J.CellBiol.74:264,1977)。替^R的是，可以使用二級抗體來檢測(如與抗AN97抗體Fc部分結(jié)合的標記抗體)。在一替代的檢測方法中，本發(fā)明蛋白質(zhì),皮標記，并且此標記,皮檢測(如通過使用放射性同位素、熒光團、發(fā)光團等等標記本發(fā)明蛋白質(zhì))。還在另一種方法中，本發(fā)明蛋白質(zhì)與可以被光學檢測的蛋白質(zhì)(如可以35在紫外光下檢查的綠色熒光蛋白質(zhì))融合后產(chǎn)生。在替代的方法中，本發(fā)明蛋白質(zhì)可與具有可檢測酶活力的酶(辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、ci-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶)共價連接或融合。編碼所有這些酶的基因都已被克隆，并對于本發(fā)明的技術(shù)人員而言是易于獲得的。如果需要的話，融合蛋白質(zhì)可以包括抗原，并且可以使用多克隆或單克隆抗體，通過傳統(tǒng)方法檢測和測量這一抗原。合適的抗原包括酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和a-半乳糖苷酶)和非酶多肽(如血清蛋白質(zhì)(如BSA和球蛋白)和乳蛋白質(zhì)(如酪素))。表位、抗原和免疫原在另一方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明多肽表位攜帶部分的肽或多肽。此多肽部分的表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位。"免疫原性表位"被定義為當整個蛋白質(zhì)是免疫原時，引起抗體反應的蛋白質(zhì)部分。這些免疫原性表位被認為被限制在分子的一些位點。在另一方面，抗體能結(jié)合的蛋白質(zhì)分子區(qū)域被定義為"抗原性表位"。蛋白質(zhì)的免疫原性表位的數(shù)量通常少于抗原性表位的數(shù)量。例如，見Geysen，H.M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002(1984)。關(guān)于帶有抗原性表位(即含有抗體能結(jié)合的蛋白質(zhì)分子區(qū)域)的肽或多肽的選擇，本領(lǐng)域熟知模仿蛋白質(zhì)部分序列的短的合成肽通常能產(chǎn)生與被部分模仿的蛋白質(zhì)反應的抗血清。例如，見Sutcliffe，J.G.等人，Science219:660-666(1984)。常常用蛋白質(zhì)的初級序列表示能夠產(chǎn)生與蛋白質(zhì)反應的血清的肽，可以用一套簡單的化學規(guī)則描述其特征，它既沒有被限制在完整蛋白質(zhì)的免疫優(yōu)勢區(qū)域(即免疫原性表位)，也沒有被限制在氨基或羧基端。極端疏水和具有6個或更少殘基的肽通常對于誘導結(jié)合被模擬的蛋白質(zhì)的抗體是無效的。更長的、可溶的肽(特別是含有脯氨酸殘基的肽)通常是有效的(Sutcliffe等人，前述，661頁)。例如，按照這一指導設計的含有8-39個氨基酸殘基、占流感病毒血凝素HA1多肽鏈序列75%的20個肽中，有18個肽誘導出了與HA1蛋白質(zhì)或完整病毒反應的抗體；而從MuLV聚合酶中設計的12個肽和從狂犬病糖蛋白中設計的18個肽全部都誘導出沉淀各自蛋白質(zhì)的抗體。由此，帶有抗原性表位的本發(fā)明肽和多肽對于引起抗體(包括專門與本發(fā)明多肽結(jié)合的單克隆抗體)是有用的。因此，通過融合用帶有抗原性表位的肽免疫的供體所提供的脾細胞而獲得的雜交瘤，通常有較高的比例分泌與天然蛋白質(zhì)反應的抗體(Sutcliffe等人，前述，663頁)。由帶有抗原性表位的肽或多肽所引起的抗體對于檢測被模仿的蛋白質(zhì)是有用的，針對不同多肽的抗體可以被用來追蹤在進行翻譯后加工的蛋白質(zhì)前體的不同區(qū)域的命運。肽和抗肽抗體可以凈皮用于檢測被模擬蛋白質(zhì)的各種定性或定量實驗，如在竟爭性分析中，因為對于免疫沉淀分析，已經(jīng)表明即使是短的肽(如約9個氨基酸)也能結(jié)合并置換較長的肽。例如，見Wilson，I.A.等人(Cell37:767-778，777頁(1984))。本發(fā)明抗肽抗體也可以被用于純化被模擬蛋白質(zhì)，例如使用本領(lǐng)域眾所周知的方法通過吸附層析。按照上述指導設計的本發(fā)明帶有抗原性表位的肽和多肽優(yōu)選的含有至少7個，更優(yōu)選的含有至少9個，最優(yōu)選的含有15到30個含于本發(fā)明多肽氨基酸序列中的氨基酸。然而含有更大部分本發(fā)明多肽氨基酸序列的肽或多肽，例如含有30到50個氨基酸或任何長度，以及包括本發(fā)明多肽完全的氨基酸序列的肽，也可以被認為是本發(fā)明帶有表位的肽和多肽，并被用于誘導與被模擬的蛋白質(zhì)反應的抗體。優(yōu)選的，選擇的帶有抗原性表位的肽的氨基酸序列能夠基本上溶于水性溶劑(即該序列包括相對親水殘基，而高度疏水的序列是要優(yōu)先避免的)；含有脯氨酸殘基的序列是特別優(yōu)選的?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的制造肽或多肽的手段(包括使用本發(fā)明核酸分子的重組手段)來產(chǎn)生本發(fā)明帶有表位的肽和多肽。例如，短的帶有表位的氨基酸序列可以與作為重組生產(chǎn)和純化過程中的載體的更大的多肽融合，其中該多肽也是免疫過程中的載體，以產(chǎn)生抗肽抗體。也可以使用已知的化學合成法合成帶有表位的肽。例如，Houghten描述了一種簡單的合成大量肽的方法，如在4周內(nèi)制備并表征(通過ELISA-型結(jié)合研究)了10-20毫克248種不同的13殘基肽，它們代表HAI多肽片段的單氨基酸變異體(Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5131-5135(1985))。這種"SimultaneousMultiplePeptideSynthesis(SMPS)"方法被進一步描述于U.S.PatentNo.4,631，211(Houghten等人(1986))。在這一程序中，用于固相合成各種多肽的單個樹脂被保持在分離的、溶劑可滲透的小嚢中，使能夠最佳的利用許多固相方法所涉及的相同的重復步驟。完全手工的程序允許同時進行500-1000或更多個合成。Houghten等人，前述，5134頁。本發(fā)明帶有表位的肽和多肽可以根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的方法被用于誘導抗體。例如，見Sutcliffe等人，前述；Wilson等人，前述；Chow，M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:910-914;和Bittle，F(xiàn).J.等人，J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)。通常，可以4吏用游離的肽免疫動物，而通過將肽與大分子載體(如鑰孔血藍蛋白(KLH)或破傷風類毒素)耦聯(lián)可以提高抗肽抗體的滴度。例如，對于含有半胱氨酸的肽可使用如馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺脂(MBS)之類的連接物與載體耦聯(lián)，而其它肽可使用如戊二醛之類的更普通的試劑與載體耦聯(lián)。使用游離的或載體耦聯(lián)的肽免疫如兔子、大鼠和小鼠之類的動物，例如通過腹膜內(nèi)和/或皮內(nèi)注射含有約100ug肽或載體蛋白質(zhì)以及弗氏佐劑的乳狀液。可能需要幾次加強注射，例如，間隔約兩周，以提供可以被檢測(如使用被固相表面吸附的游離肽進行ELISA分析)的有用滴度的抗肽抗體。通過挑選抗肽抗體可以增加,皮免疫動物血清中的抗肽抗體滴度，如按照本領(lǐng)域所熟知的方法，將肽吸附在固相支持體上，并洗脫所選擇的抗體。本發(fā)明帶有免疫原性表位的肽(即當整個蛋白質(zhì)作為免疫原時，引起抗體反應的蛋白質(zhì)部分)根據(jù)本發(fā)明已知的方法被鑒定。例如，Geysen等人(1984，前述)公開了一種在固相支持物上迅速同時合成許多純度足以在酶聯(lián)免疫吸附試驗中反應的肽的方法。然后，合成的肽與抗體的相互作用可以容易的被檢測，無需將它們從支持物上移走。通過這種方式，帶有目的蛋白質(zhì)免疫原性表位的肽可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員例行鑒定。例如，Geysen等人通過合成覆蓋蛋白質(zhì)整個213氨基酸序列的相互重疊的208個所有可能的6肽，從而定位了口蹄疫病毒衣殼蛋白質(zhì)的免疫學重要表位，其分辯率為7個氨基酸。于是，一套完整置換的肽(位于表位的每個位點被所有20個氨基酸依次取代)被合成，由此確定了賦于與抗體反應專一性的特定氨基酸。因此，可以通過此方法例行制造本發(fā)明帶有表位的肽的肽類似物。Geysen(1987)的U.S.PatentNo.4,708，781進一步描述了鑒定帶有目的蛋白質(zhì)免疫原性表位的肽的方法。Geysen(1990)的U.S.PatentNo.5,194，392還進一步描述了一種普通的檢測或測定單體(氨基酸或其它化合物)序列的方法，此單體是與目的抗體特定互補位(抗原結(jié)合位點)互補的表位的拓樸等價物(即"模擬表位(mimotope)")。更一般地，Geysen(1989)的U.S.PatentNo.4,433，092描述了一種檢測或測定單體序列的方法，此單體是與特定的目的受體的配體結(jié)合位點互補的配體的拓樸等價物。相似的，Houghten，R.A.等人(1996)的U.S.PatentNo.5,480，971(關(guān)于全烷基化的寡肽混合物)公開了線性C1-C7-烷基完全烷基化寡肽以及成套的這類寡肽和它們的文庫，并且公開了使用成套的這類寡肽和它們的文庫測定與目的受體分子優(yōu)先結(jié)合的完全烷基化寡肽的序列的方法。因此，通過這些方法也能例行制作本發(fā)明帶有表位的肽的非肽類似物。磷脂酶在工業(yè)方法中的用途本發(fā)明也涉及本發(fā)明磷脂酶在所選的一些工業(yè)和藥物方法中的用途。盡管這些方法有長期的經(jīng)驗，本發(fā)明磷脂酶具有若干比目前所使用的酶顯著有利的特征。依賴于具體的應用，這些有利條件包括如降低生產(chǎn)成本、提高底物專一性、更低的抗原性、更低的不需要的副作用、當使用合適的微生物生產(chǎn)時獲得更高的得率、更合適的pH和溫度范圍、終產(chǎn)物具有更好的味道、食品級別并更衛(wèi)生等方面。39本發(fā)明磷脂酶的一個重要方面是它們覆蓋整個最佳的pH和溫度范圍，被認為適合各種應用。例如，許多大規(guī)模的加工受益于5(TC或以上的相對較高的加工溫度(如控制微生物污染的危險)。本發(fā)明的一些磷脂酶滿足這一要求，但同時它們并不具有如此高的熱穩(wěn)定性，以至于它們能抵抗附加的熱處理導致的失活。后一特征允許烘焙產(chǎn)品(如面包)之類的產(chǎn)生終產(chǎn)物的方式不含有殘余的酶活力。許多飼料和食物產(chǎn)品具有輕微的酸性pH值，因此對于它們的加工而言，具有酸性或近中性最佳pH的磷脂酶是優(yōu)選的。本發(fā)明的磷脂酶也滿足這一需要。本發(fā)明磷脂酶可以被用于任何需要水解磷脂或獲得它的特異切割產(chǎn)物的應用。例如應用本發(fā)明磷脂酶可以產(chǎn)生溶血磷脂、二酰甘油、膽堿-或乙醇胺磷酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺和各種磷脂酸。本發(fā)明磷脂酶被優(yōu)選用于最佳活力pH。本發(fā)明磷脂酶可以被用于水性糖溶液或漿狀物的脫膠，以提高其過濾性，尤其是淀粉水解產(chǎn)物，特別是難于過濾并產(chǎn)生渾濁濾液的小麥淀粉水解產(chǎn)物。此處理可以使用本領(lǐng)域所熟知的方法完成。例如，見EP-A-219，269和EP-A-808,903。通過用多肽水解磷脂的主要部分，并從油中分離含有被水解的磷脂的水相，本發(fā)明磷脂酶可以被用于降低食用油的磷脂含量。這一方法可以被用于純化任何含有磷脂的食用油，如植物油(如大豆油、菜籽油、向日葵油)。在用磷脂酶處理之前，優(yōu)選的是油被通過濕法精制之類的預處理以除去粘液(膠漿)。通常，在開始用磷脂酶處理之時，油中含有50-250ppm以磷脂形式的磷，處理可以將磷值降到低于5-10ppm。磷脂酶處理是通過散布磷脂酶的水性溶液來完成，優(yōu)選的為平均直徑低于10ym的小滴形式。優(yōu)選的，水量占油重量的0.5-5%?？梢约尤肴榛瘎?。可以使用機械攪動來保持乳化。磷脂酶處理可以在約3.5到5的pH范圍進行，以最大化酶的性能，或者可以使用約1.5到3(如2-3)的pH范圍，以抑制甘油三脂的堿水解(急化)?？梢酝ㄟ^加入檸檬酸、檸檬酸緩沖液或鹽酸來調(diào)節(jié)pH。適合的溫度通常是30-70。C(尤其是30-45°C，如35-40。C)。反應時間通常是1-12個小時(如2-6小時)。合適的酶劑量通常是0.l-10mg每升(如O.5-5mg每升)。磷脂酶處理可以分批進行(如在一攪拌的容器中)，或者也可以連續(xù)進行(如在一系列攪拌的反應容器內(nèi))。磷脂酶處理之后是對水相和油相的分離。此分離可以通過傳統(tǒng)的方式完成(如離心)。水相中含有磷脂酶，并且這些酶可以被重復利用以提高此過程的經(jīng)濟性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種方法完成此處理。例如，見U.S.PatentNo.5,264，367，EP-A-654,527和JP-A-2-153997.烘焙產(chǎn)品是由生面團制成，生面團通常由基本成分面粉、水和可選的鹽制成。依賴于烘焙產(chǎn)品的不同，其它選擇性的成分包括糖、調(diào)味品等等。對于發(fā)酵產(chǎn)品，面包酵母主要在化學發(fā)酵系統(tǒng)(如酸(產(chǎn)生酸的化合物)和重碳酸鹽的組合)之后被使用。為了提高生面團的操作特性和烘焙產(chǎn)品的最終性質(zhì)，一直在努力發(fā)展有助于提高性質(zhì)的手段。需要被提高的生面團性質(zhì)包括可加工性、氣體保留能力等等?？梢员惶岣叩暮姹寒a(chǎn)品的性質(zhì)包括面包體積、面包皮脆度、面包心質(zhì)地和柔軟性、味道和香味以及保質(zhì)期。目前具有的加工輔助手段可以被分為兩組化學添加劑和酶。改善性質(zhì)的化學添加劑包括氧化劑(如抗壞血酸、溴酸鹽、和偶氮碳酸鹽)、還原劑(如L-半胱氨酸和谷胱甘肽)、作為生面團調(diào)節(jié)物的乳化劑(如二乙酰酒石酸單/雙甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸鈉(SSL)或硬脂酰乳酸鈣(CSL))，或作為面包心軟化劑的乳化劑(如單硬脂酸甘油脂(GMS)等)、脂肪材料(如甘油三脂(脂肪)或卵磷脂及其它)。目前趨向于用酶來代替化學添加劑。后者被認為是更天然的化合物，因此更加被消費者接受。合適的酶可以選自淀粉降解酶、阿拉伯糖木聚糖及其它半纖維素降解酶、纖維素降解酶、氧化酶、脂肪材料裂解酶和蛋白質(zhì)降解酶。本發(fā)明也涉及制備生面團或烘焙產(chǎn)品的方法，該方法包括向生面團中整合入有效量的本發(fā)明磷脂酶，相對于沒有加入多肽的生面團或烘焙產(chǎn)品而言，該磷脂酶改善生面團或來自此生面團的烘焙產(chǎn)品的一種或多種性質(zhì)。41短語"整合入生面團"在這里的被定義為將本發(fā)明磷脂酶加入生面分混合，物。換句話說，本發(fā)明磷脂i可二在制備生面團的任何步驟中加入，并且可以在一步、兩步或多步中被加入。使用本領(lǐng)域熟知的方法，本發(fā)明磷脂酶被加入到生面團成分中，其中該生面團凈皮揉制，并被烘焙成烘焙產(chǎn)品。例如，見U.S.PatentNo.4,567，046，EP-A-426,211，JP+60-78529，JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。術(shù)語"有效的量"在這里的定義是在生面團和/或烘焙產(chǎn)品的至少一個目的性質(zhì)上足以提供可測量效果的本發(fā)明磷脂酶的量。術(shù)語"改善的性質(zhì)"在這里的定義是相對于沒有加入本發(fā)明磷脂酶的生面團或烘焙產(chǎn)品而言，任何被本發(fā)明磷脂酶的作用所改善的生面團或來自此生面團的產(chǎn)品(特別是烘焙產(chǎn)品)的性質(zhì)。改善的性質(zhì)可能包括(但不限于)增加生面團的強度、彈性、穩(wěn)定性、降低生面團粘性、提高生面團延展性、改善烘焙產(chǎn)品的味道、改善抗陳腐能力?？梢酝ㄟ^在以下實施例中描述的本發(fā)明方法對加入和沒有加入本發(fā)明多肽而制備的生面團和/或烘焙產(chǎn)品進行比較，從而測定改善的性質(zhì)。感觀質(zhì)量可以使用烘焙工業(yè)已良好制定的程序來評估，例如，可以包括使用一組經(jīng)訓練的味道測試員。術(shù)語"生面團增加的強度"在這里的定義是生面團通常更具彈性和/或需要更多工作進行塑造和成形的性質(zhì)。術(shù)語"生面團增加的彈性"在這里的定義是生面團在經(jīng)受一定的物理力后具有更高的恢復原有形狀的趨向的性質(zhì)。術(shù)語"生面團增加的穩(wěn)定性"在這里的定義是生面團不易被機械損壞，因此更好的保持其形狀和體積的性質(zhì)。術(shù)語"生面團降低的粘性"在這里的定義是生面團更不易與表面(如在生產(chǎn)生面團的機器中)粘附的性質(zhì)，并且被有經(jīng)驗的測試面包師依經(jīng)驗評估或使用本領(lǐng)域已知的質(zhì)地分析器(如TAXT2)進行測量。術(shù)語"改善的生面團延展性"在這里的定義是生面團能夠經(jīng)受更大的張力和牽引而不斷裂的性質(zhì)。術(shù)語"改善的生面團可加工性"在這里的定義通常是生面團具有更低的粘性和/或更加牢固和/或更具彈性的性質(zhì)。術(shù)語"烘焙產(chǎn)品增加的體積"是以給定的面包條的特定體積(體積/重量)，其通常是通過傳統(tǒng)的油菜籽置換方法被測定。術(shù)語"改善的烘焙產(chǎn)品面包心結(jié)構(gòu)"在這里的定義是烘焙產(chǎn)品面包心中具有更精細和/或更細薄的腔壁和/或在面包心中具有更一致/同源分散的小腔，通常經(jīng)有經(jīng)驗的測試面包師按經(jīng)驗評估。術(shù)語"改善的烘焙產(chǎn)品柔軟性"與"堅固性"相對，在這里的定義是烘焙產(chǎn)品更容易被壓縮的性質(zhì)，并且被有經(jīng)驗的測試面包師按經(jīng)驗評估或使用本領(lǐng)域已知的質(zhì)地分析器(如TAXT2)進行測量。術(shù)語"烘焙產(chǎn)品改善的滋味"通過經(jīng)訓練的測試小組評估。術(shù)語"改善的烘焙產(chǎn)品抗腐敗能力，，在這里的定義是烘焙產(chǎn)品在儲存過程中質(zhì)量參數(shù)(如柔軟性和/或彈性)下降整率減慢的性質(zhì)。術(shù)語"生面團"在這里的定義是面粉和其它成分的混合物，其堅固足以承受揉捏或輥壓。生面團可以是新鮮的、冷凍的、未加工的(pre-bared)或烘焙前的。冷凍的生面團的制備由Kulp和Lorenz在FrozenandRefrigeratedDoughsandBatters中描述。術(shù)語"烘焙產(chǎn)品，，在這里的定義是指任何由生面團制備的產(chǎn)品，不管具有柔軟還是松脆的特征?？梢员槐景l(fā)明方便生產(chǎn)的烘焙產(chǎn)品(不管是白色、淺色或者暗黑型)是面包(特別是白面包、粗糧面包或燕麥面包，)通常的形式是塊型、巻型、法國棍型面包、意大利面食、皮塔餅、玉米粉圓餅(tortillas)、玉米面豆巻(tacos)、蛋糕、薄煎餅(pancake)、餅干、小甜餅、餡餅皮、饅頭、脆面包等等。在本發(fā)明方法中使用的本發(fā)明磷脂酶和/或附加的酶可以以任何適合所需用途的形式祐:使用，如以干粉、凝聚粉或顆粒(特別是無塵顆粒)、液體(特別是穩(wěn)定的液體)或,皮保護的酶(如W001/11974和W002/26044中所描述的)的形式。顆粒和凝聚粉可以通過傳統(tǒng)的方法被制備，如通過將本發(fā)明磷脂酶噴霧到流化床制粒機的栽體上。載體可以由具有適當顆粒大小的顆粒核心組成。栽體可以是可溶的或不可溶的，如鹽(例如NaCl或硫酸鈉)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、大米、玉米粗粉或大豆。本發(fā)明磷脂酶和/或附加的酶可以含于緩慢釋放的制劑中。本領(lǐng)域熟知制備緩慢釋放制劑的方法。按照確立的方法，加入在營養(yǎng)上可接受的穩(wěn)定劑，如糖、糖醇、或其它多元醇、和/或乳酸或其它有機酸可以例如穩(wěn)定液體酶制劑。本發(fā)明磷脂酶可以被加入含有如EP-A-0619947、EP-A-0659344和W002/49441所公開的組合物的ub酵母。對含于混合前的面粉而言，本發(fā)明多肽以干燥產(chǎn)物的形式(如無塵顆粒)是有利的，而對含于液體而言，則液體形式是有利的。一種或多種附加的酶也可以被整合入生面團。附加的酶可以來自包括哺乳動物和植物在內(nèi)的任何來源，優(yōu)選的是微生物(細菌、酵母或真菌)來源的，并且可以通過本領(lǐng)域使用的傳統(tǒng)技術(shù)獲得。在一優(yōu)選的實施方案中，附加的酶可以是淀粉酶(如a-淀粉酶(用于提供可被酵母發(fā)酵的糖和延遲腐敗)或P-淀粉酶)、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、肽酶(特別是外肽酶，用于增強口味)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、脂酶(用于存在于生面團或生面團成分中的脂質(zhì)的修飾，以便于軟化生面團)、磷脂酶、纖維素酶、半纖維素酶(特別是戊聚糖酶，如木聚糖酶(用于部分水解戊聚糖，增加生面團延展性)、蛋白酶(用于弱化麩質(zhì)，特別是在使用硬質(zhì)小麥粉時)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(如W095/00636中公開的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶)、糖基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶(用于改善生面團的稠度)、漆酶、或氧化酶(如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧化酶或L-氨基酸氧化酶(用于改進生面團稠度))。當按照本發(fā)明的方法加入一種或多種附加酶活力時，這些活力可以與本發(fā)明多肽分開或一起被加入，可選地作為改善面包和/或生面團的組合物的成分。其它酶活力可以是以上描述的任何酶，并且可以按照已確立的烘焙實踐被使用。本發(fā)明也涉及制作烘焙產(chǎn)品的方法，包括將來自本發(fā)明方法的生面團烘焙成烘焙產(chǎn)品。使用本領(lǐng)域所熟知的方法可以將生面團烘焙成烘培產(chǎn)品。本發(fā)明也分別涉及由本發(fā)明方法所產(chǎn)生的生面團和烘焙產(chǎn)品。本發(fā)明進一步涉及用于生面團和/或由生面團制成的烘焙產(chǎn)品的預混物(pre-mix)(如以面粉組合物的形式)，其中預混物包括本發(fā)明多肽。這里定義的術(shù)語"預混物"將被理解成它的傳統(tǒng)含義，即通常包括面粉的烘焙制劑混合物，它不僅可以用于通常包括面粉的工業(yè)面包烘焙試劑(不僅可以被用于工業(yè)面包烘焙廠/設備)，也可用于零售面包店。預混物可以通過將本發(fā)明多肽或含有該多肽的改善面包和/或生面團的組合物與合適的栽體(如面粉、淀粉、糖或鹽)混合來制備。預混物也可以包括其它改善面包和/或生面團的添加劑，如包括酶在內(nèi)的以上提及的任何添加劑。本發(fā)明進一步涉及顆?；蚰鄯坌问降暮姹禾砑觿颂砑觿┌ū景l(fā)明多肽。優(yōu)選的烘焙添加劑具有狹窄的顆粒大小分布，其中超過95%(重量百分比)的顆粒在25到500um的范圍內(nèi)。在生面團和面包制作中，本發(fā)明可以與前文定義的加工輔助手段結(jié)合使用，例如化學加工輔助物如氧化劑(如抗壞血酸)、還原劑(如L-半胱氨酸)、氧化還原酶(如葡萄糖氧化酶)和/或其它酶，如多糖修飾酶(如a-淀粉酶、半纖維素酶、分支酶等等)和/或蛋白質(zhì)^務飾酶(內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等等)。實施例1黑曲霉的發(fā)酵這里提供的核酸序列所編碼的磷脂酶是通過構(gòu)建含有該DNA序列的表達質(zhì)粒，用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑曲霉菌林，并以下述方式繁殖黑曲霉菌林而獲得。新鮮的黑曲霉孢子(10fi-107)被接種于20mlCSL-培養(yǎng)基(100ml燒瓶，隔板)，并于34。C、170rpm生長20-24小時。將5-10mlCSL預培養(yǎng)物接種到100mlCSM培養(yǎng)基(500ml燒瓶，隔板)后，于34。C、45170rpm持續(xù)3-5天發(fā)酵菌株。通過在50mlGreiner試管中離心(30分鐘，5000rpm)而獲得無細胞上清。上清經(jīng)GF/AWhatmanGlass」微纖維過濾器(150mmAE)預過濾除去大的顆粒，用4NKOH將pH調(diào)到5(如果必要的話)，并經(jīng)0.2um(瓶口)的過濾器，使用抽氣泵無菌過濾，以除掉真菌物質(zhì)。上清被儲存于4。C(或-20°C)。CSL培養(yǎng)基由100gCornSteepSolids(Roquette)、1gNaH2P04*H20、0.5gMgS04*7H20、10g葡萄糖*1120和0.25gBasildon(消泡劑)組成(每升的量)。成分被溶解于脫礦質(zhì)水并用NaOH或H2S04將pH調(diào)到5.8;向具有隔板和泡沫球的100ml燒瓶中加入20ml發(fā)酵培養(yǎng)液，于12(TC滅菌20分鐘，冷卻到室溫后向每個燒瓶加入200ja1含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的溶液。CSM培養(yǎng)基由150g麥芽糖*1120、60gSoytone(蛋白胨)、1gNaH2P04*H20、15gMgS04*7H20、0.08g吐溫80、0.02gBasildon(消泡劑)、20gMES、1gL-精氨酸組成(每升的量)。成分被溶解于脫礦質(zhì)水并用NaOH或H2S04將pH調(diào)到6.2;向具有隔板和泡沫球的500ml燒瓶中加入100ml發(fā)酵培養(yǎng)液，于120。C滅菌20分鐘，冷卻到室溫后向每個燒瓶加入1ml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的溶液。實施例2本發(fā)明磷脂酶的純化第一步-超濾液的制備培養(yǎng)物上清(如在實施例1中獲得的)被超濾除去會干擾酶活力測定及烘焙測試的低分子污染物。在裝備截留值為10kDa過濾器的MilliporeLabscaleTFF系統(tǒng)中完成30ml上清的超濾。依賴于它們的顏色，用體積為40ml的pH為6.0、并含有0.5mMCaCl2的100mM冷磷酸緩沖液將樣品洗滌3-5次。酶溶液的最終體積為30ml,并被進一步稱為"超濾液"。第二步一通過AMO和HPSEC測定磷脂酶濃度。根據(jù)歸于磷脂酶的nm消光(A280)和算出的磷脂酶分子消光系數(shù)計算出超濾液中的磷脂酶濃度。使用UvikonXLSecomam分光光度計(BeundeRonde，Abcoude，TheNetherlands)完成A280的測量。酶的分子消光系數(shù)可以根據(jù)每個酶分子中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基的數(shù)量算出(S.C.Gill和P.H.vonHippel,Anal.Biochem.182,319-326(1989))。這些氨基酸的分子消光系數(shù)分別為1280、5690和120M—^cm—\本發(fā)明磷脂酶中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基的數(shù)量可以從選自SEQIDNO:3、6、9、l2和l5的蛋白質(zhì)序列中推算出。計算出的本發(fā)明磷脂酶消光系數(shù)總結(jié)于表l表1磷脂酶SEQIDNO:絲酸數(shù)目計算的分子量(Da)計算出的280nm的消光指數(shù)TrpTyrCysM-1.cnV1(1mg/ml)-，.cm-1PLP0337224496831654903,3PLP066610731694918802,9PLP15911279684402173003,2PLP261216238682552228703,3PLP341512288703202285603,3歸于磷脂酶的超濾液280nm(A280)的消光依賴于酶的純度。使用TSKSW-XL柱(30(^7，8咖；MW范圍10-300kDa)，通過HPSEC(HighPerformanceSizeExclusionChromatography)測定純度。洗脫緩沖液由pH6.0的25mM磷酸鈉緩沖液組成，并以1ml/min的流速被使用。注入5-100ul樣品。測量在280nm的吸收。從色譜中各種磷脂酶的峰面積與在280吸收的峰的總面積的比例得出超濾液中歸于本發(fā)明磷脂酶的A280。然后通過將超濾液A280與上述比例相乘，再除以計算出的每一磷脂酶的消光系數(shù)(lmg/ml溶液-表1最右行)而計算出超濾液中的磷脂酶濃度。實施例3活性測量實施例2的超濾液經(jīng)受以下酶活力測量磷脂酶A!或A2溶血磷脂酶.磷脂酶C半乳糖脂酶活力.真菌oc-淀粉酶磷脂酶A的測定是通過使用1，2-二硫代二辛酰-磷脂酰膽堿為底物的分光光度法。磷脂酶水解在位置1(PLA1)或2(PLA2)的疏化物鍵，由此釋放4硫代辛酸，4硫代辛酸隨后與4，4'-二石危代吡咬反應形成4-硫代吡啶酮。后者與在334nm吸收的4-巰基吡啶處于互變異構(gòu)平衡。反應在37。C于pH4.0的0.^醋酸緩沖液+0.2%的Triton-X100中進行。在所述的反應條件下每分鐘釋放1微摩爾4硫代辛酸的酶量被定義為1磷脂酶A單位(PLA)。溶血磷脂酶活力的測定是通過使用溶血磷脂酰-膽堿為底物的"P-服R光鐠。溶血磷脂酶水解酯鍵，因此從甘油部分釋放脂肪酸。由此形成的甘油磷脂酰膽堿被NMR定量。反應在55。C于pH4.5、進一步含有1mg/ml溶血磷脂酰膽堿和5mMCaCh的50mM醋酸緩沖液中進行30分鐘。在所述的反應條件下每分鐘形成1微摩爾4甘油磷脂酰膽堿的酶量被定義為1溶血磷脂酶單位(LPC)。磷脂酶C活力的測定是通過使用對-硝基苯磷脂酰膽堿為底物的分光光度法。磷脂酶C水解酯鍵，由此釋放在405nm吸收的對-硝基酚。反應在37。C于pH5.0、進一步含有20mMCaCh、0.25%TritonX-100和20mM對-硝基苯磷酰膽堿的100mM醋酸緩沖液中進行7分鐘。終止反應，并通過向1體積的分析混合物中加入0.75體積的1MTRIS溶液來升高pH，之后測量在405nm的消光(e405nn=18500M—1.cm扁1)。在所述的反應條件下每分鐘形成1微摩爾對-硝基酚的酶量被定義為1磷脂酶C單位。半乳糖脂酶活力的測定是根據(jù)Hirayama和Matsuda(1972)Agric.Biol.Chem.36，1831描述的方法，通過4吏用雙半乳糖甘油二酯為底物的H-NMR光謙。半乳糖脂酶水解脂肪酸與甘油骨架之間的酯鍵，由此釋放一個或兩個脂肪酸。反應在30。C于pH4.5、進一步含有4mMCaCl2、0.2%TritonX-IOO和lmg/ml雙半乳糖甘油二酯(LipidProduct)的50mM醋酸緩沖液中進行30分鐘。在所述的反應條件下每分鐘形成l微摩爾脂肪酸的酶量被定義為1半乳糖脂酶單位。使用PhadebasAmylase測試藥片(Pharmacia)須'J量真菌ot-淀粉酶活性。Phadebas藥片含有不溶于水的淀粉底物和與底物交聯(lián)結(jié)合的蘭色染料。底物被真菌淀粉酶所水解，釋放被染色的可溶麥芽糊精進入溶液。用含有參照真菌a淀粉酶活力的溶液制備校準曲線。用pH5.5的50mM蘋果酸緩沖液制備參照和未知樣品的適當稀釋液。5ml樣品在30。C被孵青5分鐘。加入Phadebas藥片，并在15分鐘后加入1.0ml0.5當量的氫氧化鈉終止反應。冷卻5分鐘，使混合物降到室溫，然后加入4.Oml水，用手搖動，15分鐘后于4700rpm離心樣品IO分鐘。在620nm測量上層消光系數(shù)。OD620nm是真菌a淀粉酶活力的量度標準。在所述的反應條件下每小時將l克淀粉(100%干物質(zhì))轉(zhuǎn)變成與已知強度的碘溶液反應后能夠在620nm傳輸信息的產(chǎn)物的酶量被定義為l真菌淀粉酶單位。表2a實施例2制備的超濾液中的磷脂酶活力。鱗脂酶<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>除了提及的活力，還具有更少活力的葡萄糖淀粉酶和木糖聚酶，然而這些酶如此低的量并不會干擾描述于實施列4的烘焙實驗。實施例4烘焙實驗l-小面包條小面包條來自烘焙克生面團塊。該生面團是通過混合200g面粉(Kolibri^VlbiS,以80/20的比例)、1.4g干面包酵母(Fermipan)、4g鹽、3g糖、10mg抗壞血酸、116g水和2g月旨肪而成。在一小型混合器(pinmixer)中混合6分15秒之后，生面團被分成150克的小塊并于30。C試粉(proof)45分鐘，打壓，再試粉25分鐘，成形并放入供焙鍋。進行試粉的相對濕度為90-100%。在30。C最終試粉70分鐘后，生面團在225。C被烘焙20分鐘。不同磷脂酶在烘焙實驗中的各種效果(表3)與含有與超濾液中相同數(shù)量真菌淀粉酶(超濾液中的真菌淀粉酶活力見表2)的對照相比較。這是必要的，因為同磷脂酶一起被加入的淀粉酶的數(shù)量對于面包的體積(而不是其它參數(shù))有特別的影響。被加入對照數(shù)量真菌淀粉酶的面包的體積被看作100%。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>寸吏用面包體積測量器BVM-3(RICardsInstrumentsAB,Viken，Sweden)測定面包條體積。這一測量原理基于圍繞旋轉(zhuǎn)面包的傳感器測量的超聲反射。測量所需時間是45秒。生面團的粘性和延展性由合格面包師使用表3描述的量度評估。每一對象平均測量兩個面包條。在這些測試之后生面團塊被做成圓形，于30°C第一次試粉45分鐘，之后生面團被打壓、成形、放入烘焙鍋，在30。C試粉75分鐘。試粉時的相對濕度被置于85%。隨后通過出現(xiàn)的氣泡、裂開的表皮(tornsidecrust)和不規(guī)則彎曲表面判斷試粉生面團的穩(wěn)定性。生面團塊在225。C被烘焙20分鐘。通過BVM-3方法測定面包條體積表中呈現(xiàn)的是從同一對象烘焙的兩個面包的平均值。面包心結(jié)構(gòu)由合格面包師使用表3描述的量度評估。面包條在聚乙烯袋中室溫保存3天后，其面包心堅固性被StevensTextureAnalyser測量。取自每個面包條中心的兩厘米厚的兩面包片被質(zhì)地分析器分析，使用1.5英寸直徑探針，5mm壓縮深度(25W和0.5mm/秒壓縮速率。表中顯示的是兩個測量的平均值。面包皮的顏色由合格面包師使用表3描述的量度評估。荷蘭模制面包的標準方案被作為參考使用。面包心的顏色由合格面包師使用表3描述的量度評估。對照面包的面包心顏色被判斷為正常(3)。作為陽性對照，使用了兩個對象的面包其與對照具有相同的組成，只是多加了0.5%大豆粉。試粉和烘焙程序與沒有大豆粉的對照是一樣的。后者被判斷為"非常好"。面包的頂部隆起通過頂部相對于烘焙模具的突出而判斷，面包頂部的邊緣越低，則判斷值也越低，隆起越少，則判斷值越好。表4本發(fā)明磷脂酶的烘焙成績<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>—省施例5烘焙實驗2-batard本發(fā)明磷脂酶的烘焙成績用稱為"batard"的法國型面包測試。在一標準烘焙方法中batard的制備是通過在約20'C，在一螺旋式混合器(Diosna:速度l為兩分鐘；速度2輸入100Wh)中混合3000g小麥粉、70g壓縮酵母、60g鹽、68ppm抗壞血酸、17ppmFermizymeP2。。(真菌ct-淀粉酶)、30ppmFermizymeHS畫(真菌半纖維素酶)、7ppmBakezymeP500和1680ml水(8-10。C)。生面團溫度為27°C。生面團的可機械加工性通過面包師手工分析。生面團在32'C和90%的RH下，在發(fā)酵拒中被給予15分鐘的大量試粉。之后生面團被分成重350g的6塊，并被做成圓形，在32。C和90%的RH下發(fā)酵15分鐘。這一時期結(jié)束后生面團被塑造成形，并在32。C和90%的RH下被給予90分鐘的最終試粉。完全試粉的生面團被切成生面團塊，在烤箱中于240。C烘焙30分鐘，并在最初加入蒸氣。在冷卻到室溫后使用BVM-方法測定面包條體積(見實施例4)。在冷卻到室溫后，破裂、碎片和面包的形狀被有資格的面包師使用表5的量度直接分析。在室溫儲存于一封閉的盒子16小時后，面包心的質(zhì)量被有資格的面包師評估。面包的值來自l個對象。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>*基于面粉重量和由A280方法測定的酶重量，單位為ppm<110>DSMN.V.<120>新的磷脂酶及其用途<130>20950W0<歸15<170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>3763<212〉DNA<213>黑曲霉<400>1ggtggatgat3gC3C3Cgggcgax;gc肪gatCg3g3犯t3acttggtcatcatteitttct60tgtgggt犯gcsieigagtcttatagggggtcctgctgtggtctgcgacatctggtggstgt120ggatggacgatgatgaagatggggg犯ctsttcccaatgcggtgcgcgggtgcgatggaa180tggacaggaagag犯tttttcatctcaggattgggga幼tggttgaactcgaccggtgtg240tgtgtgccgttg卿cagctggagtgttatctgtagtatctacggtctatgcgcatcatc300ttcaacagatccgacca>g3gtgtgaaagatgccatcg犯gaaagaaaaat幼ctaaaccc360ggtcgggactgctatcgacagcctg鄉(xiāng)cagta鄉(xiāng)cagtgaggcagtgaggcagtgagg420cagtgaggcagtcaggtgatgatcaggcatccaatcatctctgcctcgccgccttgccgc480ctggggtgtc肌ggcg犯ggaccagctcgtcatccgatcgagatccatcccgaataatgt540ccaggctgttcgcagtgcctggtgctagttgtagatatatgggttatgatatctcactgt600tctctaccatccttcctgttcctggctctctgctgtggtgtgtatccgagcgggccggaa660gctaccgatcgccggattgttccggcccttttcttattccatgggctgtgcccttactct720gcctctctttctatctttctctctctctctctctctctgattcgttcccaatggagaatt780caggtac犯agtaattccctctggcatgactgcttgacatgtcgccattcaacatcatga840agtactaagtagtagtagaccaacteictctggacggctgat3gC6LgCC犯tcacggg犯a900gtggccacgcacgggggctgtcgatccccgatgatcgtgcattggc柳gccatgaagaa960柳cggtaggacaagcctcgaccagtctctgctacagtgtatcccctccc柳tatgggg1020taaaccctcaaataccgtccgacccggtccctcgtgcccctgcagatcgatgccattgga1080gttgcatccggccttcgcgtctccaccgatggagaagggagggtgaat犯tggcgtccat1140gcaaatggctcgcttgactcacaagatgtagtacttgtttgatggtgtct1200cgaccacttggtgcagaccctgc鄉(xiāng)gggag柳tgaggag犯犯gctgt1260ccgagtgacagctccaactccaccctgacc3tggtataag幼ggctccccctcgaccatc1320ttgtc幼tggctattctcaccagggtatcgcattctgcctcctccatctgtactacaaat1380tacaacagagctcaccatgcatcccagtgcgctggtcggtctgctggcctttgctgccgc1440tgcctcggccatccccgccaacccc3gcc3taaggctcsctccgactcggccgtccagaa150054tctcaagtcg犯g3tcaagsatgtcgtcgtcctggtcatgg柳atcgttccgtggacaa1560CCtgttgggELggtcagacgatc肌gggcttggagaaccccatcaacaacggcccctactg1620C犯CCCCt3CaacatcaccgacctctcccagggcaccgtctgC3gtgCggCC3gglg8Ct31680cgactcggtcaccgatgatcccgatcacgccgtctatggc幼taacatcgagttctacgg1740caccttcacccccga^caatgcggccatcgcccagggcaagctgaccccctcccagcaggg1800gttcgtcacggaacagctgcgcctgtacagcgccgatgcc幼ccgcaccgagctgtccgt1860gcaggtcatg犯ctattacaccgagcagcaggtgcccgtgctcacctcgctcgtccaaaa1920ctatgtcgttttcaaccattggcactcggatgtgcctggtgtacgaaccccccccttctt1980ccccttccccacctttcagctggcaacttgctaactcagattcagcccacc犯cccc犯c2040cgggctgccctcacctctggcacttcgtatggtcacgg幼ccaacgatgaggcctttgac2100aaccacgccttcccccagcgttccatcttcC鄉(xiāng)agCtgELccgagaccggccactcctgg2160atc犯ctactgggacacggctggtggcactggccccgatgccgagttctacaactggact2220tacacctccacaaggtc犯ggccctggaacagttctacacggatgccgca2280gccggtgccctgcctgaattcagctacgtcaacccctcgtgctgcggtgtcggcacc咖2340tcgatgcaccccagtggtctgatctccgacggcg柳agctgettc幼g幼cgtcteicgac2400gctctgcgcgccgggccccagtgg犯cgagaccctcttcatcctgagcttcgacgagacc2460ggtggcttcc3Cg3CC3tgtgcccccgcccctcgctccccggccggacaacctcacttac2520acggccaccaccccaagcggcgaggactscaccttcaactttaaccgtctgggtggtcgt2580atccccactctgctgatctccccctgggtcggc卿ggststgtcg3gc3犯agggcacc2640agcgtcaccggcgaaaccgtgtcttactccgcctcctcgatcctgcgcaccctgggctac2700CtCtggg3CtttgaccctttcaccccgcgggtcggLgtatgcgccatcctttgagcatctg2760gtgc卿cgcgggcccgcg3taac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