專利名稱：：一種阿魏酸酯酶a突變體及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因工程和酶工程
技術領域：
，具體涉及一種阿魏酸酯酶A突變體及其用途。
背景技術：
：阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)是能水解存在于植物細胞壁中的羥基肉桂酸類化合物、阿拉伯木聚糖與某些膠質之間的酯鍵，是半纖維素完全降解所需的關鍵酶之一。其中來源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A是目前研究最多的阿魏酸酯酶之一，人們對其在底物作用范圍，內源表達調控以及在畢赤酵母和大腸桿菌中表達方面作了大量研究。阿魏酸酯酶A在生物能源、飼料、造紙、保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有較大應用潛力。在酶的工業(yè)應用中，熱穩(wěn)定性是一個重要的參數。高穩(wěn)定性的酶高溫下反應可以提高反應速率和反應物的溶解量，減少酶投入量等，從而降低成本(L.Viikari,etal.ThermostableEnzymesinLignocelluloseHydrolysis.AdvBiochemEngBiotechnol108(2007)121-145)。蛋白質定向進化技術是體外改良蛋白質性質的重要手段，過去十年間人們成功地利用該技術改造了上百種蛋白質的性質(J.D.Bloom,F.H.Arnold.InthelightofdirectedevolutionPathwaysofadaptiveproteinevolution.PNAS106(2009)9995-10000)。同時，理性設計手段也廣泛應用于酶的改造中(VincentG.H.Eiisink，etal.Rationalengineeringofenzymestability.JBiotech113(2004)105—120)。目前生產上應用的阿魏酸酯酶主要來源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A，但是其熱穩(wěn)定性仍然不理想。應用現有技術，進一步改造阿魏酸酯酶A，提高其熱穩(wěn)定性，將推動該酶在相關領域的更廣泛應用。
發(fā)明內容本發(fā)明利用易錯PCR技術對來源于黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A進行分子改良，從而獲得熱穩(wěn)定性提高的阿魏酸酯酶A突變酶。為了達到以上目的，在前期已獲得的母本基礎上，經一輪易錯PCR對母本基因隨機突變，建立突變文庫，通過高通量篩選體系篩選出12個耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體位點，并通過全序列合成方法將這12個突變位點整合到一條編碼序列上，獲得組合突變體(命名為CV-FAEA)，其熱穩(wěn)定性得到很大提高。本發(fā)明通過如下方式來實現隨機突變文庫的構建和篩選我們已報道了黑曲霉(Aspergi1IusnigerCIB423.1)中克隆的編碼260個氨基酸殘基的阿魏酸酯酶A編碼序列(EMBLaccessionnumber:FJ430154)，并利用PoPMuSiC在線工具對其進行計算機輔助設計獲得了耐熱性提高了的阿魏酸酯酶A，暫命名為FAEA-D93G/S187F(見SEQIDNO.1)，該突變體作為下述基因操作的母本(S.-B.Zhang,andΖ._L.Wu,IdentificationofaminoacidresiduesresponsibleforincreasedthermostabilityofferuloylesteraseAfromAspergillusnigerusingthePoPMuSiCalgorithm.Bioresour.Technol.102(2011)2093-2096)。采取易錯PCR方法對編碼母本FAEA-D93G/S187F的基因進行隨機突變，以pPIC9K載體構建高效突變庫，再將含有突變基因的重組質粒轉入畢赤酵母(PichiapastorisKM71)中，挑取突變子單克隆以及母本對照菌株于96孔板中培養(yǎng)并誘導阿魏酸酯酶A表達。將酶表達后的菌液離心，取部分上清液以2-氯對硝基苯酚為底物，反應適當時間測定酶活。同時，另取相同體積的上清液熱處理一定時間，以相同的方法測定殘余酶活性。然后，將殘余活性高于對照的菌株轉接到新的96孔培養(yǎng)板中進行重復篩選。培養(yǎng)耐熱性提高的突變酶重組菌，提取其基因組，并用PCR技術獲得其相應的突變阿魏酸酯酶A的基因，送上海英駿生物技術公司測序。詳細方案見實施例2。經上述隨機突變庫構建和篩選，獲得了12個由單個氨基酸殘基的突變引起耐熱性有不同程度提高的阿魏酸酯酶A突變體，分別將其命名為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12，序列信息見SEQIDNO.3-N0.13，其特征如下Zl該酶的第177位的谷氨酰胺突變?yōu)榻z氨酸；DNA序列由CAG變?yōu)镃AT。Z2該酶的第63位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；DNA序列由ACC變?yōu)锳TC。Z3該酶的第140位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；DNA序列由GCA突變?yōu)锳CA。Z4該酶的第235位由半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸；DNA序列由TGT突變?yōu)锳GT。Z5該酶的第57位由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔籇NA序列由ACC突變?yōu)锳TC。Z6該酶的第178位由纈氨酸突變?yōu)楸彼?；DNA序列由GTC突變?yōu)镚CC。Z7該酶的第14位由亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?；DNA序列由TTA突變?yōu)門TC。Z8該酶的第163位由絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸；DNA序列由AGC突變?yōu)锳CC。Z9該酶的第37位由賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；DNA序列由AAA突變?yōu)棣ˇ肠?。ZlO該酶的第121位由谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸；DNA序列由CAG突變?yōu)镃AC。Zll該酶的第185位由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔籇NA序列由CAG突變?yōu)镃GG。Ζ12該酶的第35位由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；DNA序列由ACT突變?yōu)锳TT。12個位點的整合通過全序列基因合成整合以上12個突變位點，將合成的基因片段連入pGAPZαA載體并在畢赤酵母(PichiapastorisKM71)中表達(組合突變體阿魏酸酯酶A，命名為CV-FAEA，氨基酸序列見SEQIDNO.14)。母本和CV-FAEA純化后做耐熱性比較發(fā)現，與母本相比，整合了12個突變位點的突變體CV-FAEA的熱耐受性有了極大提高。如母本在55°C處理15分鐘時，其酶活性就喪失了一半，而CV-FAEA在55°C下處理4000分鐘后仍保持90%以上的酶活性。需要指出的是，C235S突變位點(Z4)在50-90°C溫度下處理一個小時能保持50%以上殘余活力，其對組合突變體CV-FAEA耐熱性提高有很大貢獻。阿魏酸酯酶A突變體耐熱性的顯著提高顯示了該酶在生物能源、飼料、造紙、保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)潛在的應用價值。圖1為母本阿魏酸酯酶A和組合突變體CV-FAEA的耐熱性比較。其中，··為母本阿魏酸酯酶A的酶活變化曲線；為組合突變型阿魏酸酯酶A的酶活變化曲線。T為溫度，Y為殘余酶活力。具體實施例方式以下結合實施實例對本發(fā)明做進一步說明，需要指出的是，本實施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍的限制。實施例1易錯PCR(error-pronePCR)方法構建阿魏酸酯酶文庫利用GeneMorphIIRandomMutagenesiskit對阿魏酸酯酶基因(見SEQIDNO.1)進行隨機突變。所用弓丨物為:faeA~F:5，-taggaggtgaattcgcctccacgcaaggcatctc-3，faeA-R:5，-taggaggtgcggccgcttaccaagtacaagctccgctcg-3，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30s，61°C退火Imin和72°C延伸lmin，共25個循環(huán)，電泳后回收基因片段。將回收片段用NotI和EcoRI雙酶切，與經過相同酶切的pGAPZαA載體(含有博萊霉素抗性基因)進行連接反應。雙酶切消化后的PGAPZαA載體和目的基因片段的摩爾量比13混合后，加入600個單位的T4連接酶，16°C連接過夜。然后將連接產物用酚/氯仿抽提兩次，離心，濃縮連接產物并用ddH20溶解后，電擊法轉入大腸桿菌DH5α，得到約5XIO4個克隆的一級突變庫。收集一級突變庫平板上的菌落培養(yǎng)2-3小時后提取質粒，用NotI和EcoRI雙酶切回收的目的片段，與經過相同酶切的PPIC9K載體(含有氨芐青霉素抗性基因)進行連接反應，連接產物濃縮、轉化等操作均和一級突變庫構建方法一致。最后得到約5XIO4個克隆的二級突變庫。實施例2阿魏酸酯酶突變體庫的篩選將實施例1中二級突變庫克隆收集后提取質粒并經PmeI內切酶線性化后，電擊轉化畢赤酵母(PichiapastorisKM71)感受態(tài)細胞并涂布MD平板(1.34%YNB，4X1(Γ5%生物素，2%葡萄糖)。培養(yǎng)2天后，挑取單克隆于96孔板，每孔含有150μ1BMGY培養(yǎng)基(含有l(wèi)OOmM、pH值6.0的磷酸鉀緩沖液，2%胰蛋白胨，酵母提取物，甘油，4x10_5%生物素)，30°C，280rpm，震蕩培養(yǎng)2天。用96孔板復制器復制各單克隆于MD固體培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)2天后存放于4°C冰箱中。離心96孔板培養(yǎng)物后移出上清液，并加入150μ1BMMY(培養(yǎng)基成分中除了用0.5%甲醇代替甘油外，其他成分和BMGY相同)，然后于30°C，280rpm搖床中震蕩培養(yǎng)36小時，誘導阿魏酸酯酶表達。離心，用排槍輕輕吸出96孔板各孔中的上清液，按相應位置分別加入20μ1上清液于兩塊96孔板中。一塊裝有20μ1上清液的96孔板加入180μ1反應液(0.85倍體積的含2.5%TritonX-100的100mM、pH6.4的磷酸鈉緩沖液和0.05倍體積的含有20mM2-氯對硝基苯酚底物的二甲基亞砜溶液混合而成)，40°C反應15min。另一塊裝有20μ1上清液的96板置于63°C烘箱，30min處理后迅速放置在4°C快速降溫。如上述反應以測定突變體殘余活性。殘余活性比母本殘余活性高的菌株挑到新的96孔培養(yǎng)板中進行重復篩選。篩選到27個突變體，殘余活性是母本對照的2-5倍不等(見表1)。培養(yǎng)這些突變酶重組菌，提取其基因組，并用PCR技術獲得其相應的突變阿魏酸酯酶基因，送上海英駿生物技術公司測序。對27個耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體編碼序列測序結果分析后，確定突變酶熱穩(wěn)定的提高是由12個氨基酸突變引起的。12個單點突變體分別命名為Z1、Z2、Z3、Α、Ζ5、Ζ6、Ζ7、Ζ8、Ζ9、Ζ10、Zll、Ζ12，其具體特征見本說明書
發(fā)明內容部分。實施例3阿魏酸酯酶突變位點的整合將以上獲得的12個突變位點整合到一條核苷酸編碼序列上并由上海生工生物技術服務有限公司合成全序列。為了方便后續(xù)蛋白純化，將合成的全序列用NotI和EcoRI雙酶切回收目的片段，連入經過相同酶切的PGAPZaA載體(含有博萊霉素抗性基因)中(連接方法如實施例1)。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，挑取轉化子培養(yǎng)并提取重組質粒。將質粒用BspHI內切酶線性化后，轉化畢赤酵母(PichiapastorisKM71)感受態(tài)細胞，涂布含有100yg/ml的博萊霉素的YPDS培養(yǎng)基(含有2%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖，IM山梨醇)中，30°C培養(yǎng)3天。挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基(除不含有IM山梨醇外，培養(yǎng)基成分與YPDS培養(yǎng)基相同)中培養(yǎng)2天以表達該組合突變體酶。實施例4母本和12個單點突變的阿魏酸酯酶A粗酶液的熱穩(wěn)定測定將表達母本和12個單點突變的阿魏酸酯酶A的單克隆分別挑到25ml的BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后離心棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體。0.5%甲醇誘導表達兩天后，取培養(yǎng)物上清于55°C溫度下分別測定母本和除Z4突變酶外的其他10個單點突變的阿魏酸酯酶A突變體的半失活時間(t1/2)；而Z4突變酶于90°C溫度下處理并測定其半失活時間(t1/2)。培養(yǎng)方法和酶活測定方法如實施例2。實驗結果見表1。表1母本阿魏酸酯酶A以及單點突變體t1/2測定權利要求1.一種阿魏酸酯酶A突變體，其特征在于以SEQIDNO.2所示的阿魏酸酯酶A氨基酸序列為基礎，經突變后具有以下突變位點的氨基酸序列將其第14位的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼峄?和第35位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第37位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第57位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第63位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第121位的谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或/和第140位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或/和第163位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸或/和第177位的谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或/和第178位的纈氨酸突變?yōu)楸彼峄?和第185位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼峄?和第235位的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。2.將權利要求書1所述的阿魏酸酯酶A突變體的基因連入PPIC9K或pGAPZαA載體，并在宿主菌PichiapastorisKM71中表達，獲得突變體酶蛋白。3.權利要求1所述的阿魏酸酯酶A突變體在半纖維素降解中的用途。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程和酶工程
技術領域：
，具體涉及一種阿魏酸酯酶A突變體及其用途。本發(fā)明利用易錯PCR對阿魏酸酯酶A母本基因隨機突變，構建隨機突變文庫，通過高通量篩選體系篩選出12個耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體位點，并通過全序列合成方法將這12個突變位點整合到一條編碼序列上，獲得組合突變體。該組合突變體比母本的熱穩(wěn)定性有極大提高，顯示出在生物能源、飼料、造紙、保健食品，醫(yī)藥等工業(yè)中潛在的應用價值。文檔編號C12N15/81GK102220299SQ20111010202公開日2011年10月19日申請日期2011年4月22日優(yōu)先權日2011年4月22日發(fā)明者劉艷,吳中柳,張帥兵,裴小瓊申請人:中國科學院成都生物研究所