專利名稱：識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用于識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法，該方法制得的電極可 應(yīng)用于細(xì)胞的電化學(xué)計(jì)數(shù)、細(xì)胞生長過程的電化學(xué)監(jiān)測，細(xì)胞的電化學(xué)研究 以及細(xì)胞的電化學(xué)識別等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
貼壁生長在電極上的細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的變化都會引起貼壁界面阻抗 的變化，Giaever等人根據(jù)細(xì)胞這一貼壁界面電特性設(shè)計(jì)了能實(shí)時(shí)、連續(xù)、定 量跟蹤哺乳動(dòng)物細(xì)胞形狀變化的細(xì)胞形狀分析傳感器。鑒于對有關(guān)哺乳動(dòng)物 胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的專門凈艮道很少，且在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法都存在 一定缺點(diǎn)，如①空氣晾干制片，缺點(diǎn)是不適合于大的嚢胚(如嵌合嚢胚)的計(jì) 數(shù)，因?yàn)檫@時(shí)的卵裂球不易擴(kuò)散。②熒光染色法，操作較為復(fù)雜，但是準(zhǔn)確、 應(yīng)用范圍廣，而且可以隨時(shí)鏡檢，減少胚胎的丟失。但須用熒光顯微鏡。③ 壓片法，這種方法先壓片后固定染色，易造成胚胎丟失，而且蓋玻片壓得過緊, 胚胎不易染色。④放射性元素標(biāo)記法，此法對胚胎卵裂球數(shù)目的增加有妨礙， 比正常胚胎至少降低一半。所以此方法應(yīng)用較少。而在食品發(fā)酵和制藥發(fā)酵 工業(yè)中，細(xì)菌總數(shù)是控制發(fā)酵程度的重要參數(shù)之一.在環(huán)境監(jiān)測和食品分析中， 細(xì)菌總數(shù)也是一個(gè)很重要的微生物學(xué)監(jiān)測指標(biāo).微生物及動(dòng)物活細(xì)胞的檢測， 通常采用菌落法、比濁法、鏡檢法、阻抗法等，這些方法大都繁瑣、費(fèi)時(shí)或誤 差較大，難于區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞，且不能在線監(jiān)測。識別微生物通常是基于 菌落法(使用選擇性培養(yǎng)基)或鏡檢法，也同樣需要非常麻煩和長時(shí)間的操 作。由于水中的病毒含量很低，加之環(huán)境水體中成份復(fù)雜，因而常規(guī)的方法檢 出率很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服上述方法中存在的大都繁瑣、費(fèi)時(shí)或誤差較大,難于區(qū)別 死細(xì)胞和活細(xì)胞，且不能在線監(jiān)測等問題，提供了一種識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法，該方法是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的以自制的石墨粉-環(huán)氧 樹脂固態(tài)碳糊為基礎(chǔ)電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以柏絲為對極的三電 極系統(tǒng)下，在-O. 45 ~ 1. 0V電位范圍內(nèi)置于含有苯胺的辟u酸溶液中，以50mV. s一1 進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊電極上，電化學(xué)聚合苯胺， 獲得聚苯胺修飾電極；再對獲得的聚苯胺修飾電極做電化學(xué)處理獲得識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極。 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn) (1)制備方法簡單易得，操作方便，實(shí)驗(yàn)條件溫和； (2 )獲得的聚苯胺薄膜修飾電極可逆吸附活細(xì)胞，而死細(xì)胞無響應(yīng)，可用于死-活細(xì)胞的識別和篩選分離； (3)電極的電化學(xué)信號與細(xì)胞數(shù)量呈正比，可用于活細(xì)胞的計(jì)數(shù)； (4 )由于電極對活細(xì)胞的可逆吸附，可用于細(xì)胞生長或使用過程的實(shí) 時(shí)監(jiān)測.


圖1在修飾后的電極上加不同電位電解陳化所得循環(huán)伏安圖； 圖2細(xì)胞在電極上的可逆吸附的循環(huán)伏安圖其中實(shí)線為基底曲線;虛線為吸附活細(xì)胞后曲線； 圖3電;f及對死細(xì)月包和活細(xì)^^的不同循環(huán)伏安響應(yīng)其中實(shí)線為基底曲線;虛線為吸附活細(xì)胞后曲線； 圖4氧化峰電流與細(xì)胞濃度的線性關(guān)系。
具體實(shí)施例方式識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法，是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的以 自制的石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊為基礎(chǔ)電極，以飽和甘汞電極為參比電極， 以鉑絲為對極的三電極系統(tǒng)下，在-O. 45 ~ 1. 0V電位范圍內(nèi)置于含有苯胺的硫 酸溶液中，以50mV. s—1進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊電極上，電化學(xué)聚合苯胺，獲得聚苯胺修飾電極；再對獲得的聚苯胺修飾電極做 電化學(xué)處理獲得識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極。所述以石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊基礎(chǔ)電極，是按石墨粉環(huán)氧樹脂聚 酰胺樹脂=8: 3: 1. 5的比例混合后調(diào)勻；將銅線裝入磨好的玻璃管內(nèi)，使銅 線端頭距管底端4一5mm，從管底部向管內(nèi)壓入調(diào)好的石墨糊，壓實(shí)，置于玻 璃板上晾干，分別用240目、800目、1000目砂紙及硫酸紙磨電極，用環(huán)氧 樹脂固定電極引線，使用前超聲洗滌2-5次，每次l-3min,保證電極表面清 潔。所述含有苯胺的硫酸溶液采用10 mL的1. 0 mol. L—'硫酸水溶液與10 mLO. 5 mol. IZ'苯胺混合。所述對獲得的聚苯胺修飾電極做電化學(xué)處理，即在O. 70恒電位下電解100 秒后，取出電極，用超純水清洗電極.置于0.1 mol.l/i的磷酸緩沖溶液中做基 底實(shí)驗(yàn)，連續(xù)兩次掃描，獲得重合的循環(huán)伏安曲線.實(shí)施例將石墨粉與環(huán)氧樹脂聚和酰胺樹脂按照重量比為8: 3: 1.5的比例混合 調(diào)勻，填入打磨好的玻璃管中，從另一端插入銅線，銅線距管底端4一5mm, 放置在陰涼干燥處晾干，分別用240目、800目、1000目砂紙打磨平整，并 在硫酸紙上打磨呈鏡面。石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)電極，使用前經(jīng)超聲洗滌一次， 約2min，保證電極表面清潔后備用。將制好的石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)電極置于10 mL的0. 5mol.L—^危酸水溶液 與10 mLO. 5mol.L—'苯胺混合，通入高純氮?dú)獬鹾螅陲柡透使姌O為參比電 極，鉑絲為對極，自制的石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊電極為工作電極的三電極 系統(tǒng)下，在-0. 45 ~ 1. 0V電位范圍內(nèi)，以50mV. s—'進(jìn)^f亍循環(huán)伏安掃描，直至循環(huán) 伏安曲線上不出現(xiàn)峰為止.此時(shí)聚苯胺膜均勻，膜薄而致密，顏色呈淡黃色； 將所得電極用去離子水清洗后，置于0. lmol.L—〗的磷酸緩沖溶液中，在0.70V 電位下氧化電解100秒，后進(jìn)行循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)，參看圖1，兩圈掃描，曲線完 全重合。將制得的聚苯胺修飾電極置于0.1 mol.L—1的磷酸緩沖液中作基底實(shí)驗(yàn)后，浸入細(xì)胞所在培養(yǎng)液中，十分鐘后取出，放回到磷酸緩沖液中作循環(huán)伏安掃描，所得的循環(huán)伏安圖，參看圖2,吸附細(xì)胞后的電極在第一圏掃描中獲 得的伏安曲線在0.45伏處有一不可逆氧化峰，而在第二圏掃描時(shí)，伏安曲線 與基底完全一致。此結(jié)果表明，氧化峰是吸附細(xì)胞的脫附峰，吸附是可逆的，吸 附的細(xì)胞可以在電位掃描過程中脫附.將電極置于含有死細(xì)胞的溶液中吸附10分鐘后，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，獲得 的循環(huán)伏安曲線，O. 45伏處的氧化峰沒有出現(xiàn)，參看圖3，表明該電極具有識 別死-活細(xì)胞的功能.將細(xì)胞溶液進(jìn)行稀釋后，在相同的吸附時(shí)間下的氧化峰電流與細(xì)胞的含 量呈線性關(guān)系，參看圖4,表明該電極可以進(jìn)行細(xì)胞的電化學(xué)計(jì)數(shù).
權(quán)利要求
1、識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法，是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的以自制的石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊為基礎(chǔ)電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲為對極的三電極系統(tǒng)下，在-0.45～1.0V電位范圍內(nèi)置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s-1進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊電極上，電化學(xué)聚合苯胺，獲得聚苯胺修飾電極；再對獲得的聚苯胺修飾電極做電化學(xué)處理獲得識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法， 其特征在于所述以石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊基礎(chǔ)電極，是按石墨粉環(huán)氧 樹脂聚酰胺樹脂=8: 3: 1.5的比例混合后調(diào)勻；將銅線裝入磨好的玻璃管 內(nèi)，使銅線端頭距管底端4 —5mm,從管底部向管內(nèi)壓入調(diào)好的石墨糊，壓實(shí)， 置于玻璃板上晾干，分別用240目、800目、1000目砂紙及硫酸紙磨電極， 用環(huán)氧樹脂固定電極引線，使用前超聲洗滌2 5次，每次l-3min,保證電極 表面清潔。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法， 其特征在于所述含有苯胺的硫酸溶液采用10 mL的1. 0 mol.I/'硫酸水溶液 與10 mL 0.5 mol.L—'苯胺混合。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法， 其特征在于所述對獲得的聚苯胺修飾電極做電化學(xué)處理，即在0.70恒電位 下電解100秒后，取出電極，用超純水清洗電極.置于0. 1 mol. L—i的磷酸緩沖溶 液中做基底實(shí)驗(yàn)，連續(xù)兩次掃描，獲得重合的循環(huán)伏安曲線.
全文摘要
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有方法中存在的繁瑣、費(fèi)時(shí)或誤差較大，難于區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞，且不能在線監(jiān)測等問題，提供了一種識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極的制備方法，該方法是按下述步驟實(shí)現(xiàn)的以自制的石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊為基礎(chǔ)電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以鉑絲為對極的三電極系統(tǒng)下，在-0.45～1.0V電位范圍內(nèi)置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s^-1進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在石墨粉-環(huán)氧樹脂固態(tài)碳糊電極上，電化學(xué)聚合苯胺，獲得聚苯胺修飾電極；再對獲得的聚苯胺修飾電極做電化學(xué)處理獲得識別死-活細(xì)胞的聚苯胺修飾電極。優(yōu)點(diǎn)制備方法簡單易得，操作方便，實(shí)驗(yàn)條件溫和；獲得的修飾電極可用于死-活細(xì)胞的識別和篩選分離；可用于活細(xì)胞的計(jì)數(shù)；由于電極對活細(xì)胞的可逆吸附，可用于細(xì)胞生長或使用過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。
文檔編號G01N27/327GK101216449SQ200810010070
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者朱永春, 計(jì)紅果 申請人:沈陽師范大學(xué)